专利名称：青藏高原野生大麦HsCIPK26基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及涉及基因工程技术领域，尤其是一种青藏高原野生大麦HsCIH^e基因。
背景技术：
目前，在已完成基因组测序工作的植物中，相关学者已从拟南芥中鉴定出沈个 AtCIPKs, 31个水稻OsCII3Ks, 43个玉米ZmCII3Ks, 27个胡杨PtCII3Ks,其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物种中也有相继报道。根据已有的研究结果，植物cira主要参与各种逆境胁迫的信号传导。由于目前大麦基因组测序仍未完成，无法确定其含有多少个HsCira基因，但理论上野生大麦基因组中至少应包含31个HsCIPKs基因家族成员。从基因结构上来看， AtCira基因分为多内含子基因和少内含子基因，通过转录表达和功能分析表明，Cira基因是否含有内含子与其对应的逆境胁迫没有明显关系。已有研究表明CBL与Cira之间并不是简单的一对一关系，一个CBL可以与多个CII3K相结合，多个CBL也可以和一个CII3K互作， 一种胁迫可能引起多种CBL-CII3K互作。已有的研究证明，AtCIPKH基因可能参与糖信号调节途径，0sCIPK2, OsCIPKlO, OsCIHQ 1和OsCII3KH基因在高盐、低温等逆境下表达量都有不同程度的变化，可能参与了多条逆境信号转导途径。表达序列标签(expressed sequence tags，EST)是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200-600bp由于基因表达调控作用不同，同一个基因的 mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST。EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法。转座子标签法，DNA亚克隆，电子克隆(Cloning In Silico)，Tail-PCR, iPCR(InversePCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR)，RACE (cRACE、3，-RACE,5' -RACE)等技术都是分子克隆中常用的技术。此外随着转座子的深入研究及测序技术的飞跃发展，直接分离鉴定新基因的难度变得越来越小。
发明内容
本发明利用水稻OsCira同源基因序列设计电子探针，从已有的各种大麦核苷酸序列库如EST库中搜索同源片段，然后用聚类分析和电子拼接等方法，获取目标基因编码序列(coding sequence，⑶S)。运用生物信息学方法对目标基因进行结构分析和功能预测。 提取野生大麦总RNA，制备cDNA和设计PCR引物，通过PCR技术克隆目标基因。对所获得的目标基因进行TA克隆、测序和序列分析。青藏高原野生大麦HsCIH^e基因，源于青藏高原一年生野生大麦且它是植物所特有、与CBL特异作用的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO :1的核苷酸序列定义。所述的青藏高原野生大麦HsCIH^e基因，它在N端有一特异的催化结构域，C端区域含有一个独特的21-M个氨基酸组成的调节域即NAF结构域，这两个调节域的序列在所有CII3K中高度保守，，所述的青藏高原野生大麦HsCIH^6基因，其编码SEQ ID NO :2定义的氨基酸序列本发明从青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontoneum C. Koch)中鉴定并分离出HsCIPI^6基因。
图1为HsCIH^6电泳结果；图2为pMD18T: :HsCIPK26阳性克隆鉴定结果；图3为青藏高原一年生野生大麦HsCIH^e基因的蛋白结构；图4为青藏高原一年生野生大麦HsCIH^e基因的全序列；图5本发明技术路线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1HsCIH^6基因全序列的获得1. 1引物设计(带下划线的为酶切位点序列)HsCIPK26-KpnI"F :CGGGGTACCATGGAAGACAGGAGTGTTTTGACCAAACHsCIPK26-XbaI-R :TGCTCTAGATTATTGTGGCAGTGGGGAGAAAGATTTG表1反应体系
权利要求
1.青藏高原野生大麦HsCIH^e基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麦且它是植物所特有、与CBL特异作用的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID N0:1的核苷酸序列定义。
2.根据权利要求1所述的青藏高原野生大麦HsCIH^e基因，其特征在于它在N端有一特异的催化结构域，C端区域含有一个独特的21-M个氨基酸组成的调节域即NAF结构域， 这两个调节域的序列在所有Cira中高度保守，，所述的青藏高原野生大麦HsCIH^e基因， 其编码SEQ ID NO :2定义的氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了青藏高原野生大麦HsCIPK26基因，其由SEQID NO1的核苷酸序列定义。利用水稻OsCIPK同源基因序列设计电子探针，从已有的各种大麦核苷酸序列库如EST库中搜索同源片段，然后用聚类分析和电子拼接等方法，获取目标基因编码序列(coding sequence，CDS)。运用生物信息学方法对目标基因进行结构分析和功能预测。提取野生大麦总RNA，制备cDNA和设计PCR引物，通过PCR技术克隆目标基因。对所获得的目标基因进行TA克隆、测序和序列分析。
文档编号C12N15/29GK102168090SQ20101060156
公开日2011年8月31日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者查笑君, 潘建伟, 王文祥, 郑仲仲 申请人:浙江师范大学