专利名称：重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用。
背景技术：
酵母双杂交技术(yeast two hybrid)是利用酵母遗传学方法分析蛋白质间的相 互作用的实验系统，常用于验证已知蛋白质间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选 蛋白。酵母双杂交技术已广泛应用于细胞周期调控、信号转导、肿瘤基因表达、药代动力学 等多个研究领域。Fields和Song首先在研究真核基因转录调控中建立了酵母双杂交系统，该系统 基于对酵母转录因子GAL4的完整认识，它具有两个功能相对独立的域DNA结合域(DNA binding domain, BD)和转录激活域(activation domain，AD)，BD 能够识别 GAL4 效应基因 (GAL4-responsive gene)白勺上坊字激夕舌序歹[J (upstream activatingsequence, UAS)，并与之 结合。而AD则通过与转录机器(transcription machinery)中的其他成分之间的作用，启 动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独作用均不能激活转录反应。而当两者在空间上 接近后，不需要形成共价键即可激活转录。这便构成双杂交体系的基础。在经典的酵母双杂交系统中，将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达 载体的GAL4-AD和GAL4-BD的下游，进行融合表达，分析蛋白互作。具体来说，X和Y为两 个未知相互作用的蛋白，将DB-X的融合蛋白称作诱饵(bait)，X通常是已知蛋白，AD-Y称 作猎物(prey)，如果bait与prey能够在宿主细胞核内同时表达，则BD和AD形成转录激活 复合物，从而激活手报告基因的表达。该基因的表达可以通过生化或遗传学的方法检测得 到，即可实现对于蛋白质(X和Y)间相互作用的研究。作为研究分析蛋白质与蛋白质之间 相互作用的体系，酵母双杂交的最大的优势在于不需要分离纯化蛋白质。同时，由于酵母生 长速度快、易于操作，该系统兼具了简便有效的特点。目前酵母双杂交体系常用的报告基因有LacZ和营养缺陷型标记如His等，前者可 以通过ONPG (或其他底物)存在时的颜色反应筛选阳性克隆，后者则根据筛选培养基上的 生长与否判断。但作为一种检测方法，营养缺陷标记作为报告基因无法对蛋白互作进行相 对定量。而LacZ的检测通常需要破碎细胞，温浴显色等步骤，操作繁琐、耗时耗力。这些缺 点已成为双杂交酵母高通量、快速检测蛋白互作的障碍。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种融合基因。本发明所提供的融合基因，由序列表中序列5第9到1030位核苷酸所示的DNA片 段、报告基因、终止子、筛选标记蛋白表达盒和序列表中序列5第4336到52 位核苷酸所 示的DNA片段依次连接构成的融合基因。所述终止子的核苷酸序列为序列表中序列5第观03到3130位所示；所述报告基因为荧光素酶报告基因；
所述筛选标记蛋白表达盒为HIS Box表达盒。所述荧光素酶报告基因的核苷酸序列如序列表中序列5第1063到2715位所示；所述HIS Box表达盒的核苷酸序列为序列表中序列5第3152到43 位所示。所述融合基因为序列表中序列5第9到52 位所示的DNA分子。含有所述融合基因的重组质粒也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种重组酵母菌。本发明所提供的重组酵母菌，是将所述融合基因导入宿主酵母菌得到的；所述宿 主酵母菌为缺失GAL4基因和GAL80基因的酵母菌。所述宿主酵母菌为酵母菌Y187。本发明的又一个目的是提供检测所述重组酵母菌中荧光素酶活性的方法。本发明所提供的检测所述重组酵母菌中荧光素酶活性的方法，包括以下步骤(1)使权利要求6或7所述的重组酵母菌中荧光素酶表达，得到荧光素酶表达的重 组酵母菌；(2)将步骤⑴得到的所述重组酵母菌进行震荡培养，至菌液的OD6tltl值为0. 4-1. 5 或0. 4或1. 0或1. 5，得到的菌液为待测菌液；培养容器内的所有物质记作菌液；(3)将荧光素酶底物溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中得到荧光素酶底物溶液， 将得到的荧光素酶底物溶液与所述待测菌液混合，得到混合物，检测混合物的荧光值，即得 到所述荧光素酶活性。所述震荡培养是在温度为30°C和转速为200rpm的条件下进行，旋转半径为 1. 3cm ；所述震荡培养的培养基为营养缺陷型SD培养基。所述待测菌液与所述荧光素酶底物溶液的体积比为1 2-2 1或1 2或1 1 或2 1 ；所述荧光素酶底物溶液的浓度为0. OlmM ；所述荧光素酶底物为D-荧光素；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0. lmol/L和pH值为3. 0。所述重组酵母菌在检测蛋白质间相互作用中的应用也属于本发明的保护范围。本发明所提供的重组荧光酵母可用于快速检测蛋白质间的相互作用。
图1为不同D-Iuciferin浓度下待测菌液的荧光检测结果。图2为重组酵母菌的生长曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、构建重组荧光酵母及其功能验证一、构建重组荧光酵母1、构建融合基因(1)融合基因中各DNA片段的获得
A、GAL1全启动子区片段的获得以酵母菌株Y187(购自Clontech公司)基因组DNA为模板，设计特异引物进行 PCR,获得在LacZ上游获得涵盖GAL1UAS和GAL1TATA序列的全启动子区，具体方法如下设计引物序列如下GAL-UP-NotI 5' -AGCGGCCGCCGACAGTTCCCAAAATG-3‘，GAL-UP-Hind 5' -TAAGCTTTATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3‘。以酵母菌株Υ187基因组DNA为模板，PCR反应条件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分钟30个循环，最后72°C延伸5分钟。经测序验证，PCR扩增反应获得的DNA片段序列为序列表中序列1。序列表中序 列1的第591位-第708位为GAL1UAS序列；序列表中序列1的第IOM位-第1030位为 GALITATA序列。将序列表中序列1第1位-第1030位的片段命名为GALlUAS-GALlTATA。B、LacZ-C端片断的获得设计引物序列如下LacZ-F2283B 5' -AGGATCCCTGACCACCAGCGAAATG-3‘，LacZ-R3167S 5' -AGTCGACGCGAAATACGGGCAGACAT-3‘，以酵母菌株Y187基因组DNA为模板，PCR反应条件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分钟30个循环，最后72°C延伸5分钟。经测序验证，PCR扩增反应获得的DNA片段序列为序列表中序列2，序列表中序列 2的第7位-第897位为LacZ⑶S序列中靠近C端的部分片段，将该LacZ⑶S序列的DNA 片段命名为LacZ-C。C、HIS Box基因表达盒的获得设计引物序列如下HisBox-EcoR-UP 5' -AGAATTCATTCCCGTTTTAAGAGCTTG-3‘，HisBox-BamHI-Dff 5' -AGGATCCTCGAGTTCAAGAGAAAAAAAAAGAAAAAGC-3'。以质粒pEG202 (购自Molecular Biotechnology)为模板，PCR反应条件如下94 "C 30 秒56°C30 秒
72 "C 1 分钟30个循环，最后72°C延伸5分钟。经测序验证，PCR扩增反应获得的DNA片段序列为序列表中序列3的第7位-第 1184位为HIS Box序列。D、ADH终止子的获得设计引物序列如下TADH-BamH-UP 5' -AGGATCCTGACTAGAATTAATGCCCA-3‘，TADH-EcoR-Dff 5' -AGAATTCATTAGGTCCCTCGCACAT-3‘。以酵母菌株Y187基因组DNA为模板，PCR反应条件如下94 "C 30 秒56 "C 30 秒72 "C 1 分钟30个循环，最后72 °C延伸5分钟。经测序验证，PCR扩增反应获得的DNA片段序列为序列表中序列4，序列表中序列 4的第81位-第408位为ADHl terminator序列，将该ADHl terminator序列DNA片段命 名为TADH。(2) GAL1UAS-GAL1TATA 与 Luc 编码区相连Luc编码区片段直接从pGL3_Basic质粒(购自Promega公司)用HindIII/Xbal 酶切获得。反应体系如下pGL3-Basic2ul (lug/ul)IOX 多功能 Buffer 2ulHindIIIIul(lOu/ul)XbaIIul (lOu/ul)ddH2014ul37 °C4h电泳分离上述得到的约1. 6kb片断，将其插入到pBlue-SK载体(购自泛基诺科技 有限公司，产品目录号为PYB808)的Hindlll/Spel位点，连接体系如下DNA 片断2ul (Iug)载体DNAIul (0. 2ug)IOXligation Buffer IulLigaseIulddH205ul16 °C连接过夜。取5ul连接反应液，加感受态细菌JM109(购自宝生物，产品目录号为 D9052) IOOul，置于冰上20min，42°C热休克2min，加LB Iml培养30min后涂布LB+Amp平板。0105]挑起单克隆用引物特异性PCR鉴定，阳性克隆在1.61Λ处出现明显条带。将得到 的重组载体命名为pBlue-SK-Luc。
0106]将上述步骤(1)得到的DNA片段GAL1UAS-GAL1TATA插入到重组载体 pBlue-SK-Luc 的 Notl/Hindlll 位点，
0107]连接体系如下
0108]DNA 片断2ul (Iug)
0109]载体DNAIul (0. 2ug)
0110]IOXligation Buffer Iul
0111]LigaseIul
0112]ddH205ul
0113]16 °C连接过夜。
0114]取5ul连接反应液，加感受态细菌JM109100ul，置于冰上20min，42°C热休克2min， 加LB Iml培养30min后涂布LB+Amp平板。
0115]挑起单克隆用引物特异性PCR鉴定，阳性克隆在1.31Λ处出现明显条带。将得到 的重组载体命名为 pBlue-SK-GALlUAS-GALlTATA-Luc。
0116](3)将HIS Box表达盒与LacZ-C端序列片段相连
0117]将HIS Box表达盒和LacZ-C端序列片段分别使用SmaI酶切，获得带有相同粘性 末端的片段。
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
反应体系如下
DNA 片段2ul (lug/ul)
IOX 多功能 Buffer2ul
SmaIIul(10u/ul)
(MH2O15ul
37 °C4h
将上述得到的片段进行连接。 连接体系如下 DNA片段 载体DNA
10X ligation Buffer Ligase
ddH20
2ul(lug) Iul (0. 2ug) Iul Iul 5ul
16 °C连接过夜
0132]得到HIS-LacZ-C片段，将该片段插入至Ij pBlue-SK-GALlUAS-GALlTATA-Luc 的 EcoRI/Sall 位点形成以下结构
0133]GALlUAS-GALlTATA-Luc-MCS-HIS-LacZ-C。
0134]连接体系如下
0135]DNA 片段2ul (Iug)
0136]载体DNAIul (0. 2ug)
0137]IOXligation Buffer Iul
体 载
组 ￡
5
LigaseIulddH205ul16 °C连接过夜 取5ul连接反应液，加感受态细菌JM109100ul，置于冰上20min，42°C热休克2min， 加LB Iml培养30min后涂布LB+Amp平板。挑起单克隆用引物特异性PCR鉴定，阳性克隆在2. Ikb处出现明显条带。(4)融合基因的获得将步骤(1)得到的TADH片段(BamHI/EcoRI)插入到上述步骤(3)得到的载体的 Luc与HIS之间，最终质粒含有的元件顺序如下=Notl-GALl-Luc-ADHterminator-HIS-Lac Z-C0分段测序拼接结果为序列表中序列5。序列表中序列5第9到1030位为GALl全启动 子区片段，其中，序列表中序列5第591位-第708位为GAL1UAS序列；序列表中序列5第 1024位-第1030位为GAL1TATA序列；序列表中序列5第1063位-第2715位为Luc CDS 序列；序列表中序列5第观03位-第3130位为TADH序列；序列表中序列5第3152位-第 4329位为HIS Box序列；序列表中序列5第4336位-第52 位为LacZ-C序列。2、构建重组酵母(1)分离纯化上述最终质粒，用Notl/Sall双酶切该质粒，得到GALl-Luc-ADHterm inator-HIS-LacZ-C片段，使用酵母转化试剂盒(泛基诺YGM011)转化酵母菌Y187。同时 用空载体pBlue-SK转化酵母菌Y187，得到转空载体对照酵母菌。(2)挑取单克隆在-His培养基中培养，挑取阳性克隆，提取阳性克隆的基因组 DNA。在GALl上游激活序列片段的远上游再合成一条引物进行阳性克隆鉴定。引物序列如 下GALl-far-up 5’ -CTCGTAGCATCACCATAGA-3 ’，用上述引物与Luc629R序列配对进行PCR鉴定Luc629R 5’ -AGAGCGACACCTTTAGGCAGA-3 ’。PCR鉴定结果显示阳性克隆出现1.71Λ条带的PCR产物，转空载体对照无此条带产生。(3)提取阳性克隆基因组DNA分段扩增局部区域片段测序证实，测序结果与设计 序列一致。最终构建的酵母基因型为MATa，ura 3_5，ade 2-101 trp 1-901, leu 2-3,112, gal4A , met-, gal80 Δ，URA: :GAL1UAS_GAL1TATA_Luc。该重组酵母以酵母菌株 Y187 为骨 架，Luc基因被整合到酵母染色体中GAL1UAS-GAL1TATA下游受其调控。与Y187相同，该酵 母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是的负调控因子)被缺失，从而排除了细胞内源 调控因子的影响。与Y187不同，该酵母具有HIS合成能力。该酵母基于GAL4系统，目前所 有已知的该系统质粒均可根据需要在该宿主内复制或表达。二、荧光双杂交酵母功能验证1、绘制生长曲线(1)阳性对照质粒的转化使用酵母转化试剂盒或LiAc法向重组荧光酵母中转化可表达完整GAL4蛋白的质 粒pCLl (购自Promega公司，产品目录号为K1604-1)。该蛋白为野生型GAL4蛋白，可激活 GAL4响应元件(UAS)，进而启动该元件下游报告基因的表达。pCLl通常作为GAL4双杂交系统的阳性对照质粒。在此用以检测重组荧光酵母基因组中GALIUAS-GALITATA-Luc片段生 物活性。(2)阳性克隆的筛选将转化后的菌液涂布于营养缺陷型固体SD平板(_Leu，-His)，30°C倒置培养1_2 天至单斑出现。(3)荧光检测方法I挑取具有Trp和His合成能力的酵母单斑，用营养缺陷型SD培养基(-LeU，-His) 进行震荡培养(30°C，200rpm，旋转半径为1. !Bern)，至菌液的OD6tltl值为0. 4，得到的菌液为待 测菌液；培养容器内的所有物质记作菌液。营养缺陷型SD培养基(_Leu，-His)的配方为20mg · L_1腺嘌呤半硫酸盐， 20mg · L-I盐酸精氨酸，20mg · L-I色氨酸，30mg · L-I异亮氨酸，30mg · L-I盐酸赖氨酸， 20mg .L-I 甲硫氨酸，50mg -L-I 苯丙氨酸，200mg -L-I 苏氨酸，30mg -L-I 酪氨酸，20mg -L-I 尿嘧啶，150mg · L-I缬氨酸，6. 7g · L-I无氨基酸酵母氮源。将D-荧光素(D-Iuciferin)溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH值为3.0)中， 得到 D-Iuciferin 溶液(设三个浓度的 D-Iuciferin 溶液lmM、0. ImM和 0. OlmM)，将 200ul D-Iuciferin溶液与IOOul待测菌液混合，得到混合物，将得到混合物加入检测板(白)，检 测混合物的荧光值。荧光测定使用TECAN Infinite M200多功能酶标仪，90个循环每aiiin 测定一次，积分时间为ls，每次测定前线性震荡2s，震荡直径4mm。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配制方法如下将0. lmol/L柠檬酸18. 6ml与0. lmol/L柠檬酸钠1. 4ml混合后获得20ml柠檬 酸-柠檬酸钠缓冲液，PH值为3. 0，浓度为0. lmol/L。结果实验结果如图1所示，D-Iuciferin的浓度为0. OlmM时荧光信号较为稳定， 随时间及温度的变化较小。而且，使用低浓度的底物对于降低实验成本具有较大的意义。所 以确定使用0. OlmM的D-Iuciferin进行检测。根据测定的0D600值和发光值，绘制生长曲线(图2)。结果显示经过延滞期后，该重组酵母具有7-8小时的对数生长期，经过5-4小时的 稳定期之后开始衰亡。通常认为对数生长期中，酵母生长速率最快、代谢旺盛、酶系活跃、细 胞的化学组成形态理化性质基本一致。较适宜进行定量研究。方法II除以下1)和2)的方法以外，其余方法均与方法I相同。(1)至菌液的 OD6tl。值为 1.0。(2)将 IOOul D-Iuciferin 溶液与 IOOul 待测菌液混合。结果与方法I无显著差异。方法III除以下1)和2)的方法以外，其余方法均与方法I相同。(1)至菌液的 OD6tltl 值为 1. 5。(2)将50ul D-Iuciferin溶液与IOOul待测菌液混合。结果与方法I无显著差异。
实施例2、利用荧光双杂交酵母检测蛋白质之间的相互作用pGBKT7-53质粒(购自clontech公司，产品目录号为630303)，包含融合基因 GAL4DNA-BD-murine p53 ；pGADT7_T 质粒(购自 Clontech 公司，产品目录号为 630303)，包 含融合基因 GAL4AD-large T-antigen。其中蛋白 murine p53 与 large T-antigen 可以相 互作用。一、质粒转化使用酵母转化试剂盒或LiAc法向实施例1构建的重组荧光酵母中共 转化包含融合基因GAL4DNA-BD-murine p53的pGBKT7_53质粒和包含融合基因 GAL4AD-largeT-antigen 的 pGADT7_T 质粒。由于二者同时表达，蛋白 murine p53 和 large T-antigen可以相互作用，使得BD和AD在空间上接近，形成转录激活复合物，可激活GAL4 响应元件(UAS)进而激活报告基因荧光素酶的表达。即可实现对于蛋白质(X和Y)间相互 作用的研究。将pGBKT7-53质粒和pGADT7_T质粒分别单独转化重组荧光酵母作为阴性对照，将 PCLl质粒转化重组荧光酵母作为阳性对照，同时设未转化质粒的重组荧光酵母为转空载体 对照。将转化后的菌液涂布于营养缺陷型固体SD平板，30°C倒置培养1-2天至单斑出 现。挑取酵母单斑，过夜培养(30°C，200rpm)后，使用pGBKT7_53质粒和pGADT7_T质粒的 特定引物进行菌液PCR验证。pGBKT7-53引物序列如下T7sequencing primer 5’ -TAATACGACTCACTATAGGGCG-3’3， DNA-BD sequencing primer5， -TTTTGCTTTTAAAACCTAAGAGTC-3，阳性结果在0. 6kb出现明亮条带。pGADT7-T引物序列如下T7sequencing primer 5’ -TAATACGACTCACTATAGGGCG-3’3， AD sequencing primer 5’ -TCTACCACGTGCTACGTGTC-3，阳性结果在0. 8kb出现明亮条带。二、荧光检测挑取阳性酵母单斑，用营养缺陷型SD培养基(_Leu，-Trp)进行震荡培养(30°C， 200rpm，旋转半径为1. 3cm)，至菌液的0D_值为0. 4，得到的菌液为待测菌液，培养容器内 的所有物质记作菌液，即可进行荧光发光检测。营养缺陷型SD培养基(_Leu，-Trp)的配方为20mg · L-I腺嘌呤半硫酸盐， 20mg · L-I盐酸精氨酸，20mg · L-I 一水合盐酸组氨酸，30mg · L-I异亮氨酸，30mg · L-I盐 酸赖氨酸，20mg · L-I甲硫氨酸，50mg · L-I苯丙氨酸，200mg · L-I苏氨酸，30mg · L-I酪氨 酸，20mg · L-I尿嘧啶，150mg · L-I缬氨酸，6. 7g · L-I无氨基酸酵母氮源。荧光测定方法与实施例1中步骤二的方法I相同。
荧光检测结果如表1所示表1转化不同质粒的的重组荧光酵母菌液荧光测定结果
权利要求
1.一种融合基因，由序列表中序列5第9到1030位核苷酸所示的DNA片段、报告基因、 终止子、筛选标记蛋白表达盒和序列表中序列5第4336到52 位核苷酸所示的DNA片段 依次连接构成的融合基因。
2.根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于所述终止子的核苷酸序列为序列表中序列5第观03到3130位所示；所述报告基因为荧光素酶报告基因；所述筛选标记蛋白表达盒为HIS Box表达盒。
3.根据权利要求1或2所述的融合基因，其特征在于所述荧光素酶报告基因的核苷酸序列如序列表中序列5第1063位-第2715位所示；所述HIS Box表达盒的核苷酸序列为序列表中序列5第3152到43 位所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的融合基因，其特征在于所述融合基因为序列表中 序列5第9到52 位所示的DNA分子。
5.含有权利要求1-4中任一所述融合基因的重组质粒。
6.一种重组酵母菌，是将权利要求1-5中任一所述融合基因导入宿主酵母菌得到的； 所述宿主酵母菌为缺失GAL4基因和GAL80基因的酵母菌。
7.根据权利要求6所述的重组酵母菌，其特征在于所述宿主酵母菌为酵母菌Y187。
8.检测权利要求6或7所述的重组酵母菌中荧光素酶活性的方法，包括以下步骤(1)使权利要求6或7所述的重组酵母菌中荧光素酶表达，得到荧光素酶表达的重组酵 母菌；(2)将步骤(1)得到的所述重组酵母菌进行震荡培养，至菌液的0D_值为0.4-1. 5或 0. 4或1. 0或1. 5，得到的菌液为待测菌液；培养容器内的所有物质记作菌液；(3)将荧光素酶底物溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中得到荧光素酶底物溶液，将得 到的荧光素酶底物溶液与所述待测菌液混合，得到混合物，检测混合物的荧光值，即得到所 述荧光素酶活性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述震荡培养是在温度为30°C和转速为200rpm的条件下进行，旋转半径为1. 3cm ；所述待测菌液与所述荧光素酶底物溶液的体积比为1 2-2 1或1 2或1 1或 2:1;所述荧光素酶底物溶液的浓度为0. OlmM ；所述荧光素酶底物为D-荧光素；所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0. lmol/L和pH值为3. 0。
10.权利要求6或7所述的重组酵母菌在检测蛋白质间相互作用中的应用。
全文摘要
本发明公开了重组荧光双杂交酵母及其检测方法与应用。本发明所提供的重组荧光酵母是将融合基因转入酵母菌Y187得到的重组酵母菌。所述融合基因由序列表中序列5第9到1030位所示的DNA片段、报告基因、终止子、筛选标记蛋白表达盒和序列表中序列5第4336到5226位依次连接构成的融合基因。本发明所提供的重组荧光酵母可用于快速检测蛋白质之间的相互作用。
文档编号C12N15/62GK102127561SQ201010601628
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月22日 优先权日2010年12月22日
发明者杨明嘉, 王子健, 马梅 申请人:中国科学院生态环境研究中心