专利名称：：一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，具体涉及治疗神经系统疾病的药物，特别是治疗老年性痴呆症的药物。
背景技术：
：随着世界人口老龄化的不断加剧，与衰老有关的许多疾病如神经退行性疾病正严重影响着人们的健康和生活质量。血管性痴呆(VascularDementia,VD)是老年痴呆症的一种类型。国外研究表明，随着年龄的增长，VD的发病率呈上升趋势，在欧洲和美国VD是仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer，sdisease,AD)的最常见的痴呆，约占所有痴呆的10%50%。研究表明，血管性痴呆是唯一一类可治疗和预防的痴呆。由于发病机制的多样化，药物治疗疗效有限且差异较大，临床化学药物还存在一定的不良反应。研究显示，天然药物在防治VD方面具有独特的优势，尤其是单味中药或其有效部位、有效成分在用于VD防治时，具有选择性高、针对性强等特点，不仅能够从多途径、多靶点对VD进行干预，而且副作用少。因此开发和研究具有防治VD的天然药物具有广阔的前景。近年来，韩国学者开始系统研究紫珠属植物的化学成分和药理活性，从紫珠属植物白棠子树(C.dichotoma)分离出包括连翘酯苷(forsythosidesB)和毛瑞花糖苷(acteoside)在内的10种苯乙醇苷类化合物，并发现这些成分对胱氨酸诱导的大鼠大脑皮层细胞损伤的保护作用；文中还介绍了所述10种苯乙醇苷类化合物是采用下述分离方法得到8.5Kg干燥白棠子树的茎叶用70%甲醇提取，得到780g提取物，然后经正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇分馏，得到正丁醇分馏产物360g；正丁醇分馏产物经AmberliteXAD-2分离(H2O-MeOH洗脱)得到A-IA-10十个组分；取A-3(20g)经ODSgelcolumn(500g,8X60cm，H2O-MeOH洗脱)禾口r印eatedsemi-preparativeHPLC(MicrosorbC1880_299，10X250mm)分离出10个苯乙醇苷类化合物，其中连翘酯苷15mg，毛瑞花糖苷78mg(KooΚΑ,etal.PlantaMed，2005，71(8):778780.)。另有文献对其中的毛瑞花糖苷(acteoside)的药理作用做了进一步研究，发现其对东莨菪碱诱导的记忆障碍具有改善作用(KiYongLee,Biol.Pharm.Bull,2006,29(1)7174.)。尽管上述文献报道了从紫珠属植物中提取出可能具有治疗老年痴呆潜力的苯乙醇苷类化合物，但从KooKA的报道中可以看出，其提取方法的苯乙醇苷类化合物得率极低，360g的正丁醇分馏物(植物用量为8.5kg)中只提取到连翘酯苷15mg、毛瑞花糖苷78mg，其他几类化合物也均是毫克级别的产量，难以产业化。因此，KooKA所公开方法的分离纯化方法必须进行改进，否则尽管用70%甲醇提取可能将药材中所含苯乙醇苷类化合物基本溶出，但其浓度无法达到临床上可接受的要求。此外，KooKA所公开的方法还存在有机溶剂毒副作用大和用量大等不足。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种枇杷叶紫珠提取物。本发明解决上述问题的技术方案是一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物，该提取物中含有4055%(w/w)的连翘酯苷和1030%(w/w)的毛瑞花糖苷；所述的提取物是由以下方法制备得到的(1)取枇杷叶紫珠的茎叶粗粉，用第一极性溶剂提取23次，每次加1030倍体积第一极性溶剂，在常压下加热回流提取1.01.5小时，滤出提取液；合并提取液，减压浓缩至比重1.101.20(50°C)，加乙醇至含醇量达60%(v/v)，冷藏12小时，滤去不容物后减压浓缩至无醇味，然后在520°C下，10003000rpm高速离心，分离出上清液；(2)取上清液，以0.52BV/h的流速加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，待吸附饱和后，先用510BV第二极性溶剂以0.52BV/h的流速洗脱，再用第三极性溶剂进行洗脱，收集第三极性溶剂的洗脱液，浓缩，干燥即得；上述步骤中，所述第一极性溶剂是水或5075%(v/v)乙醇；第二极性溶剂为水；第三极性溶剂的极性比第二极性溶剂低，可以是2030%(v/v)甲醇或3040%(v/v)乙醇。本发明所述提取物还含有cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3’-a-L-Rhanmnopyranoside，其总含量不超过所述提取物总质量的5%。为了更方便理解本发明提取物中的成分，所述提取物中的主要成分苯乙醇苷类化合物可用通式(1)表示<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表1中，Caf表示ho^X^n^X^<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>本发明所述提取物可由以下方法制备得到(1)取枇杷叶紫珠的茎叶粗粉，用第一极性溶剂提取23次，每次加1030倍体积第一极性溶剂，在常压下加热回流提取1.01.5小时，滤出提取液；合并提取液，减压浓缩至比重1.101.20(50°C)，加乙醇至含醇量达60%(v/v)，冷藏12小时，滤去不容物后减压浓缩至无醇味，然后在520°C下，10003000rpm高速离心，分离出上清液；(2)取上清液，以0.52BV/h的流速加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，待吸附饱和后，先用510BV第二极性溶剂以0.52BV/h的流速洗脱，再用第三极性溶剂进行洗脱，收集第三极性溶剂的洗脱液，浓缩，干燥即得。该第三极性溶剂与第二极性溶剂相比，极性较低；上述步骤中，所述第一极性溶剂是水或5075%(v/v)乙醇；第二极性溶剂为水；第三极性溶剂的极性比第二极性溶剂低，可以是2030%(v/v)甲醇或3040%(v/v)乙醇。本发明方法中，步骤(1)的最佳提取条件为用水提取2次，每次加30倍水，分别提取1.5小时和1小时BV表示倍柱体积，BV/h表示倍柱体积每小时。本发明人抛开了现有技术中提取紫珠植物中苯乙醇苷类化合物的方法(即甲醇提取+正丁醇分馏)，采用3种极性较强的溶剂按一定顺序提取结合大孔树脂纯化的方式，从枇杷叶紫珠获得苯乙醇苷类化合物含量极高(总含量可达5085%)的提取物，该提取物不必经进一步的分离纯化为纯物质即具有显著的治疗老年性痴呆症的疗效。此外，本发明方法简便，提取率高，提取溶剂无毒害，有利于工业化生产。经动物实验证实，本发明所述的提取物对正常小鼠以及多种记忆损伤模型动物均有增强或改善学习记忆的功能，可用于制备治疗老年性痴呆症的药物，尤其是治疗血管性痴呆症(VascularDementia,VD)的药物。所述药物可以是肠溶胶囊、软胶囊、滴丸、分散片、颗粒剂等。以下通过具体实验来进一步说明本发明的有益效果1、本发明提取物对正常小鼠学习记忆功能的影响(1)昆明种小鼠，按一下分组进行跳台试验和避暗试验空白对照组不给予任何药物。阳性对照组以吡拉西坦片(Piracetam)为阳性对照药，灌胃给药，每天一次，连续灌服7天。本发明提取物高剂量组按200mg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。本发明提取物低剂量组按lOOmg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。(2)实验方法跳台实验方法末次给药后次日开始训练。将动物放入反应箱适应环境3min，然后立即通以36V连续电流刺激5min，小鼠受到电击后正常逃避反应是跳上橡皮台。小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应。多数动物可能再次或多次跳到铜栅上，受到电击又迅速跳回到橡皮台上。如此训练5min，并记录每鼠5min内受到电击的次数，以此评价学习成绩。24h后重复测验，将小鼠放在跳台上并开始计时，记录动物第一次跳下平台的潜伏期(若超过3min则按3min计算)，同时记录3min内的错误反应次数，以此评价记忆保持成绩。避暗实验方法实验开始时将小鼠头部背向洞口放入明室，同时开始计时，动物穿过洞口进入暗室受到电击，立即停止计时，取出小鼠，记录每只小鼠从放入明室至进入暗室受到电击所需的时间，此即为潜伏期，以此评价学习成绩。24h后重做测试，记录潜伏期和5min内的电击次数，以此评价记忆保持成绩。(3)实验结果各给药组与对照组对正常小鼠学习记忆的影响结果参见图14。由图1和图2可知，与空白对照组相比，本发明提取物的高剂量组(200mg-kgd_1，HPC)、低剂量组(lOOmgkgcf1，LPC)均能明显减少小鼠学习记忆的错误数(P<0.05或P<0.01)，延长潜伏期(P<0.05或P<0.01)，学习记忆保持能力都有显著的提高，吡拉西坦500mg/kg剂量组对正常小鼠跳台错误数有显著的减少作用(P<0.05)。实验结果表明，本发明提取物的高、低剂量组在跳台实验中均能明显提高正常小鼠的学习记忆能力。由图3和图4可知，与空白对照组相比，只有本发明提取物的高剂量组具有明显减少正常小鼠进入暗箱的次数(P<0.05)和延长小鼠进入暗箱的潜伏期(P<0.05)的作用，其他组别对正常小鼠的学习记忆成绩无显著性影响。2、本发明提取物对30%乙醇诱导的小鼠记忆再现缺失的保护作用(1)昆明种小鼠，除空白对照组外，其余各组用30%乙醇诱导的小鼠记忆再现缺失，然后分为以下4个实验组模型对照组不给予任何药物。阳性对照组以吡拉西坦片(Piracetam)为阳性对照药，灌胃给药，每天一次，连续灌服7天。本发明提取物高剂量组按200mg-kg本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。本发明提取物低剂量组按lOOmg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。(2)实验方法与实验1相同。(3)实验结果各给药组与对照组对30%乙醇诱导的小鼠记忆再现缺失的保护作用结果参见图58。由图5和图6可知，模型组与空白对照组相比，逃避潜伏期显著缩短，记忆保持能力显著降低，表明造成了记忆再现障碍，30%乙醇所致的小鼠记忆损伤模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高剂量组(200mgkgcf1，HPC)、低剂量组(lOOmgkgcf1，LPC)与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01)和延长潜伏期(P<0.01)，提高学习记忆保持能力。吡拉西坦组对小鼠跳台错误数有显著的减少作用(P<0.01)，同时延长小鼠进入暗箱潜伏期(P<0.01)。实验结果显示，本发明提取物能显著地拮抗由30%乙醇造成的小鼠记忆再现障碍。由图7和图8可知，模型组与空白对照组相比，错误次数明显增多，逃避潜伏期显著缩短，记忆保持能力显著降低，造成了记忆再现障碍，表明乙醇所致的小鼠记忆损伤模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高、低剂量组与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01)和延长潜伏期(P<0.01)，提高学习记忆保持能力。吡拉西坦组对小鼠跳台错误数有显著的减少作用(P<0.01)，同时延长小鼠进入暗箱潜伏期(P<0.01)。实验结果显示，本发明提取物能显著地拮抗由30%乙醇造成的小鼠记忆再现障碍，较高剂量组的作用效果较为显著，且优于阳性对照药。3、本发明提取物对NaN02致小鼠记忆巩固障碍的影响(1)昆明种小鼠，除空白对照组外，其余各组用NaN02诱导的小鼠记忆巩固障碍，然后分为以下4个实验组模型对照组不给予任何药物。阳性对照组以吡拉西坦片(Piracetam)为阳性对照药，灌胃给药，每天一次，连续灌服7天。本发明提取物高剂量组按200mg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。本发明提取物低剂量组按lOOmg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。(2)实验方法与实验1相同。(3)实验结果各给药组与对照组对NaN02诱导的小鼠记忆巩固障碍的影响结果参见图912。由图9和图10可知，模型组与空白对照组相比，错误次数明显增多，潜伏期显著缩短，造成了记忆巩固障碍，表明NaN02所致的小鼠记忆巩固障碍模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高剂量组(200mgkgcf1，HPC)、低剂量组(lOOmgkgcf1，LPC)与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01或P<0.05)，延长潜伏期(P<0.01)，学习记忆巩固能力有显著的提高。吡拉西坦500mg/kg剂量组对小鼠跳台错误数有显著的减少作用(P<0.05)，同时延长小鼠进入暗箱潜伏期(P<0.01)。由图11和图12可知，模型组与空白对照组相比，错误次数明显增多，潜伏期显著缩短，造成了记忆巩固障碍，表明NaN02所致的小鼠记忆巩固障碍模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高、低剂量组与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01)，延长潜伏期(？<0.01或卩<0.05)，学习记忆能力有显著的提高，且高剂组作用强度超过吡拉西坦组(P<0.05)。实验结果显示，本发明提取物的高、低剂量组均能明显地对抗由NaN02诱导的小鼠记忆巩固障碍，且高剂量组作用比低剂量组效果更明显。4、本发明提取物对东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得障碍的影响(1)昆明种小鼠，除空白对照组外，其余各组用东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得障碍，然后分为以下4个实验组模型对照组不给予任何药物。阳性对照组以吡拉西坦片(Piracetam)为阳性对照药，灌胃给药，每天一次，连7续灌服7天。本发明提取物高剂量组按200mg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。本发明提取物低剂量组按lOOmg-kg，(！―1本发明提取物灌胃给药，连续灌服7天。(2)实验方法与实验1相同。(3)实验结果各给药组与对照组对东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得障碍的影响结果参见图1316。由图13和图14可知，模型组与空白对照组相比，错误次数明显增多，潜伏期显著缩短，造成了记忆获得性障碍，表明东莨菪碱所致的小鼠记忆障碍模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高剂量组(200mgkgcT1，HPC)、低剂量组(lOOmgkgcf1，LPC)与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01)，延长潜伏期(P<0.01)，学习记忆能力有显著的提高。吡拉西坦500mg/kg剂量组对小鼠跳台错误数有显著的减少作用(P<0.05)，同时延长小鼠进入暗箱潜伏期。实验结果显示，本发明提取物的高、低剂量组均能明显地对抗由东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得性障碍。由图15和图16可知，模型组与空白对照组相比，错误次数明显增多，潜伏期显著缩短，造成了记忆获得性障碍，表明东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍模型复制成功。给药后，对本发明提取物的高、低剂量组与模型组进行观察比较，结果显示本发明提取物的高、低剂量组均能显著性减少小鼠学习记忆的错误次数(P<0.01或P<0.05)，延长潜伏期(P<0.01或P<0.05)，学习记忆能力有显著的提高，且高剂组作用强度超过吡拉西坦组(P<0.05)。实验结果显示，本发明提取物的高、低剂量组均能明显地对抗由东莨菪碱诱导的小鼠记忆获得性障碍，并呈现一定的量效关系。5、本发明提取物对大脑中动脉梗死(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型大鼠学习记忆行为能力及脑和血清中生化指标活性的影响本实验采用大脑中动脉梗死(middlecerebralarteryocclusion，MCA0)法制作VD大鼠模型，观察本发明提取物对模型大鼠学习记忆行为能力及脑和血清中超氧化物歧化酶(S0D)活性、丙二醛(MDA)含量、单胺氧化酶(MA0-B)活性和乙酰胆碱酯酶活性的影响。5.1实验材料实验材料手术剪(直、弯)、微动脉夹、显微手术镊、尼龙线、手术缝线、缝合针、孔巾、手术固定板、Morris水迷宫及玻璃平台、电动离心机、玻璃勻浆器、电热恒温水浴箱、托盘式扭力天平。水合氯醛(广东省医学实验动物中心制备)，300、10^、嫩0-8^0^测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品。本发明提取物的冻干品，实验时用双蒸水配成浓度为0.05g/mL的混悬液，喜德镇(天津华津制药厂与北京诺华制药有限公司合作生产，批号080917)，用前用双蒸水经超声细胞粉碎机制成浓度为0.625mg/mL的混悬液，药物配制后置4°C冰箱保存备用，用前摇勻。5.2动物及分组SD健康大白鼠60只，雌雄各半，体重200g220g(广东省医学实验动物中心供给，合格证号No.0010256)，实验条件下自然饮食，适应环境一周后进行实验。分为6组，即含苯乙醇苷的制剂高、低剂量组，喜德镇组，模型组，假手术组和正常组各10只。5.3模型制备及动物处理采用改良线栓法制成大脑中动脉梗死模型大鼠10%水合氯醛腹腔注射(0.35mL/100g)麻醉后，将其仰卧固定，以络合碘消毒颈部皮肤，行颈部右侧切口，于胸骨舌骨肌与胸骨甲状肌间分离出右颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，并挂线备用，结扎ECA与CCA，用微动脉夹夹闭ICA远心端后，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形尼龙线(直径为0.25mm,距球端2cm处作标记)。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎尼龙线与入口处ICA段，然后松开夹闭ICA的动脉夹，继续插入尼龙线至稍有阻力后略回撤，至线插入深度为18mm20mm，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。再次结扎入口处，尼龙线外留约3cm，缝合皮肤。2h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。正常组大鼠不作任何手术处理。假手术组只结扎ECA与ICA。取造模成功的大鼠随机分为模型组、含苯乙醇苷的制剂组和西药组均10只。含苯乙醇苷的制剂高、低剂量组分别给予灌胃(200、100mgkgcf1)，西药组给予喜德镇灌胃(O.eZSmgAg^cf1)，模型组、假手术组和正常组均给予蒸馏水lmL/100g灌胃。术后第1天即用药，每日灌胃1次，连续给药21d后，进行行为学测试，然后取脑测定相应指标。5.4相关指标检测用Morris水迷宫训练，该训练包括隐匿平台搜索实验和探索实验。动物熟悉平台两次后，每只动物每天上下午各训练1次，连续训练5d，分别得到潜伏期数据和探索实验数据，该数据反映动物的学习与记忆能力。为排除感觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后进行可见平台实验。行为学测试后，将动物断头，冰盘上快速取脑，弃去嗅球和小脑，称量海马组织lOOmg左右，用预冷的生理盐水制成1%勻浆，3000r/min离心lOmin，取上清液，4°C保存备测，严格按试剂盒说明书测定S0D活力、MDA含量、MA0-B(机体衰老正相关酶)活性和AchE(乙酰胆碱酯酶)活性。5.5统计学处理所有数据用均数士标准差([±力表示，实验结果采用SPSS11.5统计软件进行处理，组间差异的显著性用方差分析法检验，组间两两比较用t检验。5.6实验结果5.6.1行为学检测结果结果如表2所示。表2的结果显示，在Morris水迷宫隐匿平台搜索实验中，与正常组相比，含苯乙醇苷的制剂高、低剂量组、阳性对照组和模型组的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，而以模型组的逃避潜伏期最长(P<0.05)，假手术组与正常组相比较无统计学意义(P>0.05)；探索实验结果中，正常组和假手术组动物的平均穿越次数最多，含苯乙醇苷的制剂组和阳性对照组动物穿越次数多于模型组(P<0.05)；在可见平台实验中，5组动物的逃避潜伏期没有明显的组间差异。表2本发明提取物对大鼠水迷宫实验的测定结果(n=10，mean士S.D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。5.6.2对大鼠血清和脑勻浆中MDA和SOD活性的影响结果如表3和4所示。从表3可以看出，与正常组比较，模型组大鼠血清和脑中MDA含量显著提高(P<0.05)，痴呆大鼠在给予本发明提取物后血清及脑中MDA的含量均有不同程度的降低，其中高剂量组对血清中MDA抑制率高于低剂量组，且均优于阳性对照组。表3本发明提取物对血管性痴呆大鼠血清和脑中MDA含量的影响(n=10，mean士S.D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。从表4可以看出，与正常组比较，模型组大鼠血清和脑中SOD活性显著降低(P<0.05)，痴呆大鼠在给予本发明提取物后血清及脑中S0D活性均显著提高，高、低剂量组对血清中S0D提高率在100%以上，且均优于阳性对照组。表4本发明提取物对血管性痴呆大鼠血清和脑中S0D活性的影响(n=10，mean士S.D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>假手术组<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注与正常组比较，*P<0.05与模型组比较，#P<0.05。5.6.3对大鼠脑中MA0-B活性的影响结果如表5所示，与正常组比较，模型组大鼠脑中MA0-B的活性明显提高(P<0.05)。痴呆大鼠在给予本发明提取物后，脑中MA0-B活性均显著降低(P<0.05)，高、低剂量组对脑中MA0-B抑制率在60%以上，且均优于阳性对照组。表5本发明提取物对血管性痴呆大鼠脑中MA0-B活性的影响(n=10，mean士S.D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与正常组比较，*P<0.05与模型组比较，#P<0.05。5.6.4对大鼠脑中AchE活性的影响结果如表6所示，与正常组比较，模型组大鼠脑中AchE的活性明显提高(P<0.01)。痴呆大鼠在给予本发明提取物后，能显著抑制脑中AchE活性(P<0.01)，高剂量组对脑中AchE抑制效果最强达到35.3%。表6本发明提取物对血管性痴呆大鼠脑中AchE活性的影响(n=10,mean士S.D.)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注与正常组比较，P<0.01;与模型组比较，#P<0.01,图1是给予不同药物的正常小鼠跳台错误次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图2是给予不同药物的正常小鼠第一次跳下平台潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图3是给予不同药物的正常小鼠进入暗箱次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图4是给予不同药物的正常小鼠进入暗箱潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图5是给予不同药物的30%乙醇所致记忆损伤小鼠跳台错误次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，EtOH为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图6是给予不同药物的30%乙醇所致记忆损伤小鼠第一次跳下平台潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，EtOH为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图7是给予不同药物的30%乙醇所致记忆损伤小鼠进入暗箱次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，EtOH为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图8是给予不同药物的30%乙醇所致记忆损伤小鼠进入暗箱潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，EtOH为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图9是给予不同药物的NaN02所致记忆巩固障碍小鼠跳台错误次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，NaN02为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图10是给予不同药物的NaN02所致记忆巩固障碍小鼠第一次跳下平台潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，NaN02为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图11是给予不同药物的NaN02所致记忆巩固障碍小鼠进入暗箱次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，NaN02为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图12是给予不同药物的NaN02所致记忆巩固障碍小鼠进入暗箱潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，NaN02为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图13是给予不同药物的东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠跳台错误次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，Scop为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图14是给予不同药物的东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠第一次跳下平台潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，Scop为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图15是给予不同药物的东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠进入暗箱次数的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，Scop为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为12本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。图16是给予不同药物的东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠进入暗箱潜伏期的比较柱形图，其中Cont为空白对照组，Scop为模型对照组，HPC为本发明提取物高剂量组，LPC为本发明提取物低剂量组，Pirac为阳性药物吡拉西坦片对照组。具体实施例方式制备例例1取干燥的枇杷叶紫珠5kg，粉碎成粗粉。取枇杷叶紫珠粗粉，加水20倍量浸泡1小时，在常压下加热回流提取1.5小时，趁热过滤，药渣再加水15倍，加热回流提取1小时，趁热过滤，合并两次提取液，减压浓缩至比重1.15(50°C)，加乙醇至含醇量达60%，冷藏12小时，倾出上清液，将残留的悬浊液过滤，合并上清液和滤液。将乙醇提取液减压浓缩至无醇味，在520°C下以2000rpm离心，取上清液，以lBV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱(AB-8型大孔吸附树脂，天津南开大学化工厂生产)，待吸附饱和后，先用8倍柱体积水以1.5BV/h的流速洗脱树脂柱，再用30%乙醇以lBV/h的流速洗脱，收集10倍柱体积的30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，即得含苯乙醇苷的提取物208g。以高效液相色谱法测定连翘酯苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖昔、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3'-a-L-RhanmnopyranosideStJ'^'fi固定相为色谱柱Kromasil100-5C18(4.6X250mm，5iim)；保护柱AnalyticalGuardCartridgeSystem(phenomenex,USA)；流动相甲醇_0.1%冰醋酸溶液(3070)；流速1.OmL/min；柱温:30士1°C；检测波长为334nm；分析周期45min。精密称取60°C减压干燥24小时的连翘酯苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾PsyringalideA3’-0-1^诎￡11111111叩71~￡1110&(16适量，分别用流动相溶解于5.01^量瓶中，摇勻，备用。分别吸取一定量的上述标准品溶液，混合均勻，配制成混合对照品溶液。最终对照品溶液中连翅酉旨苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB>luteosideC禾口syringalideA3'-a-L-Rhanmnopyranoside白勺浓度{衣次为3.124、1.258,0.435,0.836,0.682,0.562,0.831,0.456和0.724mgmlA。供试品溶液的制备是取本发明所述含苯乙醇苷的制剂20mg，加流动相溶解并定容至10mL。精密吸取上述溶液2mL至10mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，用0.4i!m微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取连续滤液约l.OmL，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10yL连续进样3次，测定峰面积，采用线性回归方程计算即得。检测结果显示连翘酯苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖昔、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3，-a-L-Rhanmnopyranoside的含量分别为53.2%,25.8%,0.64%A.87%,0.530.38%,0.82%,0.34%和0.93%。例2取干燥的枇杷叶紫珠6kg，粉碎成粗粉。取枇杷叶紫珠粗粉，加水30倍浸泡1小时，在常压下加热回流提取1.0小时，趁热过滤，药渣再加水20倍，加热回流提取1小时，趁热过滤，合并两次提取液，减压浓缩至比重1.12(50°C)，加乙醇至含醇量达60%，冷藏12小时，倾出上清液，将残留的悬浊液过滤，合并上清液和滤液。将乙醇提取液减压浓缩至无醇味，在520°C下以2000rpm离心，取上清液加于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂生产)，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用6倍柱体积水以1.5BV/h的流速洗脱树脂柱，再用40%乙醇以lBV/h的流速洗脱，收集8倍柱体积的40%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，即得含苯乙醇苷的提取物325g。采用制备例1的方法测定该提取物中连翅酉旨苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3’-a-L-Rhanmnopyranoside含量分别为45.6%AO.2%,0.73%A.68%,0.42%,0.31%,0.74%,0.28%和0.85%。例3取干燥的枇杷叶紫珠10kg，粉碎成粗粉。取枇杷叶紫珠粗粉，加水30倍浸泡1小时，在常压下加热回流提取1.0小时，趁热过滤，药渣再加水20倍，加热回流提取1小时，趁热过滤，合并两次提取液，减压浓缩至比重1.12(50°C)，加乙醇至含醇量达60%，冷藏12小时，倾出上清液，将残留的悬浊液过滤，合并上清液和滤液。将乙醇提取液减压浓缩至无醇味，在520°C下以2000rpm离心，取上清液加于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用6倍柱体积水以1.5BV/h的流速洗脱树脂柱，再用40%乙醇以lBV/h的流速洗脱，收集8倍柱体积的40%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，即得含苯乙醇苷的提取物463g。采用制备例1的方法测定该提取物中连翘酯苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC和syringalideA3，-a-L-Rhanmnopyranoside含量分别为48.7%、16.8%、0.96%A.82%,0.46%,0.35%,0.82%,0.41%和0.98%。例4取干燥的枇杷叶紫珠5kg，粉碎成粗粉。取枇杷叶紫珠粗粉，加50%乙醇30倍浸泡1小时，在常压下加热回流提取1.0小时，趁热过滤，药渣再加50%乙醇20倍，加热回流提取1小时，趁热过滤，合并两次提取液，减压浓缩至比重1.12(50°C)，将提取液减压浓缩至无醇味，在520°C下以2000rpm离心，取上清液加于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂生产)，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用5倍柱体积水以1.0BV/h的流速洗脱树脂柱，再用乙醇以lBV/h的流速洗脱，收集8倍柱体积的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，干燥，即得含苯乙醇苷的提取物243g。采用制备例1的方法测定该提取物中连翅酉旨苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3’_a_L_Rhanmnopyranoside含量分另lj为49.3%U4.7%,0.86%U.38%,0.26%,0.37%,0.83%,0.32%和1.06%。例5取干燥的枇杷叶紫珠5kg，粉碎成粗粉。取枇杷叶紫珠粗粉，加75%乙醇25倍浸泡1小时，在常压下加热回流提取1.0小时，趁热过滤，药渣再加75%乙醇20倍，加热回流提取1小时，趁热过滤，合并两次提取液，减压浓缩至比重1.13(50°C)，将提取液减压浓缩至无醇味，在520°C下以2000rpm离心，取上清液加于已处理好的AB-8型大孔吸附树脂(天津南开大学化工厂生产)，以2BV/h(倍柱体积每小时)的流速上大孔吸附树脂柱，待吸附饱和后，先用8倍柱体积水以2.OBV/h的流速洗脱树脂柱，再用甲醇以lBV/h的流速洗脱，收集8倍柱体积的甲醇洗脱液，减压回收甲醇，浓缩，干燥，即得含苯乙醇苷的提取物258g。采用制备例1的方法测定该提取物中连翅酉旨苷、毛瑞花糖苷、cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideC禾口syringalideA3’_a_L_Rhanmnopyranoside含量分另lj为43.6%U8.3%,0.58%U.73%,0.46%,0.21%,0.65%,0.26%和0.76%。本发明方法的苯乙醇苷类成分提取率与文献报道的比较下面将本方法制备的提取物与文献(KyungAhKoo，PlantaMedica，2005，71778780.)报道的共有的三种苯乙醇苷类成分(连翘酯苷、毛瑞花糖苷、异毛瑞花糖苷)进行比较，进一步说明本方法的有益效果。表7本发明方法的苯乙醇苷类成分提取率与文献报道的比较结果化合物名称制备例1(%)制备例2(%)制备例3(%)制备例4(%)制备例5(%)文献值(%)连翘酯苷2.212.472.252.402.251.76xl0_4毛瑞花糖苷1.070.550.780.710.949.18X10"4异毛瑞花糖苷0.080.090.080.070.094.35xl0"4从表7比较的结果可看出，与文献报道的方法相比，本发明的方法可大大提高苯乙醇苷类成分的含量和得率，而且具有操作相对简单，提取溶剂可循环利用，环境污染小的特点。应用例例1将制备例1所得提取物150g用适量乙醇稀释后，按照等量递加法分别与赋型剂HPMC和微粉硅胶按11.50.5的比例混合均勻，过6号筛制成颗粒，于60°C温度下干燥3小时。取1#空肠溶胶囊，分别填充以上干燥颗粒，每1粒胶囊0.3g，于囊口处涂一层阿拉伯胶浆，套封胶囊，用干燥纱布擦拭胶囊后，装于密闭棕色瓶内，即得。该制剂的用量为每天两次，每次2粒，口服。例2将制备例2所得提取物100g与225g花生油混合，加入25g蜂蜡及2g吐温-80，再用旋转式扎囊机压制成1000粒软胶囊(0.3g/粒)。该制剂的用量为每天两次，每次2粒，口服。例3将制备例3所得提取物120g与大豆油150g混合，加入15.0g蜂蜡及2g吐温-80，再用旋转式扎囊机压制成1000粒软胶囊(0.38/粒)。该制剂的用量为每天两次，每次4粒，口服。权利要求一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物，该提取物中含有40～55％(w/w)的连翘酯苷和10～30％(w/w)的毛瑞花糖苷；所述的提取物是由以下方法制备得到的(1)取枇杷叶紫珠的茎叶粗粉，用第一极性溶剂提取2～3次，每次加10～30倍体积第一极性溶剂，在常压下加热回流提取1.0～1.5小时，滤出提取液；合并提取液，减压浓缩至比重1.10～1.20(50℃)，加乙醇至含醇量达60％(v/v)，冷藏12小时，滤去不容物后减压浓缩至无醇味，然后在5～20℃下，1000～3000rpm高速离心，分离出上清液；(2)取上清液，以0.5～2BV/h的流速加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，待吸附饱和后，先用5～10BV第二极性溶剂以0.5～2BV/h的流速洗脱，再用第三极性溶剂进行洗脱，收集第三极性溶剂的洗脱液，浓缩，干燥即得；上述步骤中，所述第一极性溶剂是水或50～75％(v/v)乙醇；第二极性溶剂为水；第三极性溶剂是20～30％(v/v)甲醇或30～40％(v/v)乙醇。2.如权利要求1所述提取物，其特征在于所述的提取物中还含有不超过提取物总质量5%(w/w)的以下成分cistanosideC、异毛瑞花糖苷、cistanoside、lamiophlomiosideA、luteosideB、luteosideCfflsyringalideA-α-L-Rhanmnopyranoside。3.权利要求1或2所述提取物的制备方法，该方法由以下步骤组成(1)取枇杷叶紫珠的茎叶粗粉，用第一极性溶剂提取23次，每次加1030倍体积第一极性溶剂，在常压下加热回流提取1.01.5小时，滤出提取液；合并提取液，减压浓缩至比重1.101.20(500C)，加乙醇至含醇量达60%(ν/ν)，冷藏12小时，滤去不溶物后减压浓缩至无醇味，然后在520°C下，10003000rpm高速离心，分离出上清液；(2)取上清液，以0.52BV/h的流速加到装有疏水大孔隙聚合物的柱中，待吸附饱和后，先用510BV第二极性溶剂以0.52BV/h的流速洗脱，再用第三极性溶剂进行洗脱，收集第三极性溶剂的洗脱液，浓缩，干燥即可；上述步骤中，所述第一极性溶剂是水或5075%(ν/ν)乙醇；第二极性溶剂为水；第三极性溶剂是2030%(ν/ν)甲醇或3040%(ν/ν)乙醇。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中第一溶剂提取的次数为2次，第一次提取1.5小时，第二次提取1.0小时，所述的第一溶剂为水。5.权利要求1或2所述提取物在制备治疗老年性痴呆药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种含苯乙醇苷的枇杷叶紫珠提取物，该提取物的主要成分为苯乙醇苷类化合物，是用水或50～75％(v/v)的乙醇回流提取马鞭草科紫珠属枇杷叶紫珠(Callicarpakochiana)茎叶所得的提取液用大孔树脂纯化得到，其中含有40～55％(w/w)的连翘酯苷和10～30％(w/w)的毛瑞花糖苷。经动物实验发现，本发明所述的提取物对正常小鼠以及多种记忆损伤模型动物均有增强或改善学习记忆的功能，可用于制备治疗老年性痴呆症的药物，尤其是治疗血管性痴呆症(VascularDementia，VD)的药物。文档编号A61K127/00GK101797307SQ20101014636公开日2010年8月11日申请日期2010年4月9日优先权日2010年4月9日发明者林朝展,祝晨蔯申请人:广州中医药大学