专利名称：检测t细胞微小rna150相对含量反映个体免疫状态的技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别 是涉及荧光定量的聚合酶链反应Ο -PCR)。通过微小RNA150(microRNA-150，miR-150)相 对含量反映个体的T细胞免疫状态。在茎环引物3’端引入8个特异性核苷酸序列可以逆 转录miR-150，并通过Q-PCR技术对miR-150进行扩增。在与U6非编码RNA的含量进行比 较后，得出miR-150的相对含量。miR-150的相对含量可反映个体T细胞免疫状态。此方法 可在72小时内对个体T细胞免疫状态进行评估，而且可以通过分选技术对不同的T细胞类 型进行分析，达到更准确的评估效果。优化实验条件后，构建简单、准确的miR-150的相对 定量检测试剂盒。
背景技术：
microRNAs是机体对mRNA翻译出蛋白质的调节分子之一，成熟的microRNAs具有 这种调节功能。microRNAs在细胞发育、肿瘤的发生、疾病进展等重要的生理、病理过程发挥 了重要的作用。静止与激活的T细胞中microRNAs表达谱也不同，表现出显著的表达差异。 microRNAs差异表达在T细胞的发育、免疫性疾病进展、免疫抑制等生理、病理过程中发挥 了重要的影响作用。microRNAs的检测有可能成为诊断、治疗和预后判断的靶分子，在恶性 肿瘤、免疫性疾病和病原体感染等常见疾病的病理过程和分子机制中有突出的研究价值。评价个体免疫状态主要依赖以T细胞功能检测为基本的生物技术，但是目前各种 检测方法都有明显缺陷，临床实验室主要通过检测淋巴细胞的比例来完成，突出的缺陷是 不能反映老年人、免疫抑制药物治疗患者的免疫状态。国外开发出一种immimknow的检测 方法，主要检测T细胞受刺激后ATP生成数量来评价免疫抑制治疗患者的免疫抑制程度，需 要花费时间15-18小时的体外培养，而且需要特殊的仪器设备检测细胞ATP含量。总体来 说，T细胞功能检测存在实验时间长、无法标准化、需要特殊仪器、价格昂贵等情况。通过建 立开放的荧光定量PCR技术平台，结合创新的non-coding RNA检测方案，开发全新的检测 方法。此方法依靠PCR技术的高灵敏性和荧光定量的效果，同时T细胞受刺激后non-coding RNA可以在细胞内快速生成，将整个实验的时间缩短为72小时，并可通过荧光定量PCR进行 量化评分达到评价免疫状态的效果。T细胞作为评价免疫状态的关键细胞，是各种免疫评价指标检测的主要对象。通 过全血培养系统可以明显缩短标本处理时间，在刺激培养的时间内，通过磁珠阳选CD4+的 T细胞，快速分离目的细胞并完成总RNA或短片段RNA的提取，并于荧光PCR仪器上进行检 测。总结以上过程可以发现此方法可以有效的缩短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可 开放使用。对个体免疫功能研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。但是成 熟microRNAs仅有21-23个碱基片段，很难采用常规的核酸扩增技术进行表达差异分析和 定量检测。通过芯片技术可以区分拷贝数大的microRNAs表达差异，但是需要大量的标本 提取RNA。Q-PCR技术可以定量检测低拷贝的核酸片段，首先通过茎环引物对miR-150进行 逆转录成cDNA，再通过Q-PCR进行相对定量。
目前，还未开发出准确、快速、简单、费用低廉的个体免疫状态评价技术。本发明基 于Q-PCR技术，通过茎环引物3’端引入8个特异性核苷酸，可以逆转录miR-150，并通过一 套引物进行Q-PCR分析，进行相对定量的检测，解决目前个体免疫状态评价的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是克服现有免疫诊断技术和分子诊断技术中对个体免疫状态评价 技术存在的不足，包括分析耗时长、不能高通量、对标本要求高等缺陷。提供了一种检测 miR-150相对含量的技术，可反映个体免疫状态。miR-150茎环引物在3’端引入8个特异 性核苷酸，可以逆转录成熟的miR-150，并通过茎环引物引入通用引物进行Q-PCR分析，对 miR-150的差异表达进行相对定量的检测。茎环引物包含来源于水稻序列，为SEQ ID NO. 1, 其3’端含有8个针对miR-150的特异性核苷酸序列；及用于对miR-150进行相对定量的一 对引物，miR-150特异性引物SEQ ID NO. 2，5，端有带尾的结构，其3，端针对miR-150的18 个特异性序列；用于Q-PCR的对侧引物由茎环引物内包含一个高质量的引物位置为SEQ ID NO. 3。本发明第二个目的是提供一套配套miR-150检测的引物，为对内对照目的基因U6 进行定量检测的三条引物，包括SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3。SEQ ID NO. 4为 逆转录U6的引物，其特征是茎环引物3，端带9个与U6的5’端特异性互补的核酸序列。U6 特异性引物SEQ ID N0. 5，其含TO的特异性序列。用于Q-PCR的对侧引物由茎环引物内包 含一个高质量的引物位置为SEQ ID N0. 3。本发明第三个目的是提供一种用于miR150相对定量检测的试剂盒。试剂A :5μΜ 逆转录miR-150、U6的茎环引物混合液50 μ L ；试剂B :20υ/μ L M-MuLV逆转录酶，50 μ L ； 试剂C:5X逆转录缓冲液，200yL含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 浓度为 250mM，KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM，50nM DTT。试剂 D :2 μ M 通用引物100 μ L ；试剂E :2yMmiR-150特异性引物100 μ L ；试剂F :2μΜ U6特异性引物 100 μ L ；试剂G :5U/y LTaq DNA聚合酶，20 μ L ；试剂H :2 XPCR缓冲液组成，包含600ηΜ R0X, 1 X SYBR Green I dye, 2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl, 80mM KCl、40mM (NH4) 2S04、6mM MgSO4。本发明第四个目的是提供一种用于miR150相对定量检测的评分表，由下述评分 组成；评分ι :τ细胞免疫状态过激；评分2 :Τ细胞免疫状态正常；评分3 :Τ细胞免疫状态抑 制；评分4 =T细胞免疫状态过度抑制。本发明的技术方案概述如下一套用于对miR-150核苷酸片段进行相对定量检测的引物，及配套此检测的一套 检测TO内对照的引物。包括一条3’端引入8个针对miR-150互补核苷酸序列的茎环引物 SEQ ID NO. 1 ；一对扩增 miR-150 的引物 SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 3 ；一条 3，端引入 9 个针 对U6互补核苷酸序列的茎环引物SEQ ID N0. 4 ；一对扩增U6的引物SEQ ID N0. 5、SEQ ID NO. 3。一种对miR150进行相对定量的一套试剂盒，其特征包括1，由下述试剂组成试剂A :5 μ M逆转录miR-150、U6的茎环引物混合液50 μ L ；试剂B :20U/ μ L M-MuLV 逆转录酶，50 μ L ；
试剂C :5X逆转录缓冲液，200 μ L含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)，Tris-HCl 浓度为 250mM，KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM，50nM DTT。试齐[JD:2μΜ 通用引物 100μ L ；试齐[JE :2 μ M miR-150 特异性引物 100 μ L ；试剂F :2 μ M U6特异性引物100 μ L ；试剂G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ；试剂H :2XPCR 缓冲液组成，包含 600nM ROX, IX SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM (NH4)2 SO4、6mM MgSO40一种对miR150相对定量进行评估的评分表，由下述评分组成评分1 :T细胞免疫状态过激；评分2 =T细胞免疫状态正常；评分3 =T细胞免疫状 态抑制；评分4 =T细胞免疫状态过度抑制。本发明优点T细胞作为评价免疫状态的关键细胞，是各种方法检测的主要对象。已经表明T细 胞活化过程中出现新的物质的合成，其顺序为non-coding RNA合成-mRNA合成-蛋白质合 成-DNA合成。目前各种方法的检测时间均为在蛋白质合成或DNA合成阶段，本发明能够建 立在mi croRNA的技术平台，不仅可以缩短实验时间，同时可以提高开放性仪器的使用率， 减少经济费用、提供一个全新的检测标准和评估体系。通过全血培养系统可以明显缩短标 本处理时间，在刺激培养的时间内，可通过磁珠阳选CD4+的T细胞，快速分离目的细胞并完 成总RNA提取，并于荧光PCR仪器上进行检测。总结以上过程可以发现此方法可以有效的缩 短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可开放使用。通过优化实验反应体系和反应条件， 组成检测灵敏、方便的试剂盒，为个体免疫状态的评估提供可靠的检测技术。
图1为miR-150的检测效果(左1为刺激培养72小时U6结果、左2为未刺激培 养U6结果、左3为未刺激培养的miR-150结果、右1为刺激培养72小时miR-150结果)。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1首先，用肝素润湿注射针筒后，常规取静脉血约:3ml，转动针筒混勻血液。在超净 工作台中加全血到培养瓶中(含20%血清的1640培养液5ml，PHA 5mg, pH7. 2)，加入全血 0. 5ml (7号针头13 15滴)，盖紧胶塞，轻轻摇勻。将培养瓶放在37°C恒温培养箱内培养 5、8、16、24、72小时。分别将未培养和培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后IOOOrpm离 心5min，去上清液留下Iml，充分混勻。加入混勻后的T细胞磁珠25 μ L，反复颠倒2_3次，使 磁性微珠分散开。在室温轻轻的旋转3分钟，让微珠附着到T细胞上(不要超过4分钟)。 可以使用一种颠倒的装置或手动混勻。放到磁力架上3分钟，用移液管移去上清液，移离磁 力架。加Ι-aiilPBS清洗细胞。轻击管子使微珠散开，再次将管子放到磁力架上1分钟，移 弃上清液。重复洗两次后，直接加入Iml Trizol，振荡器振荡或移液器吸打数次混勻，放置 5min。加入氯仿200，剧烈混勻，静置5分钟。12000rpm离心10分钟后，取上层液体500 μ L，加入500 μ L异丙醇-20度放置2小时。12000rpm离心15分钟后，弃上清液。用75%乙醇 洗涤，12000rpm离心15分钟后，弃上清液。重复洗2次后，室温下放置10分钟，加入DEPC 处理的水30 μ L。充分溶解，-80度保存。实施例2一种配套此方法检测miR-150的逆转录操作程序。20 μ L体系中含2 μ L mRNA(0. 5pg-l μ g)，miR-150、U6的茎环引物混合液试剂A 2 μ L(终浓度为500ηΜ)，逆转 录缓冲液试剂B 4 μ L(终浓度dNTP为ImM，M-MuLV逆转录酶浓度为40U，Tris-HCl浓度 为50mM，KCl浓度为50mM，MgCl2浓度为4mM)，加水12 μ L。逆转录程序为冰上放置5min， 15°C 15min,30°C 15min，95°C 5min。逆转录完成后，试管内加入180 μ L水，进行10倍的稀 释。实施例3一种检测miR-150的Q-PCR方法，及操作过程和反应程序。每个标本需要进行 2个重复管的miR-150检测和2个重复管的U6检测，共4个反应管，每反应管反应系为 10 μ L-50 μ L。在10 μ L Q-PCR体系中，首先加入1 μ L稀释后的cDNA和1 μ L特异性引物 (终浓度200ηΜ)。其他试剂混合后共同加入，其中通用引物4μ L(终浓度200nM)，Q-PCR缓 冲液 20μ L(终浓度为 300nM R0X，0. 5X SYBR Green I dye, ImM dNTPs,40mM Tris-HCl, 40mM KCl，20mM (NH4) 2S04, 3mM MgSO4)，Taq 酶 0. 4 μ L (终浓度 0. 05U/ μ L)，加入水 8 μ L。混 勻试剂后，每孔加入8 μ L混合试剂，盖上盖子在ABI 7500上进行检测。对cDNA扩增及定量 程序如下95°C预变性:3min后；进行40-50个循环，95°C变性kec，62°C退火延伸35sec (此 步骤采集荧光值)。通过常规方法对各PCR管的Ct值进行分析，经与内对照进行比较后得 出结果ο实施例4用于miR150相对定量检测的评分表，由下述评分组成。评分1 :miR150相对含量在48小时前下降到初始含量的10%以下，定义为T细胞 免疫状态过激；评分2 :miR150相对含量在72小时时下降到初始含量的10%以下，定义为T细胞
免疫状态正常；评分3 :miR150相对含量在72小时时下降到初始含量的10%到50%之间，定义为 T细胞免疫状态抑制；评分4 :miR150相对含量在72小时时未下降到初始含量的50%以下，定义为T细 胞免疫状态过度抑制。
权利要求
1.一条用于微小RNA(microRNA，miR) 150相对定量的引物，其特征是一条茎环引物， 3，端带8个与micrORNA150的5，端特异性互补的核酸序列SEQ ID NO. 1，可用于逆转录 miR-150。
2.根据权利要求1所述的用于对miR-150进行相对定量的一对引物，miR-150特异性 引物SEQ ID N0.2，5’端有带尾的结构，其3’端与miR-150的5’端18个特异性序列相同; 用于Q-PCR的对侧引物由茎环引物内包含一个高质量的引物位置为SEQ ID NO. 3。
3.根据权利要求1所述的用于对miR-150进行相对定量而配套的，对内对照基因非编 码 RNA (non-coding RNA) U6 进行检测的三条引物，包括 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3。SEQ ID NO. 4为逆转录TO的引物，其特征是茎环引物3，端带9个与TO的5，端特异 性互补的核酸序列。TO特异性引物SEQ ID NO. 5，其5，端有带尾的结构，其3，端针对TO 的特异性序列。用于Q-PCR的对侧引物由茎环引物内包含的一个高质量的引物位置，序列 为 SEQ ID NO. 3。
4.根据权利要求1所述的对miR150进行相对定量的一套试剂盒，其特征包括1，由下 述试剂组成试剂A :5 μ M逆转录miR-150、U6的茎环引物混合液50 μ L ；试剂 B :20U/ μ L M-MuLV 逆转录酶，50 μ L ；试剂C :5Χ逆转录缓冲液，200 μ L含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)， Tris-HCl 浓度为 250mM，KCl 浓度为 250mM，MgCl2 浓度为 20mM，50nM DTT。试齐[J D :2 μ M通用引物IOOyL ；试剂E :2 μ M miR-150特异性引物100 μ L ；试剂F :2 μ M U6特异性引物100 μ L ；试剂 G :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ；试剂 H :2XPCR 缓冲液组成，包含 600nM R0X, 1 X SYBR Green I dye,2mM dNTPs (包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris_HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO40
5.根据权利要求1所述的对miR150进行相对定量的一张评分表，其特征包括1，由下 述评分组成评分ι :τ细胞免疫状态过激；评分2 =T细胞免疫状态正常；评分3 =T细胞免疫状态抑 制；评分4 =T细胞免疫状态过度抑制。
全文摘要
本发明公开了可用于对微小RNA150核苷酸片段进行相对定量检测的一条茎环引物和多条配套扩增的引物、试剂盒和评价表。试剂盒包括试剂A5μM逆转录miR-150、U6的茎环引物混合液50μL；试剂B20U/μL M-MuLV逆转录酶，50μL；试剂C5×逆转录缓冲液，200μL含dNTP浓度为5mM(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，Tris-HCl浓度为250mM，KCl浓度为250mM，MgCl2浓度为20mM，50nM DTT。试剂D2μM通用引物100μL；试剂E2μM miR-150特异性引物100μL；试剂F2μM U6特异性引物100μL；试剂G5U/μL Taq DNA聚合酶，20μL；试剂H2×PCR缓冲液组成，包含600nM ROX，1×SYBR Green I dye，2mM dNTPs(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2SO4、6mM MgSO4。本发明所提供的整套试剂盒可对不同类型T细胞的微小RNA150核苷酸片段进行相对定量分析，并对个体免疫状态进行评估。
文档编号C12Q1/68GK102134592SQ201010601970
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者周蒙滔, 杨丽红, 潘晓东, 陈必成 申请人:周蒙滔, 杨丽红, 陈必成