专利名称：一种重组类人胶原蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组类人胶原蛋白及其生产方法。
背景技术：
胶原蛋白(collagen)是广泛分布于人体结缔组织的一组蛋白质家族，也是体内 含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25% 33%，其对维护细胞、组织、器官的正常 生理功能和损伤修复有重要作用。胶原蛋白作为天然的生物资源，具有合成高分子材料无 法比拟的生物相容性和生物可降解性，可广泛应用在医药、化妆品等工业中，但是天然胶原 蛋白不能溶于水，而且从动物体内提取的胶原蛋白为各种分子量从大到小不等的胶原蛋白 肽的混合体，性质非常复杂，难于进行进一步的加工，限制了其作为生物材料在组织工程等 领域的应用。而且，动物源的胶原蛋白很难避免有病毒感染的嫌疑，同时应用到人类还会带 来免疫排斥等副作用。为了获得人源的胶原蛋白，有研究者采用人胎盘作为原料来进行提 取，但是这种方式不仅受原料供应的限制更要面临伦理道德的指责。当前市场销售的胶原蛋白类产品或取自猪皮、牛皮等大动物组织或取自鱼类的皮 肤组织。由于动物组织提取物经常有病毒感染的隐患，此类产品仅能作为用于化妆品以及 保健品的原料使用，限制了其作为医药用品等高端产品方面的应用。生产胶原蛋白传统的也是目前最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织 中提取胶原蛋白，另外还有酶解法提取胶原蛋白，这些方法具有较高的回收率，但是这些方 法制取的胶原蛋白水溶性差、难分离到纯品，且在临床上表现出排异反应，使其作为生物医 学材料或药物载体等方面的应用受到了很大限制。随着现代生物技术的发展，利用转基因技术和基因重组技术，可以在动物、植物和 微生物表达体系获得重组人胶原蛋白，解决了传统提取方法存在的病毒隐患等缺点，同时 也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研 发研究重组胶原蛋白，如利用转基因的方法，培育含类人胶原蛋白的小白鼠、通过转基因微 量注射得到含重组类人胶原奶汁的哺乳动物，但通过哺乳类或昆虫细胞株生产的成本极 高、生产周期长。我国西北大学的范代娣等采用PCR扩增得到数段人胶原蛋白基因片段，接 着进行拼接重复，转化大肠杆菌，并通过高密度发酵培养生产类人胶原蛋白，获得高表达的 重组类人胶原蛋白。2004年，东京农业科技大学的Yao J等对胶原蛋白细胞附着作用和自 身交联螺旋相关序列作了研究，设计了长度为240个氨基酸的类人胶原蛋白，并在大肠杆 菌中得到了表达。但是细菌表达系统容易造成热原残余，致使表达产物不纯，难以应用于临 床，而且目的蛋白通常以包涵体形式表达，产物纯化过程复杂，另外原核表达系统的翻译后 加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点影响产品的品质。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种表达量高， 水溶性好，其结构和性能都优于动物源胶原蛋白的重组类人胶原蛋白。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种重组类人胶原蛋白，其特征 在于，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPL GIAGITGARGLAGPPGMPGP60
RGSPGPQGVK GESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTA GEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120
PGGKGDRGEN GSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180
QGPRGDKGET GERGMGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240
GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300
GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGMGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360
GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420
GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480
GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540
GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600
GSAGPPGATGFPGMGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720
GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780
GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839
所述重组类人胶原蛋白的结构为单链、单螺旋结构，其氨基酸为839个，其中
1-241为III型肽段，242-839为I型肽段。本发明还提供了一种生产该重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法包括 以下步骤(1)毕赤酵母基因工程菌的构建；(2)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；(3)重组类人胶原蛋白的诱导和表达；(4)重组类人胶原蛋白的纯化。上述步骤(1)中所述毕赤酵母基因工程菌的构建如下a.将人体已知的I型和III型胶原蛋白基因螺旋区的一段基因分别抽提出来，然 后进行缝合，重组DNA;b.选用毕赤酵母SMD1168株作为宿主细胞，将重组DNA转入并整合到宿主细胞的 基因组中，筛选得到毕赤酵母基因工程菌(巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris C13)；该毕 赤酵母基因工程菌已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮 政编码100101)，保藏编号为CGMCC No. 4437。上述步骤O)中所述毕赤酵母基因工程菌的发酵培养过程如下挑取毕赤酵母基 因工程菌单菌落，置于装有30mL BMGY培养基的150mL三角瓶中，于 30°C，250rpm 300rpm培养至0D600为2. 0 6. 0，室温下1500g 3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培 养基重悬菌体，使重悬后的菌体0D600为1. 0 ；将重悬菌体所得的菌液置于500mL的三角瓶 中，用四层纱布封口，于 30°C、250rpm 300rpm的摇床上继续培养；每Mh向培养 基中添加无水甲醇，无水甲醇的添加量为培养基总体积的1%。上述步骤(4)所述重组类人胶原蛋白的纯化过程为培养的毕赤酵母基因工程菌经过离心分离后收集上清液，收集的上清液经层析柱SlOO除去颜色物质和腥味，再经脱盐 柱G75去掉多余的盐分，脱盐后超滤浓缩，收集蛋白冷冻干燥。上述的一种重组类人胶原蛋白的生产方法，所述重组DNA的序列如下
GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTGGAGTGTCTGGACCAAMGG TGATGCTGGC60
CMCCAGGAGAGMGGGATCGCCTGGTGCCCAGGGCCCACCAGGAGCTCC AGGCCCACTT120
GGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTCTTGCAGGACCACCAGGCAT GCCAGGTCCT180
AGGGGMGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCMGGGTGAMGTGGGAAACCAGG AGCTAACGGT240
CTCAGTGGAGMCGTGGTCCCCCTGGACCCCAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300
GGTGAACCTGGAAGAGATGGAMCCCTGGATCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
GGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540
CMGGCCCACGTGGTGACMAGGTGAAACAGGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAMGGA600
CATCGAGGATTCCCTGGTMTCCAGGTGCCCCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660
GGTGCMTCGGCAGTCCAGG ACCTGCAGAATTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCMG720
GGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCCCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780
GCTGGTCGTCCCGGTGMGCTGGTCTGCCTGGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840
AGCCCTGGTCCTGATGGCMAACTGGCCCCCCTGGTCCCGCCGGTCMGATGGTCGCCCC900
GGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTCAGGCTGGTGTGATGGGATT CCCTGGACCT960
AMGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020
GCTGTCGGTCCTGCTGGCMAGATGGAGAGGCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080
GGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACMGGCCCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140
CCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGMGCAGGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200
GACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAAGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260
GGTGTGCMGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTCCCCGAGGGGCCMCGGTGCTCCCGGCMC1320
GATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTGGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380
CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
CCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTCGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620
GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
AMGGCGMCCTGGTGATGCTGGTGCTAAAGGCGATGCTGGTCCCCCTGG CCCTGCCGGA1740
CCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTMTGTTGGTGCTCCTGGAGCCM AGGTGCTCGC1800
GGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTTTCCCTGGTGCTGCTGGCCG AGTCGGTCCT1860
CCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGMGGC1920
GGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGCTGGACGTCCTGGTGMGTTGGTCCCCCT1980
GGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAMGGATCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040
CCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100
CAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGTGMCCTGGCAMCAA2160
GGTCCCTCTG GAGCMGTGG TGAACGTGGT CCCCCTGGTC CCATGGGCCC CCCTGGATTG 2220GCTGGACCCC CTGGTGMTC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGMGG TTCCCCTGGA 2280CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CMGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC TGGACCCCCT 2340GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCM GAGTGGTGAT 2400CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CGCCCGTGGC 2460CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC MGGGTGAGA CAGGCGMCA GGGCGAC2517本发明与现有技术相比具有以下优点本发明采用毕赤酵母真核表达系统大规模 生产重组类人胶原蛋白，它与传统的大肠杆菌表达体系相比具有以下优点1、本发明的表达载体利用醇氧化酶基因启动子，细胞生长速度快，所以该表达系 统表达的外源蛋白产量很高，其表达量比其它系统高10倍甚至100倍，这在表达量方面是 一大突破，在发酵罐中的表达量可达到5. Og/L，单个批次50升罐可生产粗蛋白150g左右， 粗蛋白纯度在80 %以上，杂蛋白很少。2、本发明的培养基采用无机盐，配制简单、价格低廉。3、本发明的表达载体不是以游离的质粒存在，而是整合在染色体上，构建的菌株 十分稳定。4、本发明的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其氨基酸组成与天然 胶原蛋白氨基酸序列相应部分100%相同，同天然胶原蛋白相比，具有相近的结构和生物活 性，无需变性和复性，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、 化妆品等领域。下面结合附图和实施例，对本发明技术方案做进一步的详细说明。
图1为本发明载体pPIC9K-C03al-C0lal构建的路线图谱。图2为本发明菌落PCR鉴定重组毕赤酵母的电泳图。图3为本发明pPIC9K-C03al-C0lal重组毕赤酵母诱导表达后的电泳图。
具体实施例方式一种重组类人胶原蛋白，其序列(SEQ ID NO. 1)如下AGNTGAPGSP GVSGPKGDAG QPGEKGSPGA QGPPGAPGPL GIAGITGARGRGSPGPQGVK GESGKPGANG LSGERGPPGP QGLPGLAGTA GEPGRDGNPGPGGKGDRGEN GSPGAPGAPG HPGPPGPVGP AGKSGDRGES GPAGPAGAPGQGPRGDKGET GERGMGIKG HRGFPGNPGA PGSPGPAGQQ GAIGSPGPAEGPAGERGSPG PAGPKGSPGE AGRPGEAGLP GAKGLTGSPG SPGPDGKTGPGPPGPPGARG QAGVMGFPGP KGMGEPGKA GERGVPGPPG AVGPAGKDGEGPAGERGEQG PAGSPGFQGL PGPAGPPGEA GKPGEQGVPG DLGAPGPSGAGVQGPPGPAG PRGANGAPGN DGAKGDAGAP GAPGSQGAPG LQGMPGERGAGDAGPKGADG SPGKDGVRGL TGPIGPPGPA GAPGDKGESG PSGPAGPTGAGPPGPAGFAG PPGADGQPGA KGEPGDAGAK GDAGPPGPAG PAGPPGPIGNGSAGPPGATG FPGMGRVGP PGPSGNAGPP GPPGPAGKEG GKGPRGETGP
LAGPPGMPGP60SDGLPGRDGS120PAGSRGAPGP180FGADGVAGPK240PGPAGQDGRP300AGAQGPPGPA360RGERGFPGER420AGLPGPKGDR480RGAPGDRGEP540VGAPGAKGAR600AGRPGEVGPP660
GPPGPAGEKG SPGADGPAGA PGTPGPQGIA GQRGVVGLPG QRGERGFPGL PGPSGEPGKQ 720GPSGASGERG PPGPMGPPGL AGPPGESGRE GAPGAEGSPG RDGSPGAKGD RGETGPAGPP 780GAPGAPGAPG PVGPAGKSGD RGETGPAGPA GPVGPVGARG PAGPQGPRGD KGETGEQGD 839该重组类人胶原蛋白的结构为单链、单螺旋结构，其氨基酸为839个，其中1-241 为III型肽段，242-839为I型肽段。该重组类人胶原蛋白的生产方法包括以毕赤酵母SMD1168为出发菌株，进行毕赤酵母基因工程菌的构建；毕赤酵母基 因工程菌的发酵培养和诱导；重组类人胶原蛋白的提纯，获得目的蛋白。
0103]所涉及的培养基组成分别为0104]YPD培养基0105]酵母浸出粉10g/L胰蛋白胨20g/L0106]葡萄糖20g/L。0107]BMGY培养基0108]酵母浸出粉10g/L胰蛋白胨20g/L0109]ρΗ6· 0磷酸钾缓冲 赚 1OOmmo1/LYNB13. 4g/L0110]Biotin0. 2mg/L甘油10mL/L。0111]BMMY培养基0112]酵母浸出粉lOg/L胰蛋白胨20g/L0113]ρΗ6· 0磷酸钾缓冲 赚 IOOmmo1/LYNB 13.lg/L0114]Biotin0. 2mg/L甲醇 IOmL/ZL。0115]一、毕赤酵母基因工程菌的构建0116](一)、重组表达载体的构建0117]从新生儿胎盘组织中提取RNA，反转录获得cDNA ；根据GenBank已发表的人胶原
蛋白I型和III型基因序列，按照引物设计原则，利用PrimerPremier 5. 0和DNAMAN软件， 设计 col Ial 和 col3al 基因 PCR 扩增引物 Fl (SEQ ID NO. 3), Rl (SEQ ID NO. 4)，F2 (SEQ ID NO. 5)、R2 (SEQ IDNO. 6)，引物序列分别为Fl :5，-CTGGCGCAGA TGGTGTTG-3，；Rl 5，-CCACGGTGAC CCTTTATGC-3，。F2 :5’ -GAATCTGTGA ATCATGCCCT AC-3’ ；R2 :5， -GAAGTCATAA TCTCATCGGT GTT—3，。将I型和III型胶原蛋白基因螺旋区部分扩增出来并且在基因的两头用合适的 酶切位点做成接头得到重组DNA，并缝合到毕赤酵母表达载体PPIC9K中获得重组表达载体 pPIC9K-co3al-colal ；该重组 DNA 的序列(SEQID N0. 2)如下GCGGGTAACA CTGGTGCTCC TGGCAGCCCT GGAGTGTCTG GACCAAMGG TGATGCTGGC 60CMCCAGGAG AGMGGGATC GCCTGGTGCC CAGGGCCCAC CAGGAGCTCC AGGCCCACTT 120GGGATTGCTG GGATCACTGG AGCACGGGGT CTTGCAGGAC CACCAGGCAT GCCAGGTCCT 180AGGGGMGCC CTGGCCCTCA GGGTGTCMG GGTGAMGTG GGAAACCAGG AGCTAACGGT 240CTCAGTGGAG MCGTGGTCC CCCTGGACCC CAGGGTCTTC CTGGTCTGGC TGGTACAGCT 300GGTGAACCTG GAAGAGATGG AMCCCTGGA TCAGATGGTC TTCCAGGCCG AGATGGATCT 360
CCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAMTGGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420
CATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480
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CTTCAGGGAATGCCTGGTGA ACGTGGTGCAGCTGGTCTTCCAGGGCCTMGGGTGACAGA1440
GGTGATGCTGGTCCCAMGGTGCTGATGGCTCTCCTGGCAMGATGGCGTCCGTGGTCTG1500
ACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTGGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAMGTGGT1560
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GGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCCCCCCTGGTGCTGACGGCCA ACCTGGTGCT1680
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CGTGGTGAGACTGGTCCTGCTGGTCCCGCCGGTCCTGTCGGCCCTGTTGGCGCCCGTGGC2460
CCCGCCGGACCCCAAGGCCCCCGTGGTGACMGGGTGAGACAGGCGMCAGGGCGAC2517( 二)、大量制备重组质粒 pPIC9K-co3al_colal将载体菌株在含有卡那霉素抗性的培养基上培养20个小时左右、8000r/min离心 10分钟，去掉上清，用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
(三)、pPIC9K-co3al_colal 质粒的线性化取限制性内切酶Sail 10 μ L，pPIC9K-co3al_colal 质粒 20 μ g 左右，加入 100 μ L buffer H，加水补足到1000 μ L后混勻，37°C水浴消化5h，终止反应前先取出5 μ L反应液， 以0. 7%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，酶切完全后，用质粒提取试剂盒对线性化质粒 进行质粒提取。提取完成时，线性化质粒的体积要在10 μ L以上，浓度为1. 0μ g/μ L以上。 用去离子水溶解，用于下一步的电转化。(四)、转毕赤酵母方法1.毕赤酵母感受态细胞的制备挑取毕赤酵母(SMD1168)单菌落，接种至含有5mL YPD培养基试管中，30°C， 250rpm 300rpm培养过夜；取50 μ L的培养物接种至含有50mL新鲜YPD培养基的300mL 三角瓶中，28°C 30°C，250rpm 300rpm培养过夜，至0D600值达到1. 1 1. 3 ；将细胞培 养物于4°C，1500g离心5min，用50mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；重复离心之后按 照相同方法用20mL的冰预冷的lmol/L山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，离心，用0. 3mL的冰预 冷的lmol/L山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为0. 5mL,分装为80 μ L —份，-70°C 保存。2.毕赤酵母的电转化将感受态细胞解冻并冰浴，将10 μ g左右的线性化DNA与80 μ L的毕赤酵母感受 态细胞混勻，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，在电压为1. 5kV，电容为25 μ F，电阻为200 Ω 条件下电击4msec IOmsec ；电击完毕后，加入ImL冰预冷的lmol/L山梨醇溶液将菌体混 勻形成菌悬液，转至1. 5mL离心管中；将菌悬液涂布于MD平板上，每100 μ L 200 μ L涂布 一块平板，然后置于30°C培养箱倒置培养。3.多拷贝插入重组子的筛选(1)在生长有转化子的MD平板表面加入2mL灭菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器 在His+转化子表面轻轻涂刮，并转移到50mL离心管中；(2)向步骤(1)中所述离心管中加入20mL灭菌双蒸水稀释，混勻后测定0D600值 (10D600 = 5X 107cells/mL)；(3)取IO5个转化子涂布于含有0. 5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30°C培养 72h 96h ；(4)在无菌96孔板中每孔加入200 μ L YPD液体培养基；(5)用接菌牙签往步骤⑷中所述96孔板中分别接入步骤(3)中培养获得的转化 子，混勻，于30°C培养48h;(6)取一块新的无菌96孔板，每孔加入190yL YPD液体培养基，然后在相应孔中 加入10 μ L步骤(5)中96孔板所得的培养物，于30°C培养24h ；(7)再取一块新的无菌96孔板，每孔加入190yL YPD液体培养基，在相应孔中加 AlOyL步骤(6)中96孔板所得的培养物，于30°C培养24h ；(8)分别从步骤(7)中的96孔板中取出1 μ L培养液，点在含有1. Omg/mL和 4. 0mg/mL G418的YPD平板上，于30°C培养96h 120h，毕赤酵母SMD1168转化子若能 在含越高浓度G418的培养基上生长，说明该转化子含有越多拷贝的目的基因，即有多个 pPIC9K-co3al-colal片断转化进了毕赤酵母SMD1168并整合到毕赤酵母SMD1168的染色体上，经过这一步筛选得到的高拷贝的重组毕赤酵母将更有可能实现目的蛋白的高效表达。4.菌落PCR鉴定重组毕赤酵母挑取待测毕赤酵母转化子，按下述方法进行PCR模板的预制(1)挑取高拷贝转化子的单菌落，置于装有200 μ L去离子水的1.5mL离心管中， 2000g离心5min，弃上清；(2)将装有菌体的离心管置于微波炉中档加热aiiin，然后转移到-80°C冰冻 5min ；(3)再置于微波炉中档加热aiiin后转移到_80°C冰冻5min，最后再移至微波炉中 档加热2min ；(4)向步骤(3)中加热后的离心管中加入30 μ L去离子水，于IOOOOg离心Imin, 吸取上清作为PCR反应的模板；(5)使用 9k-coll 鉴定引物 F(SEQ ID NO. 7)、R(SEQ ID NO. 8)，进行 PCR 扩增；其 中9k-coll鉴定引物序列为F 5' -GCTGAAGCTG TCATCGGTTA CTCA-3，；R 5，-TCGCTCTCCA GCCTTGCCG-3，。(6)PCR结束后，进行琼脂糖电泳检测，在1155bp左右出现条带的，可以初步确定 为阳性转化子。(五)、蛋白表达分析将从高抗性平板(含G418的YPD平板)上筛选到的并且经过验证的阳性菌株按 照如下程序进行诱导表达实验将阳性菌株接种于5mL YPD培养基，30°C培养12h，然后转接入20mLBMGY培养基 中，30°C，250rpm培养12h，4000rpm离心IOmin后倒掉上清，用无菌水清洗菌体，4000rpm离 心lOmin，加入适量的BMMY培养基使菌液的0D600为1. 0，在30°C，250rpm条件下，甲醇诱 导120h(每隔24h添加培养基总体积的的甲醇)，按时间点分别取菌液样品，取样量为 1.011^，置于1. 5mL离心管中，常温，12000rpm离心5min，收集上清，时间点一般取:12h,24h, 36h、48h、60h 和 72h。(六)、重组类人胶原蛋白N端测序将收集的上清纯化后进行SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，并以考马斯亮 蓝G-250染色得单一条带，可见分子量在100KD，比理论分子量大，将重组蛋白转至PVDF膜 上并剪下进行N端测序，对N端氨基酸进行测定的结果为A-G-N-T-G，与基因设计一致。(七)、重组类人胶原蛋白质谱分析将纯化后的上清用AXIMA-CFR plUS基质辅助激光解吸附电离飞行质谱仪测得 的类人胶原蛋白分子量为74019. 02，与计算分子量74213. 9相对误差为-0.沈％，准确度 < 士0. 5%。(八)、DNA序列分析提取阳性菌株基因组，以此为模板，采用PCR方法扩增重组类人胶原蛋白基因，扩 增产物经过纯化进行DNA测序分析，PCR方法扩增的重组DNA测定结果与基因设计一致，确 定该阳性菌株为毕赤酵母基因工程菌(巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris C13，保藏编号为 CGMCC No. 4437)。
二、毕赤酵母基因工程菌的发酵培养和诱导挑取毕赤酵母基因工程菌单菌落，置于装有30mL BMGY培养基的150mL三角瓶中， 于 28°C 30°C、250rpm 300rpm培养至 0D600 为 2 6 ；室温下 1500g 3000g 离心 5min， 收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使重悬后的菌体0D600为1. 0 ；将重悬菌体所得的菌液 置于500mL的三角瓶中，用四层纱布封口，于28°C 30°C，250rpm 300rpm的摇床上继续 培养；每24h向培养基中添加无水甲醇至培养基中，无水甲醇的添加量为培养基总体积的 1% ；按时间点分别取菌液样品，取样量为l.OmL，置于1.5mL离心管中，常温，12000rpm离 心5min，收集上清，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间，时间点一般取12h、24h、 36h、48h、60h和72h，待检测样品于-70 V保存备用。三、重组类人胶原蛋白的提纯分离纯化工艺将培养的毕赤酵母基因工程菌菌液经过离心分离后收集上清液，上清液经层析柱 SlOO除去颜色物质和腥味，再经脱盐柱G75去掉多余的盐分，脱盐后超滤浓缩，收集蛋白冷 冻干燥。本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因I型和III型的螺旋区中精选水溶性、稳 定性强的核苷酸序列，将这两段基因插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高 表达毕赤酵母基因工程菌，经过发酵罐大规模发酵分泌表达及一系列的纯化步骤，得到高 纯度的重组类人胶原蛋白。实验证明该法生产的重组类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳 定性，由于其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100%相同，所以应用于人体当中不会 造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。该发明获得的类人胶原蛋白 表达量高，纯化方便，在发酵罐中的表达量可达到5. Og/L,单个批次50升罐可生产粗蛋白 150g左右，由于表达量高，粗蛋白纯度在80%以上，杂蛋白很少，只有毕赤酵母常见的副产 物以及腥味等需要去除，这样给纯化带来很大的方便。本发明采用的是分泌型表达载体，成 功实现了重组类人胶原蛋白的分泌型表达，表达产物分泌在上清液中，方便纯化，具有其他 重组类人胶原蛋白生产所不具备的优势，便于规模化生产操作。由于载体电转入毕赤酵母 之后，基因整合在毕赤酵母基因组上，所以重组菌的稳定性好，经过多次传代基因不容易发 生流失并能保持高效表达的性状，能够很好的实现稳定生产，毕赤酵母生产方法为好氧发 酵，菌体密度高，表达量还有很大的提升空间。图1是载体pPIC9K-C03al-C0lal的构建路线图co3al表示III型胶原蛋白螺 旋区部分基因，colal表示I型胶原蛋白螺旋区部分基因，pPIC9k表示毕赤酵母表达载体。 co3al 和 pPIC9k 经双酶切之后(Xho I 和 EcoR I 双切)连接成 pPIC9k-co3al，pPIC9k_co3al 和colal用EcoRl单酶切之后连接成pPIC9k-co3al_colal，为最终表达载体。图2是菌落PCR鉴定重组毕赤酵母的电泳图经过G418不同浓度的反复筛选，最 终在高浓度4. Omg/mL条件下筛选到9个高拷贝重组子，并对其进行菌落PCR鉴定，结果显 示，9个重组子都能扩增出约1155bp左右的片段，说明重组子筛选结果正确。图3是pPIC9K-C03al-C0lal重组毕赤酵母诱导表达后的电泳图挑选高拷贝重组 子菌株摇瓶发酵，在甲醇诱导发酵后，分别在24h、36h、48h、60h和72h取样，SDS-PAGE电泳 分析，显示与预测的C03al-C0lal基因所表达的蛋白的表观分子量为lOOKDa，比理论分子 量大，发酵至60h表达量已达到最高，而且条带单一，基本无其它杂蛋白，便于后期的纯化。
权利要求
1. 一种重组类人胶原蛋白，其特征在于，其序列如下AGNTGAPGSPGVSGPKGDAGQPGEKGSPGAQGPPGAPGPLGIAGITGARGLAGPPGMPGP60RGSPGPQGVKGESGKPGANGLSGERGPPGPQGLPGLAGTAGEPGRDGNPGSDGLPGRDGS120PGGKGDRGENGSPGAPGAPGHPGPPGPVGPAGKSGDRGESGPAGPAGAPGPAGSRGAPGP180QGPRGDKGETGERGAAGIKGHRGFPGNPGAPGSPGPAGQQGAIGSPGPAEFGADGVAGPK240GPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRP300GPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPA360GPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGER420GVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDR480GDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEP540GPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGAR600GSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPP660GPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQ720GPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPP780GAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGD839所述重组类人胶原蛋白的结构为单链、单螺旋结构 ，其氨基酸为839个，其中1-241 为III型肽段，242-839为I型肽段。
2.—种生产如权利要求1所述的重组类人胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法包括 以下步骤(1)毕赤酵母基因工程菌的构建；(2)毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；(3)重组类人胶原蛋白的诱导和表达；(4)重组类人胶原蛋白的纯化。
3.根据权利要求2所述的一种重组类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(1)中 所述毕赤酵母基因工程菌的构建如下a.将人体已知的I型和III型胶原蛋白基因螺旋区的一段基因分别抽提出来，然后进 行缝合，重组DNA ；b.将重组DNA转入并整合到毕赤酵母的基因组中，筛选得到毕赤酵母基因工程菌。
4.根据权利要求2所述的一种重组类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(2)中 所述毕赤酵母基因工程菌的发酵培养过程如下挑取毕赤酵母基因工程菌单菌落，置于装 有30mL BMGY培养基的150mL三角瓶中，于 30°C，250rpm 300rpm培养至0D600为 2. 0 6. 0，室温下1500g 3000g离心5min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使重悬后 的菌体0D600为1. 0 ；将重悬菌体所得的菌液置于500mL的三角瓶中，用四层纱布封口，于 30°C、250rpm 300rpm的摇床上继续培养，每Mh向培养基中添加无水甲醇；所述 无水甲醇的添加量为培养基总体积的1%。
5.根据权利要求2所述的一种重组类人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，步骤(4)所 述重组类人胶原蛋白的纯化过程为培养的毕赤酵母基因工程菌经过离心分离后收集上清 液，收集的上清液经层析柱SlOO除去颜色物质和腥味，再经脱盐柱G75去掉多余的盐分，脱 盐后超滤浓缩，收集蛋白冷冻干燥。
6.根据权利要求3所述的一种重组乡DNA的序列如下GCGGGTAACACTGGTGCTCCTGGCAGCCCTCAACCAGGAGAGAAGGGATCGCCTGGTGCCGGGATTGCTGGGATCACTGGAGCACGGGGTAGGGGAAGCCCTGGCCCTCAGGGTGTCAAGCTCAGTGGAGAACGTGGTCCCCCTGGACCCGGTGAACCTGGAAGAGATGGAAACCCTGGACCTGGTGGCAAGGGTGATCGTGGTGAAAATCATCCAGGCCCACCTGGTCCTGTCGGTCCAGGCCCTGCTGGCCCTGCTGGTGCTCCCGGTCAAGGCCCACGTGGTGACAAAGGTGAAACACATCGAGGATTCCCTGGTAATCCAGGTGCCGGTGCAATCGGCAGTCCAGGACCTGCAGAAGGTCCCGCTGGTGAACGTGGTTCTCCTGGCGCTGGTCGTCCCGGTGAAGCTGGTCTGCCTAGCCCTGGTCCTGATGGCAAAACTGGCCCCGGACCCCCAGGCCCACCTGGTGCCCGTGGTAAAGGTGCTGCTGGAGAGCCCGGCAAGGCTGCTGTCGGTCCTGCTGGCAAAGATGGAGAGGGTCCCGCTGGCGAGAGAGGTGAACAAGGCCCTGGTCCTGCTGGTCCTCCAGGTGAAGCAGACCTTGGCGCCCCTGGCCCCTCTGGAGCAGGTGTGCAAGGTCCCCCTGGTCCTGCTGGTGATGGTGCTAAGGGTGATGCTGGTGCCCCTCTTCAGGGAATGCCTGGTGAACGTGGTGCAGGTGATGCTGGTCCCAAAGGTGCTGATGGCACTGGCCCCATTGGTCCTCCTGGCCCTGCTCCCAGCGGCCCTGCTGGTCCCACTGGAGCTGGTCCCCCCGGCCCTGCTGGCTTTGCTGGCAAAGGCGAACCTGGTGATGCTGGTGCTAAACCCGCTGGACCCCCTGGCCCCATTGGTAATGGCAGCGCTGGTCCCCCTGGTGCTACTGGTCCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCAAAGGTCCCCGTGGTGAGACTGGCCCTGGTCCCCCTGGCCCTGCTGGCGAGAAAGGACCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTCAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTGGTCCCTCTGGAGCAAGTGGTGAACGTGGT人胶原蛋白的生产方法，其特征在于，所述重组GGAGTGTCTGGACCAAAAGGTGATGCTGGC60CAGGGCCCACCAGGAGCTCCAGGCCCACTT120CTTGCAGGACCACCAGGCATGCCAGGTCCT180GGTGAAAGTGGGAAACCAGGAGCTAACGGT240CAGGGTCTTCCTGGTCTGGCTGGTACAGCT300TCAGATGGTCTTCCAGGCCGAGATGGATCT360GGCTCTCCTGGTGCCCCTGGCGCTCCTGGT420GCTGGAAAGAGTGGTGACAGAGGAGAAAGT480CCTGCTGGTTCCCGAGGTGCTCCTGGTCCT540GGTGAACGTGGAGCTGCTGGCATCAAAGGA600CCAGGTTCTCCAGGCCCTGCTGGTCAGCAG660TTCGGCGCAGATGGTGTTGCTGGTCCCAAG720CCTGCTGGCCCCAAAGGATCTCCTGGTGAA780GGTGCCAAGGGTCTGACTGGAAGCCCTGGC840CCTGGTCCCGCCGGTCAAGATGGTCGCCCC900CAGGCTGGTGTGATGGGATTCCCTGGACCT960GGAGAGCGAGGTGTTCCCGGACCCCCTGGC1020GCTGGAGCTCAGGGACCCCCTGGCCCTGCT1080CCTGCTGGCTCCCCCGGATTCCAGGGTCTC1140GGCAAACCTGGTGAACAGGGTGTTCCTGGA1200AGAGGCGAGAGAGGTTTCCCTGGCGAGCGT1260CCCCGAGGGGCCAACGGTGCTCCCGGCAAC1320GGAGCTCCCGGTAGCCAGGGCGCCCCTGGC1380GCTGGTCTTCCAGGGCCTAAGGGTGACAGA1440TCTCCTGGCAAAGATGGCGTCCGTGGTCTG1500GGTGCCCCTGGTGACAAGGGTGAAAGTGGT1560CGTGGTGCCCCCGGAGACCGTGGTGAGCCT1620CCCCCTGGTGCTGACGGCCAACCTGGTGCT1680GGCGATGCTGGTCCCCCTGGCCCTGCCGGA1740GTTGGTGCTCCTGGAGCCAAAGGTGCTCGC1800TTCCCTGGTGCTGCTGGCCGAGTCGGTCCT1860GGCCCTCCTGGTCCTGCTGGCAAAGAAGGC1920GCTGGACGTCCTGGTGAAGTTGGTCCCCCT1980TCCCCTGGTGCTGATGGTCCTGCTGGTGCT2040GGACAGCGTGGTGTGGTCGGCCTGCCTGGT2100CCTGGCCCCTCTGGTGAACCTGGCAAACAA2160CCCCCTGGTCCCATGGGCCCCCCTGGATTG2220GCTGGACCCC CTGGTGAATC TGGACGTGAG GGGGCTCCTG GTGCCGAAGG CGAGACGGTT CTCCTGGCGC CAAGGGTGAC CGTGGTGAGA CCGGCCCCGC GGTGCTCCTG GTGCTCCTGG TGCCCCTGGC CCCGTTGGCC CTGCTGGCAA CGTGGTGAGA CTGGTCCTGC TGGTCCCGCC GGTCCTGTCG GCCCTGTTGG CCCGCCGGAC CCCAAGGCCC CCGTGGTGAC AAGGGTGAGA CAGGCGAACA TTCCCCTGGA2280TGGACCCCCT2340GAGTGGTGAT2400CGCCCGTGGC2460GGGCGAC251全文摘要
本发明公开了一种重组类人胶原蛋白，该类人胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。本发明还公开了该重组类人胶原蛋白的生产方法，包括毕赤酵母基因工程菌的构建；毕赤酵母基因工程菌的发酵培养；重组类人胶原蛋白的诱导和表达；重组类人胶原蛋白的纯化。采用本发明方法生产的类人胶原蛋白表达量高，纯化方便，在发酵罐中的表达量可达到5.0g/L，单个批次50升罐可生产粗蛋白150g左右，由于表达量高，粗蛋白纯度在80％以上，杂蛋白很少。
文档编号C12N1/19GK102146135SQ20101060211
公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者侯增淼, 张凤龙, 聂苏秦 申请人:陕西九州生物医药科技园发展有限公司