专利名称：一种提高肉苁蓉培养细胞苯乙醇糖甙含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种用超声波提高滇肉苁蓉培养细胞苯乙醇糖甙含量的方法。
背景技术：
肉苁蓉(。^te/ c/ e 6feser"coh Y.- C. Ma)为列当科肉苁蓉属多年生高等寄生植物，其味甘咸微辛酸、微温，在《神农百草经》中列为上品，具有补中、入肝、益精、滋肾、壮阳等功效。肉苁蓉中的化学成分非常复杂，目前已经从中分离鉴定出40余种，主要的活性成分是苯乙醇糖甙类化合物(Phenylethanoid Glycosides, PeG)，主要包括海胆甙、麦角甾甙、乙酰麦角甾甙和肉苁蓉甙A，有调节内分泌、促进代谢、清除自由基和抗衰老等药用功效。由于长期无节制的滥采乱挖，肉苁蓉的野生资源破坏严重，市场上供需矛盾凸显。而利用植物细胞大规模培养技术在反应器中直接培养细胞获得药用次生代谢产物是将来生产植物药最直接、最有效的手段。开展细胞培养技术来生产药用次生代谢产物，首先要获得一种能快速提高培养细胞有效药用成分含量的方法，以保证高效的生产效率，縮短生长周期，降低生产成本。
超声波在生物学和医学诊断治疗上的应用已经有几十年历史，前人的一些研究结果表明低强度的超声波刺激能够影响细胞的生长，使细胞膜和细胞器的形态发生变化，这些变化可导致细胞代谢和膜通透性的改变。己有许多研究表明超声波能够提高酶以及微生物细胞在反应器中的生物转化效率，但是生物反应过程中超声波的影响机理仍然不十分清楚，大多数情况下认为是超声波的机械刺激强化了生物转化过程中传质和混合，甚至提高了酶的活性，使细胞内代谢反应更加旺盛。过去有关超声波生物学效应的研究大多集中于人和动物细胞及微生物，应用于植物细胞的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效提高肉苁蓉离体培养细胞苯乙醇糖甙含量的方法。
该方法的操作步骤如下
1)肉苁蓉细胞的继代培养继代培养基为B5基础培养基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA3 10mg/L +水解酪蛋白800 rag/L。培养条件为固体培养，pH值5. 6，温度25 °C，每天光照16 h，光照强度3000 Lux，培养周期30天(肉苁蓉细胞继代培养的目的是为了获得足够的细胞生物量用于研究超声波对细胞合成苯乙醇糖甙能力的影响)； 2)肉苁蓉细胞超声波处理
a. 用超声波清洗器来实现对细胞的超声刺激作用；
b. 将继代培养15天的细胞接种在装有40mL液体继代培养基的三角瓶中培养，培养温 度为25 °C，摇床转速IIO r/min，每天光照16 h，光照强度3000 Lux，细胞培养周期为20 d;
c. 在细胞培养过程的第2 — 10天中，选取超声波功率80—200 W、超声波处理时间1一5 min，对肉苁蓉培养细胞进行超声波刺激；
3) 超声波刺激后继续培养，直到完成18天的培养周期；
4) 苯乙醇糖甙含量的测定培养结束后的肉苁蓉愈细胞在6(TC的条件下烘干至恒重， 然后粉碎成40目，并用甲醇浸提24h，过滤后浓縮提取液，然后用水稀释，通过大孔吸附 树脂AB-8柱，先后用水和甲醇洗脱，收集甲醇洗脱部分用于测定苯乙醇糖甙的含量。
苯乙醇糖甙在332 nm处有强吸收峰，由此可绘制标准曲线，得到C二81. 43X—0. 69， R=0.9991，其中C为甲醇溶液中的苯乙醇糖甙浓度(rag/L)， X为该测定溶液的吸光度值， ^相关系数。
S= (CNV/W) X100%; P=1000 SW
其中，S为苯乙醇糖甙含量(％ )， P为苯乙醇糖甙产量(mg/L)， W为愈伤组织干重(g/L)， V为萃取液体积(L)， N为稀释倍数。(该测定方法为现有技术)
本发明内容的关键点在于1.超声波功率的选取；2.超声波处理时间的确定；3.超 声波处理时刻的选取。以上关键点如能把握好，可以显著提高细胞苯乙醇糖甙的含量。 本发明操作简便，效果良好，扩展性强，可应用于肉苁蓉细胞生物反应器大规模培养
过程，提高培养细胞药用次生代谢产物苯乙醇糖甙类化合物的含量。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。 实施例l:
1) 肉苁蓉细胞的继代培养继代培养基为B5基础培养基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA; 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培养条件为固体培养，pH值5. 6，温度25 。C ，每天光照 16 h，光照强度3000 Lux;
2) 将继代培养15天的细胞接种在装有40 niL液体继代培养基的三角瓶中悬浮培养，培养温度为25 °C，摇床转速110 r/min，每天光照16 h，光照强度3000 Lux;
3) 在培养的第2天，对悬浮培养细胞施加功率为80 W、时长为5 min的超声波刺激， 细胞经超声波剌激后，继续培养，直到完成18天的培养周期。
4) 培养结束后测定细胞苯乙醇糖甙的含量为8.4%，比不经过任何超声刺激的对照组 提高了18. 3%。
实施例2:
1) 肉苁蓉细胞的继代培养继代培养基为B5基础培养基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA3 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培养条件为固体培养，pH值5. 6，温度25 °C，每天光照 16 h，光照强度3000 Lux;
2) 将继代培养15天的细胞接种在装有40 mL液体继代培养基的三角瓶中悬浮培养，培 养温度为25 °C，摇床转速IIO r/min，每天光照16 h，光照强度3000 Lux;
3) 在培养的第6天，对悬浮培养细胞施加功率为140 W、时长为3 min的超声波刺激， 细胞经超声波刺激后，继续培养，直到完成18天的培养周期。
4) 培养结束后测定细胞苯乙醇糖甙的含量为9.5%,比不经过任何超声刺激的对照组 提高了33.8%。
实施例3:
1) 肉苁蓉细胞的继代培养继代培养基为B5基础培养基+ 6-BA 0. 5 mg/L + GA, 10 mg/L +水解酪蛋白800 mg/L。培养条件为固体培养，pH值5. 6，温度25 °C，每天光照 16 h，光照强度3000 Lux;
2) 将继代培养15天的细胞接种在装有40 mL液体继代培养基的三角瓶中悬浮培养，培 养温度为25 。C，摇床转速IIO r/rain，每天光照16 h，光照强度3000 Lux;
3) 在培养的第10天，对悬浮培养细胞施加功率为200W、时长为l min的超声波刺激， 细胞经超声波刺激后，继续培养，直到完成18天的培养周期。
4) 培养结束后测定细胞苯乙醇糖甙的含量为9.3%，比不经过任何超声刺激的对照组 提高了31.0%。
权利要求
1、一种提高肉苁蓉培养细胞苯乙醇糖甙含量的方法，其特征在于按以下步骤进行1)肉苁蓉细胞的继代培养使用继代培养基，培养条件为固体培养，pH值5.6，温度25℃，每天光照16h，光照强度3000Lux；2)将继代培养15天的肉苁蓉细胞接种在装有40mL液体继代培养基的三角瓶中培养，培养温度为25℃，摇床转速110r/min，每天光照16h，光照强度3000Lux，；3)在细胞培养过程的第2-10天中，选取超声波功率80-200W、超声波处理时间1-5min，对肉苁蓉培养细胞进行超声波刺激；4)超声波刺激后继续培养，直到完成18天的培养周期。
全文摘要
本发明涉及一种提高肉苁蓉培养细胞苯乙醇糖甙含量的方法。其操作步骤主要包括1.肉苁蓉细胞的继代培养；2.肉苁蓉细胞的液体培养和超声波处理过程；3.苯乙醇糖甙含量测定过程。利用超声波对悬浮培养的肉苁蓉细胞进行刺激，是提高细胞苯乙醇糖甙含量的有效手段。本发明操作简便，效果良好，扩展性强，可应用于肉苁蓉细胞生物反应器大规模培养过程，提高培养细胞药用次生代谢产物的含量。
文档编号C12P19/00GK101629202SQ20091009485
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月20日 优先权日2009年8月20日
发明者刘迪秋, 熊向峰, 锋 葛, 陈朝银, 韩本勇 申请人:昆明理工大学