专利名称：检测发酵液多糖浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测发酵液多糖浓度的方法。
背景技术：
多糖是自然界含量最丰富的高分子化合物，其在自然界分布极其广泛，高等植物、 藻类、菌类及动物体内均有存在，多糖类物质所具有的多种生物学及药理功能已经引起人们的高度重视，多糖科学作为后基因组时代异军突起的学科已纳入国际前沿研究领域，多糖具有自身无光学功能团，其分子量在一定范围内变化等特点，无法直接用高灵敏的紫外、 荧光或质谱检测器检测多糖含量，目前，常用的多糖含量检测方法主要有显色法、同位素标记法、免疫学法、生物检定法等，显色法检测限约10微克，具有专属性差等缺点；同位素标记法、免疫学法及生物检定法检测限均可小于10纳克，但均不能同时测定代谢产物，同位素标记法不适用于人体的药代研究，且标记可能改变多糖结构，具有抗原决定簇的代谢片断可能增加免疫学法的误差等缺点；生物检定法需要找到灵敏的生化指标，具有应用范围非常有限等缺点，现有的多糖含量检测方法以及其它酶联免疫法在检测发酵液中荚膜多糖含量时具有不能直接检测，特异性不强，线性和检测的精密度和准确度较差等缺点。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种可直接测量，特异性强，线性和检测的精密度和准确度较好，可为发酵阶段工艺改进提高重要量化手段的检测发酵液多糖浓度的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现检测发酵液多糖浓度的方法，它包括以下步骤
(1)称取一定量的发酵液多糖样品置于干净的容器内，样品液的浓度为10 IOOpg/
ml ；
(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的浓度为0.5 1. 5ng/ml的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，用SDS-PAGE电泳进行纯度检测，待纯度为90%以上时，即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体，洗涤除去杂质；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标微孔板，制成兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体，洗涤除去未结合的抗体、杂质；
(4)往微孔板中逐渐加入发酵液多糖样品，加入完全后与用HRP标记的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，HRP的浓度为0. 5 1. 5ng/ml，洗涤除去未结合的抗原、杂质；
(5)将(4)中所得的固相抗体-抗原-酶标抗体复合物彻底洗涤，除去未结合的酶标抗体、杂质，加入TMB进行显色反应，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量呈正相关；
(6)用酶标仪在400 500nm波长下测定吸光度，通过标准曲线，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度。本发明的有益效果是本发明提供一种检测发酵液多糖浓度的方法，采用经高度纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标板，并制成酶标记复合物，在兔血清b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体分离纯化上，得到单抗，解决了发酵液荚膜多糖酶联免疫检测法特异性问题，克服了现有检测方法不能直接、正确检测发酵液多糖含量的不足，可直观、准确、迅速的检测发酵液中荚膜多糖的含量，可作为发酵工艺的重要监控手段，为发酵收罐时间的确定提供了重要的依据，同时为发酵工艺的改进提供了量化指标，间接降低了生产成本，保证了收率的稳定，具有可直接测量，特异性强，线性和检测的精密度和准确度均较好， 可为发酵阶段工艺改进提高重要的量化手段等优点。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1
检测发酵液多糖浓度的方法，它包括以下步骤
(1)称取一定量的发酵液多糖样品置于干净的容器内，样品液的浓度为10pg/ml；
(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的浓度为0.5ng/ml的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，用SDS-PAGE电泳进行纯度检测，待纯度为90%以上时，即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体，洗涤除去杂质；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标微孔板，制成兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体，洗涤除去未结合的抗体、杂质；
(4)往微孔板中逐渐加入发酵液多糖样品，加入完全后与用HRP标记的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，HRP的浓度为0. 5ng/ ml，洗涤除去未结合的抗原、杂质；
(5)将(4)中所得的固相抗体-抗原-酶标抗体复合物彻底洗涤，除去未结合的酶标抗体、杂质，加入TMB进行显色反应，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量呈正相关；
(6)用酶标仪在400nm波长下测定吸光度，通过标准曲线，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度。实施例2
检测发酵液多糖浓度的方法，它包括以下步骤
(1)称取一定量的发酵液多糖样品置于干净的容器内，样品液的浓度为100pg/ml；
(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的浓度为1.5ng/ml的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，用SDS-PAGE电泳进行纯度检测，待纯度为90%以上时，即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体，洗涤除去杂质；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标微孔板，制成兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体，洗涤除去未结合的抗体、杂质；
(4)往微孔板中逐渐加入发酵液多糖样品，加入完全后与用HRP标记的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，HRP的浓度为1. 5ng/ml，洗涤除去未结合的抗原、杂质；
(5)将(4)中所得的固相抗体-抗原-酶标抗体复合物彻底洗涤，除去未结合的酶标抗体、杂质，加入TMB进行显色反应，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量呈正相关；
(6)用酶标仪在500nm波长下测定吸光度，通过标准曲线，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度。 实施例3
检测发酵液多糖浓度的方法，它包括以下步骤
(1)称取一定量的发酵液多糖样品置于干净的容器内，样品液的浓度为50pg/ml；
(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的浓度为l.Ong/ml的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，用SDS-PAGE电泳进行纯度检测，待纯度为90%以上时，即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体，洗涤除去杂质；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标微孔板，制成兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体，洗涤除去未结合的抗体、杂质；
(4)往微孔板中逐渐加入发酵液多糖样品，加入完全后与用HRP标记的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，HRP的浓度为Ing/ ml，洗涤除去未结合的抗原、杂质；
(5)将(4)中所得的固相抗体-抗原-酶标抗体复合物彻底洗涤，除去未结合的酶标抗体、杂质，加入TMB进行显色反应，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量呈正相关；
(6)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度。
权利要求
1.检测发酵液多糖浓度的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)称取一定量的发酵液多糖样品置于干净的容器内，样品液的浓度为10 IOOpg/ml ；(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的浓度为0.5 1.5ng/ml的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，用SDS-PAGE电泳进行纯度检测，待纯度为90%以上时，即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体；(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体包被酶标微孔板，制成兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体；(4)往微孔板中逐渐加入发酵液多糖样品，加入完全后与用HRP标记的兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，HRP的浓度为0. 5 1. 5ng/ml ；(5)将(4)中所得的固相抗体-抗原-酶标抗体复合物彻底洗涤，除去未结合的酶标抗体、杂质，加入TMB进行显色反应，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，在酸的作用下转化成黄色，颜色的深浅和样品中的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖含量呈正相关；(6)用酶标仪在400 500nm波长下测定吸光度，通过标准曲线，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种检测发酵液多糖浓度的方法，它包括以下步骤(1)称取一定量的发酵液多糖样品；(2)收集经b型流感嗜血杆菌免疫的家兔血清，分离并用蛋白A亲和层析法纯化，待纯度为90%以上时即得兔b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗体；(3)用(2)中所得抗体包被酶标微孔板，制成固相抗体；(4)往微孔板中加入样品，并与用HRP标记的固相抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物；(5)彻底洗涤固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入TMB进行显色反应；(6)用酶标仪在400～500nm波长下测吸光度，计算样品中b型流感嗜血杆菌荚膜多糖浓度。本发明提供一种检测发酵液多糖浓度的方法，具有直接测量，特异性强等优点。
文档编号G01N33/543GK102507924SQ201110365639
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者曾令学, 朱琳, 朱聪, 李洪光, 杨襄诚, 罗芹, 赵丹, 赵涛, 陈克平, 韩炼 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司