于耳镜和ABR评估。在五只大 鼠的这些亚组中，三只用于组织学评价，另外两个分别用于SEM和ΤΕΜ。
[0151] 耳镜观察
[0152] 为了研宄TM愈合建立了 TM穿孔的急性大鼠模型。在用于耳镜观察的 每个时间点从每个组中随机选取5只大鼠，耳镜观察为在全身麻醉下使用数字视 频耳镜（MedRX，Largo, FL)。两名独立的观察者就穿孔闭合、感染、鼓膜的相关性 (myringosclerosis)、肉芽组织和增厚观察TM。每个TM穿孔被分级为完全闭合或未闭合。 只有已完全闭合的TM被认为是愈合。使用Auris view软件（澳大利亚耳科学研宄所（Ear Science Institute Australia),苏比亚克（Subiaco)，澳大利亚）记录数字图像。
[0153] 用SEM评价TM在通过支架修复后的愈合过程。简言之，将大鼠 TM试样在4°C 用2. 5%戊二醛固定过夜，在乙醇溶液中脱水，随后通过临界点干燥（HCP-2,日立，东京，日 本）。最后，将样品涂覆5nm厚的铂，在SEM下观察TM的内侧表面。
[0154] 外科手术的所有大鼠均存活且无术后并发症。通过耳镜观察TM的外侧面以评价 在每个时间点移植的效果。在任何大鼠中均没有观察到感染或反常的迹象。
[0155] 在对照组中，穿孔后TM变厚且不透明，具有突出的临近穿孔边缘可见的微血管。 通过14天，TM变得越来越透明且多数穿孔已经完全闭合。28天时，所有的穿孔完全愈合， 尽管在穿孔部位观察到类似于乳白色环的可见的疤痕。Tympocol?的半透明度允许直接观 察TM的愈合。在整个愈合过程中，Tympocol?保持了它的结构稳定性并很好的粘附至TM 剩余部分。与对照组相比，TM和微血管的乳浊化是较不明显的。在早至移植后的第7天穿 孔已愈合，其中，愈合的TM表现正常。与此相反，纸贴和Gelfoan^是不透明的，从而使得 在愈合期间难以检查中耳。此外，这些材料趋于容易从愈合的TM脱离。特别是，随着时间 的推移，大部分Gelfoam*萎缩且其多孔结构丢失。在28天，在纸贴组和Gelfoam?组中的 TM出现愈合，但有一些疤痕。
[0156] 以下牺牲个别时间点，通过使用耳显微镜观察获得的TM的内表面证实了穿孔的 闭合。在Tympocol?组中的TM愈合明显比其他组更快（图10)。60% (3/5)的Tympocol? 治疗的耳完全愈合，但在对照组中没有耳痊愈（0/5) (p〈0. 05)。9天后，在Tympocol?组和纸 贴组中的所有五只大鼠中，TM完全愈合，与对照组相比，这是显著不同的（2/5) (p〈0. 05)。 在14天，在对照组中除了一个TM，所有的耳完全愈合（4/5)。手术后28天，所有的TM已经 完全愈合。
[0157] 组织学评价
[0158] 以下的牺牲，两个外耳在骨软骨交界处被分离，且TM连同骨环从鼓泡被除去。获 得的样品在10%的中性福尔马林缓冲液中固定24小时，接着在10%的乙二胺四乙酸溶液 (EDTA) (pH值为7. 4)中脱钙两个星期至三个星期。脱钙的TM在一系列分级醇中脱水，包埋 在固体石蜡中并横向切片为4 μπι的厚度。使用苏木精和伊红（H&E)染色对所有的部分进 行评价。进行马森（Masson)三色染色以检查胶原蛋白纤维的形态。使用艾普瑞尔扫描系 统 XT 自动滑动扫描仪（Aperio ScanScope XT automated slide scanner)(艾普瑞尔科技 有限公司，Vista系统，CA ;40x/0. 75平面复消色差镜头（Plan Apoobjective))对所有染 色切片进行数字化扫描。图像保存为TIFF格式用于进行组织学评价。使用艾普瑞尔显示 软件（Aperio ImageScope Viewer software)测量14天和28天的愈合的TM部分的TM厚 度。
[0159] 对TM愈合的组织学和四种支架的效果的检查超过了 28天。与其他组相比，在对 照组中的TM愈合相对较慢。在第一周中，穿孔保持显露（patent)，虽然在TM的上皮和结 缔组织（CT)层中观察到增生。在第5天，看到角蛋白骨刺，且在第9天穿孔开始闭合且伴 随有在3个TM层中明显变厚。在28天，愈合的TM变薄而在先前的穿孔部位变厚并伴随残 留。发现具有松散堆积的胶原蛋白纤维的CT层是杂乱无章的（图8)。
[0160] 在Tympocol?治疗组中，在早期阶段，上皮增生和血管增殖是明显的。在CT层中 类似于成纤维细胞的浸润细胞是大量的，且在移植的周围有偶尔的淋巴细胞。在28天，愈 合的TM具有三片层结构表现正常（图8)。
[0161] 与此相反，在纸贴周围观察到很多的炎症细胞（主要是淋巴细胞）和明显的渗出 液。虽然TM穿孔最终痊愈，TM变厚且伴有新合成的纤维的混乱（图8)。同样地，Gelfoam? 诱导炎症细胞在植入部位的浸润。不像其他的材料，在CT层中发现明显的成纤维细胞增殖 及红细胞填充的血管。28天后，愈合的TM仍然变厚且在CT层中伴有非典型混乱的胶原蛋 白纤维（图8)。
[0162] TM横切片用于定量治疗后TM厚度的变化（图8)。在14天，与正常的TM(p〈0. 05) 相比，除了 SFS处理的TM，所有组的TM大体上都变厚，其中，SFS处理的TM具有与正常TM 相似厚度的（14. 13±4. 04 μm) (p>0. 05)。在28天，在对照组、纸贴组和Gelfoam?组中发 现TM厚度上有统计学上的显著差异（p〈0. 05)。然而，在Tympocol?组（8. 55±4. 25 μ m)与 正常TM之间没有看到TM厚度上有统计学上的显著差异（p>0. 05)。
[0163] 透射电子显微镜（TEM)
[0164] 用TEM研宄修复后28天的愈合TM的微观结构。简要地说，剥离之后，将获得的TM 样品的穿孔部位在2. 5%的戊二醛中固定并在4°C下储存过夜。将组织标本进行洗涤，后固 定（1%锇酸），脱水和包埋以用于透射观察。切割薄的横切片并用TEM(TECNAI 10,飞利浦 公司，荷兰）在80KV下进行观察。
[0165] 进行TEM观察以研宄手术后28天的愈合TM的超微结构。在Tympocol?治疗和自 发愈合的TM中，与正常TM相比，CT层适度增厚且成纤维细胞积累是明显的。在Tympocol? 组中，TM的三个层易于识别且CT层是致密的具有良好导向的胶原蛋白束。然而，在纸贴组 和Gelfoam?组中，胶原蛋白纤维在纤维层中松散、不规则地排列，具有明显的可见的水肿。
[0166] 用SEM观察TM的内侧面以评价支架附着、与支架的细胞整合和穿孔闭合。在整 个愈合过程中Tympocol?表现出稳定附着至穿孔边缘，从而保持它们的支架功能。TM上皮 细胞横跨伤口边缘迀移并粘附至第5天的Tympocol?的内表面。第9天，Tympocol ?组的 TM已愈合且新膜的内表面是光滑的。与此相反，纸贴组表现出从TM表面的早期局部分离， 但它的支架功能部分丢失。在纸贴组中，在穿孔部位渗出物形成和炎症细胞浸润是明显的。 GeIfoamA表明了其海绵结构的早期解体。随着收缩和吸收的进行，大多数Gelfoam?溶 解，导致其支持功能的丧失。在14天，在纸贴组和Gelfoam?组中的愈合的TM表现出一些 疤痕。在对照组中没有支架植入，在第9天未愈合的TM的轧制穿孔边缘是可见的。在14 天时TM最终愈合，但有明显的疤痕。
[0167] 听性脑干反应（ABR)
[0168] 为了评价移植后大鼠的听力，在一个隔音房间内使用日本光电Neuropack-μ测 量系统（ΜΕΒ-9100,日本光电，日本）进行ABR。如前所述，在测试前将大鼠麻醉。将铂皮下 针电极插入到头皮顶点（活性电极）、两个乳突（参比电极）和鼻尖上（接地电极）。通过 插入式耳机呈现0.1 ms持续时间的测试刺激（点击）。从90-至0分贝声压级（SPL)以10 分贝递减，动物呈现刺激强度级数。在每个系列的刺激中超过IOms的分析周期平均共有 512个应答。阈值定义为引起典型的波形III或波形IV形态的可重现的ABR波形的最低强 度。在所有大鼠的右耳TM穿孔前和穿孔后以及在对来自每组的五只动物鼓膜成形术后的 每个时间点测量点击刺激的听觉阈值。正常的耳和TM穿孔且没有材料的耳作为对照组。
[0169] 听力阈值在测量穿孔前（p>0. 05)以及穿孔后（p>0. 05)的所有治疗组中是类似 的。正常大鼠的平均听觉阈值是15. 0分贝，在穿孔后显著上升到29. 5分贝，表明TM穿孔引 起显著的听力损失（Ρ〈〇· 01)。对于所有治疗后的组，使用ABR的听力评价证明听力恢复（图 9)。听力恢复定义为穿孔后（修复前）立即的听觉阈值和移植后（修复后）特定时间点的 听觉阈值之间的差。随着时间的推移，所有大鼠的听觉阈值恢复，且当比较不同的治疗方法 时，观察到显著的差异（P〈〇.〇l)。最明显的是，与用纸贴（P〈〇.〇l)、Gelfoam? (ρ〈〇.〇1) 和自发愈合（P〈〇.〇l)治疗相比，用Tympocol?治疗的动物的听力恢复得明显更快。
[0170] 统计分析
[0171] 通过耳镜观察确定的愈合率（Healing rates)使用卡方（X 2)检验进行比较。对 于ABR和TM厚度的统计分析使用单向方差分析（ANOVA)进行评价，而随着时间的推移，每 组中的听力恢复使用多元线性回归分析进行。所有分析均使用统计软件R(版本2. 11. 1，包 元）执行。统计显著性定义为P〈〇. 05。
[0172] 结论
[0173] 这项研宄表明：与两种常用的支架（纸贴和Gelfoam? )和在大鼠模型中自发愈 合相比，本发明的胶原蛋白膜（Tympocol?)明显缩短了穿孔闭合时间，并促进了 TM伤口愈 合。在Tympocol?组中的愈合的TM显示致密的胶原蛋白纤维的再生的改进的形态，迅速返 回到正常的TM厚度，以及与其他组相比的在更早阶段的完全的听力恢复。由于用于TM穿 孔的手术治疗的目标是实现穿孔的完全闭合和听力的恢复，这些结果表明Tympocol?是有 效的，且将成为一种理想的支架以恢复TM愈合和听力。
[0174] 支架的生物相容性是要考虑的一个重要因素，因为应用生物材料后的炎性 反应可以导致在手术中的失败。另外，已知胶原蛋白引起极小的炎性和抗原反应 (Pachence, (1996)，J.biomed. Mat. Res. ;33:35_40)。在这项研宄中，Tympocol?加快并改 善TM愈合，部分归因于在植入部位的极小的炎症反应。
[0175] 在这项研宄中，我们发现，与其他组相比，Tympocol?实现明显更快的听力恢复。我 们假定这些改善是由愈合的TM的胶原蛋白纤维的改善的组织和早期重塑引起的，以实现 与正常的TM可媲美的厚度。
[0176] 在手术过程中，发现Tympocol?很容易操作，因为它不像