用于生产胶原蛋白膜的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生产具有特定的机械性能的胶原蛋白膜的方法。特别地，本发明 涉及一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括用足够的无机盐和阴离子表面活性剂处理含 胶原蛋白的组织以产生特定的机械性能。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白和其衍生的产品广泛用于含胶原蛋白的可植入支架的生产中。胶原蛋白 被公认为是具有低抗原性、可生物降解，并具有良好的机械、止血和细胞结合性能的材料 (Sheu et al. , (2001), Biomaterials, 22(13) :1713-9 ；Pieper et al. , (2002), Biomater ials, 23(15):3183-92 ；Chvapil et al., (1973), Int Rev Connect Tissue Res. ,6:1-61； Pachence (1996), J. Biomed. Mater. Res. ；33(I):35-40 ；and Lee et al., (2001), Int J Pharm. ;221 (1-2) : 1-22)，这使得它可以用来暂时地或永久地代替或修复组织。胶原蛋白支 架通常被用作基底，细胞在它的上面能够增殖和分化，并最终被正常组织所取代。
[0003] 然而，公知的是当植入时，含有胶原蛋白的支架能够应激炎症和/或纤维 症（fibrosis)。例如，参见 Wisniewski et al.，（2000)，J. Anal Chem. ;366 (6-7) (p.611-621)。因而，含胶原蛋白的支架通常进行化学或物理处理（交联）以赋予机械强度 和耐酶（胶原酶）降解的抗性。一些交联的策略已被用于含胶原蛋白的材料上。戊二醛是 最广泛使用的交联剂（Sheu et al·，（2001) supra ;Barbani et al·，（1995)，J Biomater. Sci.Polym. Ed. ;7(6) :461-9)。然而，由于交联的副产品的存在和在酶降解过程中戊二 醛连接的胶原肽的释放，戊二醛和其反应产物与体内细胞毒性相关联（Huang-Lee et al., (1990), J Biomed Mater Res. , 24(9):1185-201 ；van Luyn et al. , (1992), Biomater ials, 13(14) :1017-24)。
[0004] 为了避免戊二醛交联的胶原蛋白在体内的细胞毒性，几种可供选择的化合物已 被作为潜在的胶原蛋白交联剂进行研宄（Khor (1997)，Biomaterials, 18(2) :95-105 ;Sung et al. (1996)，Biomaterials;17(14) :1405-10)，如聚环氧，六亚甲基二异氰酸醋（HMDI)， 1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基）碳二亚胺（EDC)和紫外线（UV)或γ射线照射。Koob et al·，（2001)，J Biomed Mater Res. ,56 (1):31-48 表明，去甲二氢愈创木酸（NDGA)能够 显著提高合成的胶原蛋白纤维的机械性能。此外，还表明，在体内的6周期间，NDGA交联的 胶原蛋白纤维没有引起异物反应也没有刺激免疫反应。
[0005] 然而，尽管有所有的这些优点，使用交联的胶原蛋白以及天然胶原蛋白仍存在问 题。因此，仍然需要一种具有以下性能的含有胶原蛋白的支架：
[0006] a)孔，以有利于组织整合和血管形成的方式相互连接；
[0007] b)生物降解性和/或生物吸收性，使得正常组织最终取代所述支架；
[0008] c)表面化学，促进细胞附着、增殖和分化；
[0009] d)强度和柔韧性；以及 [0010] e)低抗原性。
[0011] 对含胶原蛋白的组织的替代具有特定需要的一个领域是鼓膜（TM)穿孔的修复。 如果不加以处理，TM穿孔可导致听力损失、复发性耳漏、可能的中耳感染和后天胆脂瘤 (Parekh et al.，（2009), The Laryngoscope ;119:1206_1213)。虽然大多数急性鼓膜穿 孔自行愈合，大或慢性TM穿孔，尤其是慢性化脓性中耳炎，经常无法愈合且可能需要移植 术（Lindeman et al. , (1987), Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery ； 113:1285)〇
[0012] 目前，外科手术方法如鼓膜成形术被认为是对TM穿孔的最有效和可靠的治 疗(Sheehy et al. , (1980), The Annals of otology, rhinology, and laryngology ； 89:331 ；Karela et al. , (2008), European Archives of Oto-Rhino-Laryngology ； 265:1039-1042)。各种自体移植（autologous)和异体移植，如肌肉筋膜，软骨，软 骨膜和脱细胞异体真皮（AlloDerm)已被使用，但是，它们都有自己的局限性（Levin et al·，（2009)，Expert review of medical devices ;6:653_664)。例如，颞肌筋膜 (temporalis fascia)，它被认为是"黄金标准"，在调整情况下与供区的发病率、附加切 口、长的操作时间和材料的短缺有关（Levin et al.，（2009), supra)。迄今为止，一系列 异种移植物和合成材料，包括明胶海绵（Gelfoam? )(Abbenhaus, (1978) ,Otolaryng ology ;86:0RL485)、纸贴（paper patch)(Golz et al. , (2003), Otolaryngology-Head and Neck Surgery ;128:565)和透明质酸衍生物（Teh et al·, (2011), Expert Opinion on Biological Therapy ;1-14)已被作为合适的支架以支持TM的再生进行了研宄。然 而，作为用于不同类型的穿孔的最佳材料，很少有证据来支持这些中的任意一个。此外， 由于包括血清素的残余的异种细胞组分，一些市售异种移植物例如猪小肠粘膜下层，含有 异种的DNA材料且能够引起炎症反应。此外，合成材料是不可生物降解的，并且相比于正 常的TM，它们的生物力学和材料特性是不同的，这可能会影响长期的听觉功能（Levin et al.，（2009)，supra)。因此，一直在不断的研宄更好的材料以获得改善的愈合和听力。
【发明内容】
[0013] 本发明提供了一种生产含有胶原蛋白的组织的方法，与其他含有胶原蛋白的组织 相比，当被植入时，该含有胶原蛋白的组织具有降低的炎症和/或纤维症。在一些实施方式 中，含有胶原蛋白的组织是不交联的。
[0014] 因此，第一方面，本发明提供了一种生产胶原蛋白膜的方法，该方法包括以下步 骤：
[0015] (i)分离含有胶原蛋白的组织，并在乙醇溶液中进行孵育；
[0016] (ii)在含有无机盐和阴离子表面活性剂的第一溶液中孵育来自步骤（i)的所述 含有胶原蛋白的组织以变性其中含有的非胶原蛋白；
[0017] (iii)在含有无机酸的第二溶液中孵育在步骤（ii)中产生的所述含有胶原蛋白 的组织，直至在所述材料中的胶原蛋白变性；以及
[0018] (iv)在含有无机酸的第三溶液中孵育在步骤（iii)中产生的所述含有胶原蛋白 的组织，伴随同时发生的足够时间的机械刺激以使得在所述含有胶原蛋白的组织中的胶原 蛋白束对齐（align);
[0019] 其中，所述机械刺激包括对含有胶原蛋白的组织周期地（cyclically)施加张力。
[0020] 应当理解的是，在第一溶液中可以使用任何无机盐，只要它能够与路易斯酸形成 复合物。在一些实施方式中，所述无机盐选自由三甲基氯化铵、四甲基氯化铵、氯化钠、氯化 锂、高氯酸盐和三氟甲磺酸酯组成的组。在其他实施方式中，所述无机盐是氯化锂（LiCl)。
[0021] 在第一溶液中可以使用任何数量的阴离子表面活性剂，在一些实施方式中，所述 阴离子表面活性剂选自由烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐组成 的组。特别有用的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠（SDS)。
[0022] 在一些实施方式中，所述第一溶液含有约1 % (V/V)的SDS和约0· 2 % (V/V)的 LiClo
[0023] 在一些实施方式中，在所述第二溶液中的所述无机酸含有约0.5% (V/V)的HC1， 同时，在所述第三溶液中的所述无机酸含有约1 % (V/V)的HCl。
[0024] 本领域技术人员应当理解的是，在三个步骤的每个步骤中的孵育期将会根据如下 内容进行变化：（i)含有胶原蛋白的组织的类型；（ii)无机盐/无机酸和/或阴离子表面 活性剂的类型；（iii)使用的每种无机盐/无机酸和/或阴离子表面活性剂的强度（浓度） 以及（iv)孵育的温度。在一些实施方式中，在步骤（i)中的孵育期至少为8小时。在其他 实施方式中，在步骤（ii)中的孵育期少于60分钟，而在其他实施方式中，在步骤（iii)中 的孵育期至少为20小时。
[0025] 在一些实施方式中，在步骤（ii)中的孵育是在约4°C下进行的。在其他实施方式 中，在步骤（ii)中的孵育至少进行12小时。
[0026] 在一些实施方式中，所述第二溶液含有约0. 5 % (V/V)的HCl。
[0027] 在一些实施方式中，步骤（iii)中的孵育进行约30分钟。在其他实施方式中，步 骤（iii)中的孵育进行时伴随振荡。
[0028] 在一些实施方式中，所述第三溶液含有约1% (V/V)的HCl溶液。
[0029] 在一些实施方式中，步骤（iv)中的孵育进行约12小时至36小时，优选为约24小 时。在其他实施方式中，步骤（iv)中的孵育进行时伴随振荡。
[0030] 在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括在步骤（iii)和步骤（iv)之间的中 和步骤，所述中和步骤包括用约0.5% (V/V)的NaOH孵育所述含有胶原蛋白的组织。
[0031] 在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括步骤（V)，所述步骤（V)包括用丙酮 孵育来自步骤（iv)的含有胶原蛋白的组织，然后干燥所述含有胶原蛋白的组织。
[0032] 在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括在步骤（ii)和步骤（iii)之间和/ 或在步骤（iii)和步骤（iv)之间的将所述含有胶原蛋白的组织与甘油接触的步骤，以可视 化和促进脂肪和/或血管的去除。
[0033] 所述甘油可以与含有胶原蛋白的组织接触大量的时