动物或无脊椎动物（例如海星，海胆，海绵等）。在一些实施方式中， 所述胶原蛋白为鱼、鲨鱼、鳐（skate)或魟（ray)胶原蛋白。在另一种实施方式中，所述胶 原蛋白为人、马、牛、羊、猪、犬或猫胶原蛋白。在一种示例性的实施方式中，所述胶原蛋白为 牛胶原蛋白。
[0109] 本发明的含有胶原蛋白的组织或支架是在体温下在体外和体内都能保持稳定至 少4周的。
[0110] 在本文中使用术语"修复"或其在语法上的等同术语以覆盖在哺乳动物优选人的 组织缺陷的修复。"修复"是指足以至少部分地填充组织缺陷部位的空隙或结构不连续性的 新组织的形成。然而，修复并不意味着或需要完全愈合或治疗的过程，这是在恢复组织缺陷 至其缺陷前的生理上/结构上/机械状态上100%有效的。
[0111] 术语"组织缺陷"或"组织缺陷部位"是指上皮细胞、结缔组织或肌肉组织的破坏。 组织缺陷导致组织处在非理想的水平或非理想的状态中。例如，组织缺陷可以是腱的部分 厚度或全厚度的撕裂或归因于心肌梗塞的局部细胞死亡的结果。组织缺陷能够假设为"空 隙"的结构，这应理解为表示三维缺陷，例如，在上皮细胞、结缔组织或肌肉组织的结构的完 整性中的间隙、空腔、空穴或其它实质的破坏。在某些实施方式中，所述组织缺陷不能内源 性或自发性修复。组织缺陷能够是事故、疾病和/或手术操作的结果。例如，软骨缺陷可以 是关节创伤如撕裂的半月板组织替换进入关节的结果。组织缺陷也可以是退化性疾病如骨 关节炎的结果。
[0112] 通常地，本发明的所述胶原蛋白膜将被植入在组织缺陷的部位并通过本领域技术 人员所公知的任意常规方法固定在对的位置，例如，缝合、缝合锚钉、骨固定装置和骨或可 生物降解的聚合物螺丝。
[0113] 在本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物通过引用将其全 部内容包括所有附图和表格并入本发明，以达到它们不与本说明书的明确教导相矛盾的程 度。
[0114] 以下是举例说明用于实施本发明的步骤的实施例。这些实施例不应被解释为限制 性的。除非另有说明，所有的百分比都以重量计，所有的溶剂混合物比例均为体积比。
[0115] 实施例1用于制各胶原蛋白腊的方法
[0116] 仔细地分离来自猪内部器官衬里的胶原蛋白部分，并放入含有约70%的乙醇的溶 液中，并使其在室温下短暂地孵育。然后将所述含有胶原蛋白的组织在工作表面的上面拉 伸至多脂肪的面朝上，并尽可能多的除去脂肪组织和血管。
[0117] 为了使脂肪组织可见，在含有胶原蛋白的组织上涂布甘油约10分钟。在该点的胶 原蛋白是透明的，但脂肪组织是白色的。在解剖显微镜下我们使用镊子从所述胶原蛋白分 离白色的脂肪组织。
[0118] 当完成时，将所述含有胶原蛋白的组织小心地转移至密封的容器中，并在含有约 1% (V/V)的SDS和0.2% (V/V)的LiCl的溶液中孵育，以变性非胶原蛋白类蛋白质。所述 孵育为在4 °C下放置过夜。
[0119] 然后在100%丙酮中将所述含有胶原蛋白的组织小心地洗涤两次，以除去变性的 非胶原蛋白类蛋白质。然后在200ml容器中将所述组织在IOORPM下离心以缓慢降速来自 所述含有胶原蛋白的组织的残留溶液、非胶原蛋白类蛋白质和核酸。
[0120] 小心地除去所述含有胶原蛋白的组织，并在膜Steripure?水中再洗涤3次。
[0121] 有时，在所述含有胶原蛋白的组织在100RPM下离心90分钟后，在含有NaOH :NaCl 的溶液中洗涤所述组织。
[0122] 然后将所述含有胶原蛋白的组织浸入0.5% (V/V)HC1中并放置在振荡器中振荡 30分钟以变性所述胶原蛋白。我们发现，为了避免损坏由此产生的组织的机械结构，HCl的 浓度和孵育时间是非常重要的。
[0123] 然后除去所述含有胶原蛋白的组织，并在Steripure?水中再洗涤3次。
[0124] 然后用0. 5% (V/V)的NaOH中和所述含有胶原蛋白的组织。在此阶段，可以进行 对由此产生的含有胶原蛋白的组织的力学性能的初步测试。
[0125] 然后使用不锈钢框架的机械力（压缩和拉伸）操作所述含有胶原蛋白的组织。一 旦所述含有胶原蛋白的组织被拉伸到合适的大小、厚度等，所述组织在原位变性，即在所述 框架内，在含有1% (V/V)HCl的溶液中浸渍。通常情况下，将所述组织在100RPM下振荡孵 育22-25小时，直至胶原蛋白纤维束已经对齐。
[0126] 然后用水洗涤所述含有胶原蛋白的组织并用1% (V/V)的SDS和0.2% (V/V)的 LiCl的混合物进行漂洗。
[0127] 根据最终用途，在所述含有胶原蛋白的组织上重新涂布甘油10分钟以使任何残 留的脂肪组织可见。如上所述，在解剖显微镜下使用手术钳从所述胶原蛋白分离剩余的白 色脂肪组织。在此阶段中，任何额外的胶原蛋白束也被除去，以控制所述含有胶原蛋白的组 织的厚度。
[0128] 最后，仍然在框架内被拉伸的同时，用丙酮处理所述含有胶原蛋白的组织并进行 空气干燥，以使对齐的胶原蛋白束固定。然后拉伸、压缩和/或卷起所述含有胶原蛋白的组 织，以形成光滑的表面。然后检查成品胶原蛋白膜组织，并使用激光切割机切割成一定的尺 寸。
[0129] 用扫描电镜表征与其他类型的膜相比的胶原蛋白膜的表面形态。简单地说，用5nm 厚的铂对组织样品进行溅射镀膜（SEM涂层单元，E1020,日立科学系统有限公司，日本），并 在低电压（20千伏）下用扫描电子显微镜（S260,莱卡，剑桥，英国）观察两面。
[0130] 图1显示的是由本发明的方法生产的胶原蛋白膜与其他的膜相比的表面形态 (Tympacol?指的是本文中的ACS)。扫描电子显微镜显示了三个支架的表面形态（板 A-C ;X500, D ;X200)。Tympacol?(图1中指的是ACS)拥有两个不同的表面，以致密的胶 原蛋白束为特征的光滑的表面（板A)，和以疏松的胶原蛋白纤维的多孔表面为特征的粗糙 的表面（板B)。纸贴（膜）表面是不平坦的，具有少量的小孔（板C)。Gelfoam?显示不 同尺寸的大量的孔（板D)。比例尺：500 μπι。
[0131] 图2显示的是由上述方法生产的胶原蛋白膜的扫描电子显微镜（SEM)图像 (Χ100)〇
[0132] 图3显示的是由路特普制药有限公司（雪莱，纽约、美国）（Luitpold Pharmaceuticals, Inc, Shirley)市售的可用的生物支架（"Bi〇-gide?"）的扫描电子显微 镜（SEM)图像（X200)。由此可以看出，在Tympacol?中的胶原蛋白束排列比Bio-gide?均 匀。
[0133] 图4显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gide?比较的 平均最大负荷的条形图。
[0134] 图5显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gide?比较的 最大负荷的平均延伸的条形图。
[0135] 图6显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gide?比较的 平均负荷率的条形图。
[0136] 图7显示的是表明由本发明的方法生产的胶原蛋白膜和市售的Bio-gide?比较的 平均延伸率的条形图。
[0137] 结论
[0138] 我们发现，与处理含有胶原蛋白的组织的传统的碱-酸的方法相比，上述方法具 有如下优点：
[0139] 1)用含有1%的SDS和0. 2%的LiCl的溶液进行的孵育能够变性并去除公知的与 其他可植入的膜引起炎症反应的非胶原蛋白蛋白质和核酸。
[0140] 2)甘氨酸涂层能够从含有胶原蛋白的组织分离脂肪组织，如果不除去脂肪组织， 会引起组织的灵活性的问题。
[0141] 3)使用HCl并且连同孵育时间使我们能够生产具有合适的机械性能的膜，而无需 使用交联剂如戊二醛。
[0142] 4)当被固定至框架时施加于胶原蛋白膜的机械力使我们能够重新排列对于特殊 结构的形成必需的胶原蛋白束和纤维。
[0143] 5)对在含有胶原蛋白的组织中的胶原蛋白束的方向的宏观和微观检验显示了使 组织在植入研宄中更有用的胶原蛋白束结构取向。
[0144] 实施例2与其灾腊相比的胶原蛋白腊的表征
[0145] 与市售的膜相比较，在临床试验中使用由实施例1中的方法生产的Tympocol?的 40ym厚的样品。市售的广品包括：
[0146] 1)纸贴，获自卷烟纸（Tally Ho,澳大利亚帝国烟草（Imperial Tobacco Australia)，澳大利亚），大约为20 μ m厚，白色且不透明；
[0147] 2) Gelfoam& (可吸收的明胶海绵，法玛西亚普强公司（Pharmacia&Up john Inc)，纽约，美国），是一种高度吸收的、非弹性的约4mm厚且具有在30-700 μ m之间变化的 孔径大小的海绵（Rohanizadeh et al·，（2008)，J. Materials Science ;19:1173-1182) 〇
[0148] 雄性斯普拉格-道利（Sprague-Dawley)大鼠，体重250-300克，根据机构动物 伦理批准被用于临床试验。在此之前的研宄中，用S5模型耳显微镜（蔡司（Zeiss)，德 国）对所有动物进行检查以确保它们是没有中耳病。动物被随机分为四个支架修复组，即 Tympocol?组（η = 30)，纸贴组（η = 30)，G elfoaiT^:组（η = 30)和对照组（自愈）（η = 30)。此外，10只大鼠 （η = 10)的组被分配作为正常对照组（没有任何穿孔或支架）。
[0149] 所有的外科手术过程在肌内注射氯胺酮（80mg/kg)和美托咪定（0. 5mg/kg)的全 身麻醉下进行。使用3. Omm耳窥器除去来自外耳道的碎片且外耳道为用聚维酮碘溶液准备 好的。经外耳道的方法（transcanal approach)在鼓膜紧张部后半部（in the posterior half of the pars tensa)使用无菌23号针进行双侧鼓膜（TM)穿孔，测得直径约为I. 8mm。 然后将四种不同的材料修剪成片（直径为2. 4mm)，用IX磷酸盐缓冲盐水溶液（pH值为 7. 4)(英骏（Invitrogen)，中国上海）漂洗，并使用嵌体鼓膜修补术移植至右边的TM穿孔 上。左耳作为没有移植材料放置在穿孔的TM上的内部对照。所有大鼠给予皮下注射丁丙 诺啡（0. 02-0. 08mg/kg)用于术后镇痛。
[0150] 不同治疗组的TM愈合通过耳镜检查、扫描电子显微镜（SEM)、组织学和透射电子 显微镜（TEM)进行评价，而听力功能通过听性脑干反应（ABR)进行分析。在各组中，在术后 第3、5、7、9、14和28天随机选择相同的五只大鼠 （η = 5)用