专利名称：膜联蛋白a3在检测酒精性肝纤维化中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及膜联蛋白A3在检测酒精性肝纤维化中的用途，具体涉及膜联蛋白A3作为检测酒精性肝纤维化分子标志的用途。
背景技术：
现代医学研究发现，酒精性肝纤维化表现为肝脏内的慢性炎症及进行性肝组织纤维化，随着病程的进展会导致酒精性肝纤维化，是长期酗酒患者死亡的主要原因。有统计显示，酗酒(酒精滥用和酒精依赖)已经成为当今世界一个重要的公共卫生问题；在美国，67%的成年人有饮酒习惯，7.4%的成年人酗酒，每年大约有10万人死于酗酒；而在我国，随着人们生活水平的提高和社交的日益频繁，酒精性肝纤维化的发病率逐年增加，严重威胁国人的健康；同时，酒精性肝纤维化患者的预后不容乐观，4 5年存活率仍然很低。酒精诱导的肝损伤是引起肝纤维化的一个重要原因，虽然肝纤维化的临床表现目前已归类较为清晰明确，但其早期诊断率，特别是酒精性肝纤维化发生早期阶段的诊断仍有待提闻。目前，关于酒精因素是如何诱发肝纤维化的过程，最终导致肝纤维化发生，其中的分子机制研究尚很缺乏。现已有研究表明，酒精能导致肝细胞膜、线粒体和细胞核的变化。酒精能引起肝细胞膜通透性的改变，使细胞膜的透性增加，同时导致细胞膜结构上的缺陷(Molleken, Sitek et al.2009),且酒精还能导致细胞表面的磷脂总量增加，引起细胞表面电荷密度升高和脂质过氧化物酶体的增多(Szachowicz-Petelska, Dobrzynska etal.2008)。当前还有研究发现,酒精还能通过激活caspase-9和caspase-3途径来启动细胞的凋亡(Dan，Popov et al.2005)。因此，酒精影响肝细胞的机制是非常复杂的，需要利用高通量的办法寻找在酒精性肝纤维化发生、发展过程中的标志分子，从而为深入阐述酒精性肝纤维化的发病机制，最终筛选和开发以治疗和诊断为目的的酒精性肝纤维化相关差异表达的基因或/和蛋白质，本领域迫切需要新的在酒精性肝纤维化中差异表达的基因或/和蛋白质。膜联蛋白A3 SwissProt的登录号为ANXA3_RAT，细胞质膜上有分布，其为膜联蛋白家方矣成员之一(参见 http://myhits.vital-1t.ch/cg1-bin/view sea entry name =sw:ANXA3_RAT&view_sw = UniProt);该蛋白家族在细胞生长和信号转导方面发挥调节作用。所述的膜联蛋白A3的功能在于抑制磷脂酶A3裂解成肌醇I，2-循环磷酸盐和1-磷酸肌醇，同时在抗凝血方面也发挥作用。迄今为止，尚未见有关膜联蛋白A3与酒精性肝纤维化直接或间接相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供膜联蛋 白A3的新的用途，具体涉及膜联蛋白A3用作检测酒精性肝纤维化的分子标志的用途。本发明的另一个目的在于提供膜联蛋白A3特异性的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，该特异性的抗体在制备检测酒精性肝纤维化制剂中的用途。本发明的再一个目的在与提供一种抗膜联蛋白A3的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，在制备检测酒精性肝纤维化试剂盒中的用途。本发明通过筛选在酒精性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中差异表达的蛋白质，获得一种在酒精性肝纤维化和正常肝脏非实质细胞中存在差异表达的蛋白质(酒精性肝纤维化细胞中低表达)，经质谱鉴定为膜联蛋白A3 ;进一步的免疫印迹实验证实，该蛋白质在酒精性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中存在蛋白质表达水平的差异(酒精性肝纤维化细胞中表达下调)；基于膜联蛋白A3与酒精性肝纤维化的相关性，以该蛋白的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测酒精性肝纤维化。本发明的目的通过下述技术方案实行:本发明以改良的蔗糖密度梯度离心的方法收集离体实验动物正常肝脏和酒精性肝纤维化的肝非实质细胞，裂解获得细胞蛋白质后，以蛋白质二维凝胶电泳的方法分离蛋白质，通过ImageMaster软件分析表达差异的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质进行质谱鉴定，结果显示，膜联蛋白A3在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中低表达；免疫印迹反应实验进一步证实，膜联蛋白A3在肝纤维化的肝非实质细胞中的低表达；实验结果表明，膜联蛋白A3可作为酒精性肝纤维化的分子标志，对其表达量进行检测可以用来检测酒精性肝纤维化；进一步，可制备检测酒精性肝纤维化制剂。本发明中，采用蔗糖密度梯度离心的方法首先分离肝非实质细胞，再以酶解的方式获得肝非实质细胞的质膜蛋白质；本发明中，通过二维凝胶电泳方法分离裂解得到的蛋白质,通过ImageMaster 2DPlatinum 6.0软件分析,筛选得到差异表达的蛋白质，用戴安纳升级液相色谱Ultimate3000串联高容量离子阱 质谱(LC-MS/MS)进行分离鉴定；实验鉴定获得14种非冗余蛋白质在正常肝脏和酒精性肝纤维化肝脏的非实质细胞中差异表达，其中包括在肝纤维化的肝非实质细胞中表达降低的膜联蛋白A3表达量；质谱分析获得的膜联蛋白A3的鉴定情况结果如表I所示。表1:膜联蛋白A3的详细鉴定结果
权利要求
1.膜联蛋白A3在制备检测酒精性肝纤维化制剂中的用途。
2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的用途是检测膜联蛋白A3在肝非实质细胞中的表达量，所述的膜联蛋白A3为酒精性肝纤维化的检测分子标志。
3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的用途是检测膜联蛋白A3在肝非实质细胞中转录是否存在下调。
4.膜联蛋白A3的特异性的抗体在制备检测酒精性肝纤维化制剂中的用途。
5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的特异性的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
6.抗膜联蛋白A3的抗体在制备检测酒精性肝纤维化试剂盒中的用途。
7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抗膜联蛋白A3的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
8.—种体外检测酒精性肝纤维化肝非实质细胞中膜联蛋白A3表达异常的方法，其特征在于，其包括步骤: (1)采用特异性抗体检测待检肝非实质细胞中膜联蛋白A3蛋白的数量； (2)将步骤(I)所得到的数量与正常肝脏肝非实质细胞中膜联蛋白A3的数量进行比较；测得的结果低于正常值，表示被检样本中膜联蛋白A3的表达异常。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及膜联蛋白A3在检测酒精性肝纤维化中的用途。本发明通过筛选在酒精性肝纤维化和正常肝脏的肝非实质细胞中存在差异表达的蛋白，获得在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中低表达的蛋白质——膜联蛋白A3(ANXA3)，经免疫印迹实验进一步证实了所述ANXA3在酒精性肝纤维化的肝非实质细胞中有较低的表达水平。实验结果证实，所述的膜联蛋白A3可作为分子标志用作检测酒精性肝纤维化；所述的膜联蛋白A3的特异性的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，可用于制备检测酒精性肝纤维化制剂；所述的抗膜联蛋白A3的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，可用于制备检测酒精性肝纤维化试剂盒。
文档编号G01N33/68GK103116028SQ20111036618
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者张丽军, 袁正宏, 马芳, 贾小芳, 姚亚敏, 刘晓茜 申请人:上海市公共卫生临床中心