人膜联蛋白v变体及其表达、制备和应用的制作方法

专利名称：人膜联蛋白v变体及其表达、制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程生物技术领域，涉及一种膜联蛋白V变体和所述膜联蛋白V变体的试剂制备和药学用途。
背景技术：
膜联蛋白V(Annexin V)属于膜联蛋白家族,此家族是一组进化上高度保守的、具有Ca2+和磷脂结合特性的蛋白质。它们在结构上具有同源性，被认为是Ca2+调节的膜结合组件。膜联蛋白家族功能上的相同点在于在Ca2+存在时，对酸性磷脂分子有高亲合力。人们在高等和低等真核生物中都发现存在有膜联蛋白家族的成员。膜联蛋白成员存在于很多不同的细胞类型中，它们的生化作用与免疫性质密切相关，参与抗凝、抗炎症过程，特别是细胞复制、分化及胞吐过程(Iwasaki A, Suda M, Nakao H, et al. Biochem, 1987,10 1261 ；Pollard H B，Haigler HT. Biol Chem, 1990,265 :21207)。该家族成员的生物学功能还待进一步的研究。尽管人们对成员的体内功能仍不甚了解，但普遍认为膜联蛋白与磷脂结合的活性是膜联蛋白家族体外活性的基础，并且与它们的生理性质紧密相关。目前，膜联蛋白V的应用主要集中在凋亡的检测。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, P⑶)，是细胞生命周期中的重要组成部分,是不同于坏死和意外死亡的由基因调控的细胞主动性死亡过程(Cohen JJ, Immunol Today, 1993,14(3) :126-130)。细胞凋亡是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，它也与多种疾病病理过程密切相关，在肿瘤的发生发展及放化疗、脑和心肌细胞缺血再灌注损伤和器官移植中的排斥反应等过程中，均可发现细胞凋亡现象及其变化。细胞凋亡是细胞主动参与的自身程序性死亡过程，涉及一系列生物分子及细胞形态学的改变，当细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸(PS)会发生翻转而暴露在细胞膜外面(Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA,Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. J Immunol, 1992,148(7) :2207-2216)，是细胞凋亡早期事件，发生在凋亡细胞形态学改变之前(Narula J, Strauss HW, 2003, J Nucl Med, 44 (3)397-399)，也是凋亡级联反应的初始事件，作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，从而进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核内DNA降解等。因此，外翻的PS是目前研究最多并最有希望和应用前景的凋亡检测靶点，可早期检测凋亡，具有较高的时效性(Bold RJ,Termuhlen PM, McConkey DJ, Surg Oncol, 1997,6(3) : 133-142)，国内外常利用同 PS 特异性结合的药物来检测细胞凋亡。由于对PS 具有特异的亲和性(Meers P, Mealy T. Biochemistry, 1993, 32 (43)11711-11721)，膜联蛋白V可以特异性地结合到正处于凋亡过程中的细胞表面，这样，膜联蛋白V可以用荧光蛋白或者放射性物质标记后用于凋亡细胞的检测。这种方法被广泛的应用于细胞分子生物学以及免疫学研究(Koopman G, Reutelingsperger C,Kuijten GA, et al. Blood,1994,84(5) :1415-1420 ；Vermes I, Haanen C, SteVens-NakkenH，et al. J Immunol Methods, 1995，184 (I) :39-510 ;Zhang G, Gurtu V, Kain SR, etal. Biotechniques,1997,23 (3) :525-531 ；Vriens Pff, Blankenberg FG, Stoot JH, etal.J Thorac Cardiovasc Surg,1998,116(5) :844-853 ；Boldt A, Barten MJ, Weiss C, etal. Cytometry A，2006，69 (3) :158-160)。将膜联蛋白 V 进行荧光素(如 FITC，PE 等)或生物素标记作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜检查细胞凋亡现象，是一种灵敏、高效、成熟的实验室检测方法。但是对于临床标本，除血液外，需要进行组织活检，具有创伤性，且在操作过程中也易引起凋亡的发生，从而影响分析结果。因此体内检测细胞凋亡需要探索新的方法。例如，用放射性核素标记膜联蛋白V行体内凋亡显像，实现细胞凋亡的活体无创显像，以实时监测体内凋亡的发生，这一类的凋亡显像在监测活体细胞凋亡的领域取得了较大进展。目前，放射性物质标记的重组膜联蛋白V在缺血性损伤的评估、异体移植排斥反应以及化疗药物对肿瘤治疗效果的评价等方面的应用正处于临床试验阶段(WatanabeH, Murata Y, Miura M, et al. Nucl Med Commun,2006,27(I) :81-89 ；Blankenberg FG,Kalinyak J, Liu L, et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006,14 :1-9)。放射性碘(*1)标记蛋白多肽类，虽然方法简便、成熟，可以保留其原有的生物活性，但适合体内显像的1231和1241供应比较困难。目前，以99mTc标记膜联蛋白V报道最多，99mTc的优点在于半衰期为6小时，可以及时显像，又使病人受的剂量较小，而且可以由Mo/Tc发生器方便的获得。然而，99mTc直接标记膜联蛋白V比较困难，标记率低，且在标记过程中会产生一些变性蛋白影响其在体内的放射性分布(Takei T, Kuge Y，Zhao S，et al. J Nucl Med，2004，45 (12)2083-2087)。因此，膜联蛋白V的99mTc标记以间接标记为主，常用的双功能鳌合剂有N-I-亚氨基-4-疏基丁基(Imino) (Kemerink GJ, Liem IH, Hofstra L, et al. J Nucl Med,2001,42(2) :382-387)、乙二胺半胱氨酸(EC) (Yang DJ, Azhdarinia A, Wu P，et al. CancerBiother Radiopharm, 2001,16(1) :73_83)、二硫二氮(N2S2、又称 BTAP) (Kemerink GJ,Boersma HH, Thimister Pff, et al. Eur J Nucl Med, 2001，28 (9) :1373-1378)等，以肼基烟酰胺(HYNIC)最为多见，并已在临床试用(Penn DL, Kim C，Zhang K，et al. Nucl MedBiol,37(1) :29-34 ；Rottey S,Siegers G,Van Belle S，et al. J Nucl Med,2006，47(11)1813-1818 ；Kartachova M, Haas RL, Olmos RA, et al.Radiother Oncol,2004,72(3)333-339 ；Kemerink GJ, Liu X, Kieffer D，et al.J Nucl Med,2003，44(6) :947-952)。利用不同双功能鳌合剂制备的标记物在体内的生物行为有较大差异，以Imino结合99mTc制备的标记物在肝、肾和脾有较高摄取，且在体内的生物半衰期比较长；以N2S2 (BTAP)制备的标记物在肝、肾、脾及下腹均有较高的摄取；以HYNIC制备的标记物虽然不经肠道排泄，而是经肾脏代谢，在肾脏和肝脏有较高放射性摄取，且其在体内生物半衰期较长(BoersmaHH, Kietselaer BL, Stolk LM, et al. J Nucl Med, 2005,46 (12) :2035-2050)。另外，这些间接标记方法复杂、产物需纯化，不易制成药盒，临床使用受到一定限制。最近的研究揭示膜联蛋白V在基因重组表达中经结构修饰后可有利于用99mTc直接进行标记。如张丽娜等人在膜联蛋白V蛋白质的N-端添加了 10个组氨酸(ZhangLN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology,2000,30 (4)305-312)。添加了 10个组氨酸的膜联蛋白V蛋白质获得了很好的表达、并且具有较好的体内外检测细胞凋亡的活性(Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry andBiotechnology,2000,30(4) :305-312 ;Ye F，Fang W，Wang F，et al. Nuclear Medicineand Biology, doi 10. 1016/j. nucmedbio. 2010. 11. 002 ;郑玉民,王自正，颜J玉等，中华核医学杂志，2008，28 (6) =378-382 ;宋丽萍，华子春，张欣等，中国临床医学影像杂志，2010，21 (1) :53-55 ;宋丽萍，华子春，张欣等，中国临床医学影像杂志，2010，21 (5) :358-360)。Tait JF等在N-端添加了 7个氨基酸，其中含1-2个半胱氨酸残基，得到的三种突变体，分别命名为膜联蛋白V-116，膜联蛋白V-117和膜联蛋白V-118 (Tait JF, Brown DSjGibsonDF,et al. Bioconjug Chem,2000,11(6) :918-925 ;Tait JF,Smith C，GibsonDF,BioconjugChem,2002,13(5) :1119-1123)，它们与膜的结合活性跟天然膜联蛋白V相一致，并且与99mTc-HYNIC-膜联蛋白V有比较相似的生物分布(Tai JF，Brown BS, United StatesPatent US7, 204, 972 B2)。三种膜联蛋白V变体都可在大肠杆菌细胞质中表达并被分离纯化，产物得率为 10mg/L(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, et al. Bioconjug Chem, 2000,11(6) :918-925 ；Tait JF，Smith C, Gibson DF,Bioconjug Chem,2002,13(5) :1119-1123;Tai JF, Brown BS, United States Patent US7, 204, 972 B2)。但是，重组膜联蛋白 V 在应用上存在着如下问题I.目前放射性物质标记的重组膜联蛋白V存在着标记效率低的缺点。同时，由于标记率低，且在标记过程中会产生一些变性蛋白，从而影响膜联蛋白V在体内的放射性分布。临床实验也发现膜联蛋白V主要分布于肾脏、肝脏以及脾脏(Rottey S，Van den Bossche B,Siegers G,Van Belle S,van de Wiele C,Q.J.Nucl. Med. Mol. Imaging, 2009,53(2) :127-32)。2.重组膜联蛋白V的生产方式产量偏低，不符合实际应用的需用。由于重组膜联蛋白V在大肠杆菌表达时经常以包涵体形式存在，为此国外有学者探索用酵母表达重组膜联蛋白V来解决其在大肠杆菌中表达易形成包涵体的难题。即使国际膜联蛋白V研究权威、美国Tait JF教授课题组在最新的研究工作及专利中在大肠杆菌表达并纯化了三种N-端增加了 7个氨基酸的重组膜联蛋白V变体，其产率也仅为10mg/L，未能满足实际应用的需求。其纯化过程包括超声破碎、细胞膜吸附和解离、Mono Q离子交换层析(洗脱溶液浓度0. 22M NaCl)、超滤和透析。而本专利发明人在10年前的前期研究中构建了一个添加了 10个组氨酸的膜联蛋白V，其标记效率显著提高、且标记方法简易，但其终产率仅为 7. 4mg/L(Zhang LN, Yang X, Hua ZC, Preparative Biochemistry and Biotechnology,2000,30(4) :305-312),表达水平与得率与美国Tait JF教授课题组最近构建的三种N-端增加了 7个氨基酸的重组膜联蛋白V变体的产率相近，从而显示出重组膜联蛋白V的生产存在着严重的瓶颈。

发明内容
为克服目前膜联蛋白V蛋白及其变体存在的生产及标记两方面的难题，本发明的目的在于提供一种膜联蛋白V变体及其高水平地、大量生产的制备方法，及其在制备体内外细胞凋亡检测的探针或诊断药物上的应用。为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的一种膜联蛋白V变体，是具有序列表中序列I氨基酸残疾序列的蛋白质，或者是将序列I中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列I的氨基酸残基序列相同活性的由序列I衍生的蛋白质。上述的膜联蛋白V变体，是在膜联蛋白V的C-末端添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽为1-25氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成，并含有1-3个半胱氨酸。上述的膜联蛋白V变体可以为在膜联蛋白V的C-末端添加一个半胱氨酸。上述的膜联蛋白V变体的制备方法，按如下步骤进行a.利用计算机辅助分子设计，在膜联蛋白V晶体结构的基础上，对膜联蛋白V的C-末端添加氨基酸序列进行分子模建和设计；b.设计膜联蛋白V蛋白编码序列的引物对，以本实验室保持的人膜联蛋白V基因为模板进行PCR扩增；c. PCR电泳回收产物与克隆载体连接并转入大肠杆菌感受态细胞ToplO上进行培养;
d.用限制性内切酶Nco I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET28a，将得到的两种目的基因片段用T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞ToplO进行培养并筛选提取重组表达质粒；e.将所提取的重组表达质粒转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种；f.将步骤e获得的菌种进行扩大培养，收集菌体；g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化后的蛋白。上述的膜联蛋白V变体的制备方法，所述引物对的核苷酸序列为上游引物5’_gttcca tgg gcg cac agg ttc tea gag gca_3’ ；下游引物5，-tcc get cga gtt age agt cat ctt ctc cac aga gca_3，。上述的膜联蛋白V变体的制备方法，所述的步骤g中纯化的步骤依次为沉淀解吸附、硫酸铵分级沉淀、Super Q-650M层析和SP层析。上述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的制备方法为进行荧光化学标记或者核素标记。上述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的应用为在制备细胞凋亡监测试剂、疾病监测药物中的应用。制备方法包括利用计算机辅助分子设计、构建膜联蛋白V变体，在膜联蛋白V的C-端添加含有一个或一个以上半胱氨酸的1-25个氨基酸残基短肽；设计的膜联蛋白V变体的基因的获取；构建重组质粒；相应的重组基因工程表达；以及膜联蛋白V变体的分离纯化获取步骤。其中膜联蛋白V变体的产率远远高于目前已报道的膜联蛋白V及其变体的产率。本发明公开的膜联蛋白V变体在制备体内外细胞凋亡检测的探针或诊断药物上的应用通过以下技术解决措施来进一步实现将获取得到的膜联蛋白V变体，方便地进行荧光化学标记或者核素标记，从而应用于体内外细胞凋亡检测的探针或诊断药物的制备中。在膜联蛋白V变体计算机辅助分子设计中，我们利用对膜联蛋白V变体进行了结构模拟和分子设计，在膜联蛋白V晶体结构的基础上，对膜联蛋白V的C-末端添加氨基酸进行分子模建和分子设计，确定C-末端能够添加的氨基酸长度。在膜联蛋白V的C-末端加入半胱氨酸残基的目的是利用半胱氨酸残基易于参与偶联反应、具有对金属离子的亲和性等特点，提高重组膜联蛋白V的标记效率。结果发现在计算机分子设计时计算的添加25个氨基酸短肽长度内，只要短肽由不含支链的、柔性较大的氨基酸残基、例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等组成，而且其中含有的半胱氨酸数不超过三个，都不会对膜联蛋白V的结构产生任何影响；而且在分子动力学所计算的不含支链、柔性较大的25个氨基酸短肽长度范围内，短肽长度越长，对膜联蛋白V的结构产生的扰动越小；相对来说，长度较短时可能对膜联蛋白V蛋白质的结构产生一定的影响，从而可能导致影响膜联蛋白V作为细胞凋亡探针识别凋亡细胞的功能，而且尽管增加半胱氨酸能够有助于膜联蛋白V进行荧光基团或者核素标记，但是分子设计的结果显示半胱氨酸的数量应该控制在1-3个范围内，否则很可能会产生蛋白质的聚合。在上述分子设计的基础上，我们首先选择了在膜联蛋白V的C-末端只添加I个半胱氨酸残基的设计方案，因为计算机模拟显示此方案对膜联蛋白V的(荧光或者核素)化学标记影响最大，或者荧光/核素化学标记后对于膜联蛋白V的结构及其识别凋亡细胞的功能产生影响的可能性最大。其它设计方案都是距离膜联蛋白V的分子表面有一段距离， 因此这种干扰和影响要小很多。我们同时尝试表达了膜联蛋白V的C-末端添加了含有丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸的短肽的膜联蛋白V变体，以及含有以上三个重复的甘氨酸-(丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-半胱氨酸)3的25个氨基酸残基的膜联蛋白V变体，都获得了相似的结果，从而证明了计算机分子设计的正确性。相形之下，只添加一个半胱氨酸的膜联蛋白V变体表达水平最高，其它变体的表达水平略低，但都在60mg/L以上。所述的膜联蛋白V变体的基因表达方法中PCR反应条件为94°C预变性5分钟后进行94°C变性30秒、58 °C复性30秒、72 °C延伸30秒的30个循环的扩增，72 °C延伸I分钟后保存于4 C。进一步地，膜联蛋白V变体的表达方法中重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后，挑取单克隆于37°C振荡培养过夜，然后以I : 100的体积接种于LB培养液中，37 °C培养2小时至0D600约为0. 6，向菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0. 5mM,37°C诱导表达4小时，收集菌体，用12% SDS-PAGE进行分析。膜联蛋白V变体在10_40°C范围内其表达水平和产率都没有显著变化。进一步地，膜联蛋白V变体通过采用上步所得菌体，以5mL缓冲液(50mM NH4C1,PH9. 0)悬浮I克湿菌的比例重新悬浮菌体，加入溶菌酶处理菌体，作用I小时后加入蔗糖至浓度为60%，然后稀释到20倍体积的(50mM NH4Cl,20mM CaC12，pH9. 0)缓冲液中，离心弃去上清，保留沉淀。沉淀物用5mL解吸附液(50mM NH4Cl，pH 9. 0,20mMEDTA)重新悬浮I克沉淀的比例重新悬浮沉淀，离心取上清。再通过将上述获得的上清进行硫酸铵分级沉淀，收集40% -70%部分的沉淀，重新溶解后进行透析，过滤去除不溶物；之后进行SuperQ-650M层析，用初始缓冲液(50mM NH4Cl，pH 9.0)平衡Super Q-650M层析柱(日本TOSOH公司)，用洗脱缓冲液(50mM NH4Cl，pH 9.0,200mM NaCl)洗脱，收集洗脱峰；将洗脱峰继续进行SP层析，用初始缓冲液(20mM NH4Cl,80mM NaCl,15mM CaCl2,pH 9.0)平衡SP层析柱，用洗脱缓冲液(20mM NH4Cl,400mM NaCl，pH 9.0)洗脱，收集洗脱峰。上述分离纯化方法可以使得产率达到110mg/L，其纯度达到97%以上。在纯化过程中，实验结果显示，在SP柱纯化时，相对于膜联蛋白V，膜联蛋白V变体与SP柱结合得更为牢固，需要用更高的离子强度才能被洗脱下来，这从一个侧面说明膜联蛋白V变体比膜联蛋白V具有更强的金属离子结合能力；膜联蛋白V变体结合了更多的钙离子才导致其与SP柱结合得更牢固，这从一个侧面证明了我们设计的膜联蛋白V变体的有效性。进一步地，对膜联蛋白V变体进行进行荧光化学标记或者核素标记。得到标记的膜联蛋白V变体可以用于体内外细胞凋亡监测中。我们将膜联蛋白V和膜联蛋白V变体分别进行FITC荧光标记，然后用于检测细胞凋亡，结果显示FITC-膜联蛋白V变体(图3A)和FITC-膜联蛋白V(图3B)均能识别凋亡的细胞，而且具有剂量依赖关系。但是与FITC-膜联 白V相比，相同剂量的FITC-膜联蛋白V变体信号更强，这表明膜联蛋白V变体标记FITC的效率更高，使得探针分子数相同的情况下，产生更高的荧光信号。我们分别用核素标记99mTc-膜联蛋白V和标记99mTc-膜联蛋白V变体，每种蛋白质的标记重复三次，膜联蛋白V变体的标记效率非常稳定，而膜联蛋白V的标记效率则变动较大，因此膜联蛋白V变体更易于进行标记。此外，99mTc-膜联蛋白V放置3小时后，比放为95%，放置24小时后，比放为65% ;而99mTc-膜联蛋白V变体放置3小时后，比放为98%，放置24小时后，比放仍大于90%。因此，膜联蛋白V变体核素标记时具有更好的稳定性。我们将核素标记99mTc-膜联蛋白V和标记99mTc-膜联蛋白V变体注射到动物体内，它们都表现出相同的组织分布和代谢特性，因此都可以用来进行体内的显像检测。本发明的有益效果(I)在已有的膜联蛋白V的基础上进行C-末端氨基酸序列的设计，通过增加含有至少一个半胱氨酸的短肽序列变体的设计，与传统在膜联蛋白V的N-末端添加氨基酸序列的方法相比更加能够在不影响其生物学功能活性的基础上提高标记效率，同时采用了先进的沉淀解吸、硫酸铵分级沉淀、Super Q-650M层析和SP层析的步骤进行蛋白质的分离纯化，大大提高蛋白质的产量，为传统方法产量的10倍以上；(2)膜联蛋白V变体蛋白纯度好、产率高、标记效率及稳定性高且不影响膜联蛋白V变体的生物学功能，适用于工业化生产，为进一步研究膜联蛋白V变体及其在细胞凋亡监测试剂、疾病监测药物等方面的应用奠定了基础。


图I.本发明实施例膜联蛋白V变体重组表达菌的SDS-PAGE分析。I、诱导表达后的菌体总蛋白；2、菌体破碎后的表达上清液；3、菌体破碎后的表达沉淀。图2.本发明实施例膜联蛋白V变体分离纯化过程的SDS-PAGE分析。I、分子量标准品(自上至下分别为:116. 0,66. 2,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4kDa) ;2、解吸附产物；3、4、硫酸铵分级沉淀产物；5、Super Q-650M层析纯化样品；6、Super Q-650M层析的穿过峰；7、Super Q-650M层析的洗脱峰；8、SP层析的纯化样品；9、SP层析的穿过峰；10、SP层析的洗脱峰。图3.本发明实施例重组膜联蛋白V与重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡的生物活性比较。3A、不同浓度(绿色0. 36nM ;粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)的重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡；3B、不同浓度(绿色0. 36nM ;粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)的重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡；3C、不同浓度的重组膜联蛋白V与重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡的生物活性比较(绿色0. 36nM ;粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)。同颜色时，峰高的探针为FITC-膜联蛋白V变体。
具体实施例方式实施例a.膜联蛋白V变体的结构模拟和分子设计在SGI计算机工作站上,利用MSI公司的分子设计软件(Insightll、Discover等模块)，在膜联蛋白V晶体结构的基础上，对膜联蛋白V的C-末端添加氨基酸进行分子模建和分子设计，确定C-末端能够添加的氨基酸长度。并选择在膜联蛋白V的C-末端添加一个半胱氨酸的膜联蛋白V变体作为后续步骤实施的基础。
b.膜联蛋白V变体蛋白质原核表达载体的构建根据已经公开发表的膜联蛋白V的基因序列设计和化学合成上下游引物，以本实验室保存的人膜联蛋白V基因为模板，用PCR的方法扩增获得膜联蛋白V变体的编码DNA序列，引物对的核苷酸序列为上游引物5’ -gttccatgggcgcacaggttctcagaggca-3’ ；下游引物5’ -tccgctcgagttagcagtcatcttctccacag agca_3’。PCR反应条件为94°C预变性5分钟后进行94°C变性30秒、58°C复性30秒、72°C延伸30秒的30个循环的扩增，72°C延伸7分钟后保存于4°C。c. PCR电泳回收产物与克隆载体连接并转入大肠杆菌感受态细胞ToplO上进行培养;d.用限制性内切酶Nco I和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET28a，将回收后获得的pET28a载体片段和人膜联蛋白V变体DNA片段按I : 20的比例混合，以T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌ToplO感受态菌，筛选阳性克隆进行酶切鉴定和DNA测序分析验证其编码序列的正确性。e.将所提取的重组表达质粒转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)内，挑取单克隆于37°C振荡培养过夜，然后以I : 100的体积接种于LB培养液中，37°C培养2小时至0D600约为O. 6，加入IPTG至终浓度O. 5mM，37°C诱导表达4小时，收集菌体，用12% SDS-PAGE进行分析。分析结果如图I所示1 :诱导表达后的菌体总蛋白；2 :菌体破碎后的表达上清液；3 :菌体破碎后的表达沉淀。膜联蛋白V变体的表达水平为占菌体总蛋白的35. 4%，且绝大部分以可溶性形式存在。f·分别将质粒 pET28a-Hi s-FADD 与 pET28a_Hi s-FADD (F25Y)转化表达宿主菌E. coliBL21 (DE3)，生长于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37°C生长16小时之后，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg/L的卡那霉素)，37°C摇床振荡培养，待培养液OD600值达到O. 6左右，摇床温度降至25°C继续培养半小时，加入终浓度为O. 4mM的IPTG诱导目的蛋白的表达。在25°C继续振荡培养5小时后，通过离心收集菌体。g.将步骤f收集得到的菌液，以5mL缓冲液(50mM NH4C1，pH9. O)悬浮I克湿菌的比例重新悬浮菌体，加入溶菌酶处理菌体，作用I小时后加入蔗糖至浓度为60%，然后稀释到20倍体积的(50mM NH4Cl,20mM CaC12,pH9. O)缓冲液中，离心弃去上清，保留沉淀。沉淀物用5mL解吸液(50mMNH4Cl，pH 9. O, 20mMEDTA)重新悬浮I克沉淀的比例重新悬浮沉淀，离心取上清。将上述获得的上清进行硫酸铵分级沉淀，收集40% -70%部分的沉淀，重新溶解后进行透析，过滤去除不溶物。用初始缓冲液(50mM NH4Cl, pH 9.0)平衡Super Q-650M层析柱(日本TOSOH公司)，用洗脱缓冲液(50mM NH4Cl,pH 9.0,200mM NaCl)洗脱，收集洗脱峰。用初始缓冲液(20mM NH4Cl,80mM NaCl，15mM CaCl2,pH 9.0)平衡SP层析柱，用洗脱缓冲液(20mM NH4Cl, 400mM NaCl, pH 9.0)洗脱，收集洗脱峰。SDS-PAGE分析各收集液，其结果如图2所示1、分子量标准品(自上至下分别为:116. 0,66. 2,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4kDa) ;2、解吸附产物；3、4、硫酸铵分级沉淀产物；5、Super Q-650M层析纯化样品；6、Super 0-65011层析的穿过峰；7、5即61 Q-650M层析的洗脱峰；8、SP层析的纯化样品；9、SP层析的穿过峰；10、SP层析的洗脱峰。经过上述纯化方法获得了纯度超过97%的膜联蛋白V变体，每升发酵液可纯化获得IlOmg以上的膜联蛋白V变体。膜联蛋白V变体通过Super Q柱和SP柱这两种互补性 极强的纯化方式，几乎可以除去全部的杂蛋白，实验结果也显示，经过这两步纯化后，蛋白纯度已经超过97%。h.膜联蛋白V及膜联蛋白V变体的FITC荧光标记将含有3mg膜联蛋白V及膜联蛋白V变体的溶液放入截留分子量为IOKDa的超滤管中，使用PH9. O的O. IM碳酸氢钠溶液进行超滤、离心、倒上清，再加入碳酸氢钠溶液，重复三次，测量蛋白浓度，终浓度应为5mg/ml左右，反应前取出200 μ I置于细胞冻存管，搅拌。使用Iml的O. IM碳酸氢钠(ρΗ9· O)溶解2mg的FITC,在室温下迅速搅拌,取出适量的FITC溶液(使FITC与蛋白的摩尔比在60 100 I)，缓慢地滴加到蛋白溶液中，反应终体积不得超过250 μ I。在室温下避光搅拌反应两个小时。将反应液用超滤管，对PBS (ρΗ7. 2)溶液超滤，至滤过液中看不到淡绿色的FITC分子为止，产物应为黄橙色透明溶液。得到的偶联物用锡箔纸包好，放入-20度冰箱保存。i.重组膜联蛋白V与重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡的生物活性比较人肺癌A549(L 5X IO5)细胞经终浓度为100ng/ml的重组人TRAIL处理6小时，用胰蛋白酶酶消化、4°C 800rpm离心5分钟收集细胞，每个样品分别加入400 μ I的含有O. 36ηΜ，0. 12ηΜ，0. 036ηΜ的FITC标记的重组膜联蛋白V或膜联蛋白V变体，在流式细胞仪上检测细胞凋亡。每个重组膜联蛋白V或膜联蛋白V变体浓度重复3个实验，以不标记的细胞样品作为对照。生物活性对比结果如图3所示3Α :不同浓度(绿色0. 36nM ;粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)的重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡；3B :不同浓度(绿色O. 36nM ;粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)的重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡；3C :不同浓度的重组膜联蛋白V与重组膜联蛋白V变体检测细胞凋亡的生物活性比较(绿色0. 36nM ；粉红色0. 12nM ;蓝色0. 036nM)。同颜色时，峰高的探针为FITC-膜联蛋白V变体。j.膜联蛋白V及膜联蛋白V变体的核素标记取SnCl2 3. 5mg 溶于 IOml pH = 7. 4 的 PBS 缓冲液中制成 O. 35 μ g/ml 的 SnCl2 溶液备用。在室温下取100 μ I (35 μ g) SnCl2,向其加入O. 6 μ g/ μ I的膜联蛋白V及膜联蛋白V变体各20 μ 1，轻摇5分钟。向其中加入体积小于O. 1ml，放射量约5mci的99Tcm04_溶液，然后滴入ΙΟμΙ Vc室温下静置30min，HPLC测定标记蛋白质的放化纯，大于95%方可应用。k.核素标记的重组膜联蛋白V与重组膜联蛋白V变体体外稳定性测定将99mTc-膜联蛋白V、99mTc_膜联蛋白V变体在室温下分别放置I小时，2小时，3小时，然后测定放化纯。此外，99mTc-膜联蛋白V放置3小时后，比放为95%，放置24小时后，比放为65%;而99mTc-膜联蛋白V变体放置3小时后，比放为98%，放置24小时后，比放仍大于90%。因此，膜联蛋白V变体核素标记时具有更好的稳定性。我们将核素标记99mTc-膜联蛋白V和标记99mTc-膜联蛋白V变体注射到动物体内，它们都表现出相同的组织分布和代谢特性，因此都可以用来进行体内的显像检测。以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
权利要求
1.一种膜联蛋白V变体，具有序列表中序列I氨基酸残基序列的蛋白质，其特征在于是序列I中的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列I的氨基酸残基序列相同活性的由序列I衍生的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的膜联蛋白V变体，其特征是在膜联蛋白V的C-末端添加一段具有柔性结构的、不含支链氨基酸的短肽，其中，短肽为1-25氨基酸残基，主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等不含支链的氨基酸组成，并含有1-3个半胱氨酸。
3.根据权利要求I所述的膜联蛋白V变体，其特征在于膜联蛋白V的C-末端添加ー个半胱氨酸。
4.ー种上述膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于按如下步骤进行 a.利用计算机辅助分子设计，在膜联蛋白V晶体结构的基础上，对膜联蛋白V的C-末端添加氨基酸序列进行分子模建和设计； b.设计膜联蛋白V蛋白编码序列的引物对，以膜联蛋白V基因为模板进行PCR扩增； c.PCR电泳回收产物与克隆载体连接并转入大肠杆菌感受态细胞ToplO上进行培养； d.用限制性内切酶NcoI和Xho I分别双酶切c步骤回收产物和表达载体pET28a，将得到的两种目的基因片段用T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌感受态细胞ToplO进行培养并筛选提取重组表达质粒； e.将所提取的重组表达质粒转入大肠杆菌表达宿主菌内，培养菌株得菌液，用IPTG诱导菌液，收集菌种； f.将步骤e获得的菌种进行扩大培养，收集菌体； g.将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化后的蛋白。
5.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于所述引物对的核苷酸序列为上游引物5’ -gtt cca tgg gcg cac agg ttc tea gag gca_3’ ；P*功子弓I物5’ -tcc get cga gtt age agt cat ctt ctc cac aga gca_3’。
6.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体的制备方法，其特征在于步骤g中纯化的步骤依次为沉淀解吸、硫酸铵分级沉淀、Super Q-650M层析和SP层析。
7.根据权利要求4所述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的制备方法，其特征在于进行荧光化学标记或者核素标记。
8.根据权利要求7所述的膜联蛋白V变体作为细胞凋亡探针的应用，其特征在于在制备细胞凋亡监测试剂、疾病监测药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，具体公开了一种膜联蛋白V变体的设计、制备方法及应用。该膜联蛋白V变体是具有序列表中序列1氨基酸残基序列的蛋白质，其特征在于序列1中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与序列1的氨基酸残基序列相同活性的由序列1衍生的蛋白质。通过该膜联蛋白V变体制备方法生产的膜联蛋白V变体纯度好、产率高、标记方便及标记效率和稳定性高且不影响膜联蛋白V变体的生物学功能，适用于工业化生产，为进一步研究膜联蛋白V变体及其在细胞凋亡监测试剂、疾病监测药物等方面的应用奠定了基础。
文档编号G01N33/58GK102690345SQ20111007245
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者华子春, 胡敏进 申请人:江苏靶标生物医药研究所有限公司