专利名称：含EB病毒膜蛋白gp350/220、gp85、gp78、gp25基因的重组腺病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程与生物医药领域，具体地，涉及含EB病毒膜蛋白 gp350/220、gp85、gp78或gp25基因的复制缺陷型重组腺病毒及其制备方法、用含EB病毒 糖蛋白gp350/220基因的复制缺陷型重组腺病毒载体转导的抗原提呈细胞，及含该抗原提 呈细胞的疫苗组合物，也涉及该疫苗组合物在预防治疗鼻咽癌方面的用途。
背景技术：
EB 病毒(Epstein-Barr virus, EBV)由 Epstein 与 Barr 与 1964 首次从非洲伯基 特(Burkitt)淋巴瘤原代培养细胞中发现的。EB病毒是一种广泛存在于人群中的疱疹病 毒(herpsvirus)，90%以上的人建立了 EBV终身潜伏感染。EBV除直接导致传染性单核细 胞增多症(infections mononucleosis, IM)外，还与人类几种常见的恶性肿瘤密切相关，如 何杰金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma，HL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma，BL)、移植 后淋巴组织增生性疾病(post-transplant lymphoproliferative disease)以及低分化的 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)密切相关。流行病学研究数据显示，NPC的发生具有明显的地区聚集性，主要发生于南 亚、北非以及美国阿拉斯加的某些地区。尤其是中国的华南地区，鼻咽癌的发生率高达 30-50/10000人每年。除了饮食习惯、环境、遗传等因素外，EBV在鼻咽癌的发生中起着重要 的作用。开发预防性疫苗来控制EBV的概念最初由Epstein提出。由于EBV潜在的致癌特 性，灭活或减毒疫苗是不可行的。以亚单位作为EBV疫苗的研究主要集中在EBV的糖蛋白， 包括 gp350/220, gp85，gp25 等。来源于B95. 8的gp350含907个氨基酸，为高度糖基化蛋白，分子量为350kd，由 于mRNA的剪切方式不同，可在aa500-697的位置剪切掉一段高度重复的序列，得到分子量 为220kd的蛋白，故称为gp350/220。EB病毒gp350是EBV外膜蛋白中含量最高的蛋白，在 EBV侵入⑶21阳性细胞(如B淋巴细胞)时起着重要的作用。EBV通过gp350与B淋巴细 胞表面受体⑶21相互作用介导EBV进入细胞内。许多研究成果已经证明gp350可作为潜在的预防EBV的疫苗。1982年North等提 取天然的EBV外膜蛋白gp350，免疫小鼠可得到保护性中和抗体。然而提取天然gp350的产 量毕竟有限，不易规模化。1985年，Mackett等将gp350的全长基因克隆到痘病毒，在痘病 毒启动子的作用下，gp350蛋白得到有效表达。将重组痘病毒免疫新西兰兔，免疫血清可以 中和EBV感染B淋巴细胞。随后，gp350在多种疫苗载体中重组，包括复制缺陷型腺病毒载 体，质粒以及牛疱疹病毒等。Ragot等将gp350复制缺陷型腺病毒重组子免疫棉顶猴，尽管 免疫血清在体外不能中和EBV，但都能保护免疫的动物免于在致瘤量的EBV作用下诱导淋 巴瘤。然而其他的研究者发现无论是gp350的重组质粒还是重组病毒，免疫血清不但具有 体外中和功能，还有保护动物免于致瘤的功能。由葛兰素史克公司进行的gp350亚单位疫苗二期临床实验结果显示，该疫苗能有效防止EBV引起的感染性单核苷酸增多综合症。糖蛋白gp85、gp25是以复合物的形式存在，与gp42 —起形成三聚体，与EBV感染 宿主细胞膜融合相关。研究表明gp85/gp25复合物在体外可以封闭EBV感染上皮细胞。针 对gp85/gp25复合物的抗体可以中和EBV对上皮细胞的感染。对于gp78的研究较少，研究 发现gp78的抗体水平与鼻咽癌的发生、发展密切相关，提示gp78可作为潜在的EBV靶抗 原。由于EBV是鼻咽癌发生(尤其是鼻咽癌高发地区)的重要诱因之一，因此本发明 旨在开发针对鼻咽癌的EBV的疫苗。
发明内容
EBV作为在人群中广泛传播的病毒，与鼻咽癌的发生、发展密切相关，特别是在中 国华南地区，鼻咽癌的发病率高达30/10万，预防EB病毒在这些地区的传播，将有助于降低 鼻咽癌的发病率。然而，由于EBV潜在的致癌特性，制备灭活或减毒疫苗是不可行的，以亚 单位作为EBV疫苗的研究主要集中在EBV的糖蛋白，包括gp350/220，gp85，gp25和gp78 等。现已经证实EBV的糖蛋白gp350/220、gp85和gp25等在体外能有效中和EBV对宿主细 胞的感染，gp78的抗体滴度与鼻咽癌的发生发展密切相关。基于此发现，本发明人成功构 建了分别含EB病毒糖蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25的基因序列的复制缺陷型重组腺 病毒。本发明也提供了上述复制缺陷型重组腺病毒的制备方法、用含gp350/220的复制缺 陷型重组腺病毒转导的抗原提呈细胞，含该抗原提呈细胞的疫苗组合物，该疫苗组合物在 预防治疗鼻咽癌方面的用途。为此，本发明人构建了一种大肠杆菌菌株，该菌株的保藏名称为大肠杆菌 Escherichia coli JM109/Pentr2B_gp350/220，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏 日期2009年1月四日，保藏号为CCTCC NO :M2010030。本发明人还构建了一系列复制缺陷型的重组腺病毒，该病毒分别携带有编 码糖蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25的外源基因，分别将上述重组腺病毒简称为 Ad-gp350/220、Ad-gp85、Ad-gp78 或 Ad-gp25。以Ad_gp350/220为例，首先利用鼻咽癌组织来源的EB病毒株⑶1，经过测序证明 其含有EB病毒全基因组序列。从聚合酶链式扩增技术从该EB病毒株GDl中得到gp350/220 的全长cDNA序列，并将其定向克隆到腺病毒穿梭质粒中，转化宿主细胞，通过抗生素抗性 筛选(例如卡那霉素)阳性克隆，抽提重组质粒，重组质粒通过酶切消化将含相关启动子 序列(如Pcmv)、gp350/220的全长cDNA序列和pA序列的片段与腺病毒骨架质粒定向连 接，再转化宿主细胞，经过抗生素抗性筛选(例如氨苄青霉素)阳性克隆，得到gp350/220 腺病毒重组质粒pAD-gp350/220。最后，在借助脂质体将pAD_gp350/220转导已知的腺病毒 包装细胞中，包装出成熟的gp350/220重组复制缺陷型腺病毒，以进一步扩增病毒。在本发明的一个实施例中，所述的腺病毒穿梭质粒是pENTR2B。在本发明的一个实施例中，所述的腺病毒骨架质粒pAD-CMV/DEST。在本发明的一个实施例中，所述的包装细胞是293细胞。经过PCR和Wfestern印迹试验的结果表明，糖蛋白gp350，gp85或gp25分别在293 细胞中得到表达。
另外，本发明还提供了含EB病毒糖蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25的基因序 列的重组腺病毒的制备方法，该方法包括(1)将编码EB病毒糖蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25的DNA序列克隆到适当 的腺病毒穿梭质粒中；得到携带gp350/220、gp85、gp78或gp25的DNA编码序列的重组腺
病毒穿梭质粒；(2)通过转化大肠杆菌感受态细胞，将所述重组腺病毒穿梭质粒扩增；抽提适量 的重组腺病毒穿梭质粒；(3)通过限制性内切酶消化重组腺病毒穿梭质粒，回收含相关启动子序列、polyA 序列和gp350/220、gp85、gp78或gp25的全长cDNA序列的DNA片段，并将该片段定向克隆 到腺病毒骨架质粒中，得到重组腺病毒质粒；(4)将步骤C3)所得到的重组腺病毒质粒导入适当的腺病毒包装细胞，得到复制 缺陷型重组腺病毒。在本发明的一个实施例中，所述的腺病毒穿梭质粒是pENTR2B。在本发明的一个实施例中，所述的腺病毒骨架质粒pAD-CMV/DEST。在本发明的一个实施例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌JM109。在本发明的一个实施例中，所述的包装细胞是293细胞。实验结果表明，本发明的携带gp350/220编码序列的Ad_gp350/220制缺陷型腺病 毒具有高达IO11 12的病毒滴度。在本发明的gp350/220重组复制缺陷型腺病毒免疫balb/ C小鼠后，可检测到动物体内特异性抗体的生成。因此，本发明的另一方面，提供了一种包括重组复制缺陷型腺病毒以及一种或多 种药物学上可接受的载体的疫苗。在本发明的一个实施例中，所述复制缺陷型腺病毒为Ad_gp350/220。在本发明的一个实施例中，Ad_gp350/220具有IO11病毒滴度。本发明是一种基因工程疫苗，即使用腺病毒作为载体的基因疫苗，它利用本身很 容易感染呼吸道上皮的腺病毒作为载体，是保护性免疫原或肽段在其中表达，诱导呼吸道 粘膜免疫反应；通过粘膜反应，使机体产生相应的抗体，防止病毒侵染。本发明与传统的疫 苗相比，它既能产生全身机体免疫反应，又能产生局部粘膜免疫，且使用方便，不受肌肉注 射等特定条件的限制。本发明构建的EB病毒的膜蛋白腺病毒经扩增、纯化、经过不同的组 合，可以制成喷雾剂或其他形式的药剂，使用形式多样方便。
图1是PCR扩增EBV膜蛋白gp25，gp78，gp85，gp350/220基因片段琼脂糖凝胶电 泳图，其中Mark为基因片段分子量标记，1为EBV膜蛋白gp25基因片段；2为EBV膜蛋白 gp78基因片段；3为EBV膜蛋白gp85基因片段；4为EBV膜蛋白gp350/220基因片段。图 2 是 pENTR2B-gp25、pENTR2B-gp78、pENTR2B_gp85、pENTR2B-gp350/220 重组载 体的阳性克隆的聚合酶链式反应鉴定图。其中，Mark为基因片段分子量标记，1为EBV膜蛋 白gp25基因片段；2为EBV膜蛋白gp78基因片段；3为EBV膜蛋白gp85基因片段；4为EBV 膜蛋白gp350/220基因片段图3是带有EBV膜蛋白基因的重组腺病毒结构示意图。
图4是重组腺病毒Ad_gp350/220在293细胞中表达免疫印迹检测示意图。图5是重组腺病毒Ad-gp25、Ad_gp85在293细胞中表达免疫印迹检测示意图。图6是Ad_gp350/220免疫小鼠产生抗体ELISA检测结果。图7是本发明制备疫苗的技术路线图。
具体实施例除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通 常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理 解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技 术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、为生物学、重组DNA 和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下 了文件中有详细描述 Jambrook 等人编著的 MolecularCloning =Alaboratory Mannual, 第二版(1989) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames 和 S. J. Higgin 编著，1984)； Immnochemical Methods in Cell AndMolecular Biology(Academic Press, London)。材料和方法本发明使用的鼻咽癌组织来源的EB病毒株⑶1(由本实验室建立，J0URNAL0F VIROLOGY, Dec. 2005，p.15323-15330)；腺病毒穿梭质粒pENTR2B，腺病毒骨架质粒，大肠杆菌宿主细胞JM109以及腺病毒 包装细胞均购置自美国INVITR0GEN公司。本发明实验研究中使用的Tag酶和限制性内切酶均购自TAKARA公司。本发明实验研究中使用PCR反应体系、回收试剂盒和连接试剂盒均购自TAKARA公司。本发明实验研究中使用的大肠杆菌JM109感受态细胞购自TAKARA公司。质粒大量提取试剂盒购自Promega公司本发明获得的大肠杆菌Escherichia coli JM109/Pentr2B_gp;350/220 由中国典 型培养物保藏中心保存，保藏号为=CCTCC NO :M2010030，保藏日期2009年1月29日。实施例一含EB病毒糖蛋白gp350/220基因序列的重组腺病毒载体的构建1. 1穿梭质粒的构建 根据gene bank公布的EBV膜蛋白gp350/220基因序列(gene bank查询号 AY961628. 3)，设计PCR引物如下上游引物P1 TTGAGTCGACACCATGGAGGCAGCCTTGCTTGT ；下游引物P2 TCAGGAGAGGTTTGAGAATCTGG ；PCR 反应体系为去离子水 ddH2016. 3uL, PCR Buffer2. 5uL，上游引物 Pl :0. 5uL, 下游引物 P2 :0. 5uL, dNTP4. OuL, Taq 酶:0. 2ul, CDl 模板 luL，共计 25U1。以 ddH20 代替模 板做阴性对照。PCR 反应条件为95°C，5min 变性；95°C、30s、55°C、45s、72°C、lmin，共 30 个循环， 72 °C、7min。用琼脂糖凝胶检测PCR产物，见图1。
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将PCR产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳回收，得PCR产物1。回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将回收的PCR产物用Mil与EcoRV限制性内切酶酶切，用琼脂糖凝胶方法进行电 泳回收，得PCR产物2 ；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将腺病毒穿梭质粒pENTR2B用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，用DNA回收试 剂盒回收；得PENTR2B回收产物；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将PCR产物2和pENTR2B回收产物在连接酶的作用下定向连接，连接体系为 IOxbuffer 1. OuL, PCR 产物 2 -AuL, pENTR2B 回收产物2uL，ligase :0. 5uL, ddH20 :2. 5uL Ul。连接条件为16°C过夜，以ddH20代替PCR产物2做载体自连对照。连接物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为25ug/ml卡那霉素 的LB平板中，37°C培养8 10小时，挑选10 20个克隆，接种于2ml卡那霉素(25ug/ml) 的LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8 10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并用Sal I与EcoR V限制性内切酶酶切进行鉴定，并通过聚合酶链式反应和测序鉴定阳性克隆。将获得的阳性克隆交由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏名称为大肠杆菌 Escherichia coli JM109/Pentr2B_gp;350/220，保藏号为CCTCC NO :M2010030，保藏日期 2009年1月四日。1. 2腺病毒骨架质粒DNA与pENTR2B_gp;350/220的重组。将鉴定的阳性克隆命名为pENTR2B-gp;350/220。将 pENTR2B_gp;350/220 与 腺病毒骨架质粒pAD-CMV/DEST进行重组。重组体系为2x LR重组酶混合液5. OuL, pENTR2B-gp350/220 :2. 5uL, pAD-CMV/DEST :2. 5uL。25°C反应过夜。重组产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为50ug/ml氨苄霉 素的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml氨苄霉素(50ug/ml) 的LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并通过聚合 酶链式反应和测序鉴定阳性克隆，见图2。构建所得的是带有EBV膜蛋白基因的重组腺病毒 结构图见图3。将鉴定的阳性克隆命名为pAd_gp350/220。用质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits 提取 pAd-gp;350/220 质粒，具体实验步骤见 QIAGEN PlasmidMidi Kits 使用手 册。限制性内切酶I^acI线性化pAd-gp 350/220质粒，-20°C保存备用。1. 3重组腺病毒的包装转染前一天传代HEK-293细胞于25cm2细胞培养瓶，培养基用不含抗生素、含5% FBS的DMEM。配制转染液A液溶于纯水的经I^acI酶切线性化的pAd_gp;350/220DNA5uL 和 Opti-MEM 培养基共 250uL ；B 液5uL LipofectamineTM 和 Opti-MEM 培养液共 250uL。B 液室温放置5min，A和B液轻轻混勻，室温放置20min。吸弃旧细胞培养液，换2ml新鲜的 不含抗生素、含5% FBS的DMEM，然后将A+B混合液加入培养细胞上，于37°C，5% C02孵育 8h，补充新鲜的培养基2. 5ml。24h后换含2% FBS的DMEM维持。每隔两天更换含2% FBS 的DMEM维持培养基，约7-8天左右，可明显看到重组腺病毒形成的噬斑，再更换一次培养 基，然后一直维持到病毒液的收集。约11-13天左右，可见约80%的细胞边圆，此时将细胞 与上清一起收集到同一个15mL离心管中，-80°C保存备用。
1.4EBV疫苗的制备将_80°C保存的病毒经50°C水浴至完全溶解，再_80°C保持30分钟，反复3次，使 细胞裂解，释放病毒至上清。3000g离心10分钟，收集上清，即得EBV疫苗病毒粗液。粗病毒经空斑法进行筛选将粗制病毒按感染复数1 10感染293细胞，约2小 时后，弃培养基，加入37°C温浴的低熔点以完全培养基配置的琼脂糖，覆盖，培养14-21 天可见明显的噬斑，用枪头挑取噬斑，溶于培养基中，再次感染293细胞，约3天左右，大部 分细胞变圆，收集细胞与上清。以反复冻融法释放病毒，以PCR法鉴定目的基因的存在。若 为阳性，即可作为第一代病毒于_80°C冻存。重组病毒的扩大培养第一代粗制病毒以感染复数10 1感染293细胞，等大部 分细胞变圆时收集细胞，弃上清，在细胞中加入IOmM Tris-HCl (pH7. 9)溶液(每个IOcm板 加入ImL)，以反复冻融法释放病毒，得第二代粗制病毒。-80°C冻存。以第二代粗制病毒感 染293细胞，以反复冻融法释放病毒得第三代粗制病毒。第三代粗制病毒可用来进行大规 模扩增。氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增病毒至少需要3 X IO8细胞。1.预冷离心转子至4°C。2.在离心管中缓慢加入 8ml 1. 4g/ml 氯化铯(53g+87ml IOmM Tris-HCl,pH7. 9), 再非常轻缓地加入6ml 1. 2g/ml氯化铯8+92ml IOmM Tris-HCl, pH 7.9)。病毒最终
的纯度有赖于密度梯度的质量。3.超净台中在不连续梯度顶部加入20ml病毒保存液，病毒量必须少于109细 胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。如果保存液的体积少于20ml，用pH 7.910mM Tris-HCl 调至 20ml。4.平衡离心管，100000Xg(SW28转子上为23000rpw)4°C离心12小时。5.超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。6.用IOml移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。7.在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。8.用带18G针头的5ml注射器从离心管外壁稍低于病毒带(最下的一条带)的位 置进行穿刺。
注意感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。9.小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。10.取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15ml离心管。11.以IOOOmL PBS透析两次，分装保存于_80°C，即为重组腺病毒疫苗储存液。1. 5膜蛋白腺病毒重组子体外表达实验。用5 20M0I腺病毒重组子感染293细胞，2小时后弃病毒悬液，加入新鲜培养液， 37°C，5%的(X)2培养M小时，收集细胞，用Wfestern blot法检测膜蛋白gp350，gp85，gp25 的表达，见图4和5。1. 6对gp350/220腺病毒重组子进行免疫学实验。取30只hlb/c小鼠分成3组，每组10只。分别免疫PBS (空白对照组)， Ad-IacZ(阴性对照组)，Ad-gp350/220(实验组)。然后按照下述流程肌肉注射免疫小鼠分别于第0，2，4周免疫小鼠，第6周时处死小鼠，取血，ELISA法测定小鼠的抗体滴度，见图 6。上述实施例一中制备疫苗的技术路线图，见图7。实施例二2. 1穿梭质粒的构建根据gene bank公布的EBV膜蛋白gp85基因序列(gene bank查询号 GPAY96162. 8)，设计PCR引物如下上游引物P3 :ACCGTCGACATGGGCCAGTTGCTCTGTGTTTTTTGC ；下游引物P4 TCAGTGTGCTCTTTCTTCATACAG ；PCR 反应体系为去离子水 ddH2016. 3uL, PCR Buffer2. 5uL，上游引物 PI :0. 5uL, 下游引物 P2 :0. 5uL, dNTP4. OuL, Taq 酶0. 2uL, CDl 模板 luL，共计 25uL。以 ddH20 代替模 板做阴性对照。PCR 反应条件为95°C，5min 变性；95°C、30s、55°C、45s、72°C、lmin，共 30 个循环， 72°C、7min。PCR扩增的片段长度为2200bp ；(请补充)见图1将PCR产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳回收，得PCR产物1。回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将回收的PCR产物用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶方法进行电 泳回收，得PCR产物2 ；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将腺病毒穿梭质粒PENTR2B用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，用DNA回收试 剂盒回收；得PENTR2B回收产物；回收步骤见Minelute gel extractionkit (QIAGEN)使用手册。将PCR产物2和PENTR2B回收产物在连接酶的作用下定向连接，连接体系为 IOxbuffer :1. OuL, PCR 产物 2 :4uL，pENTR2B 回收产物 2uL, ligase :0. 5uL, ddH20 :2. 5uL。 连接条件为16 °C过夜。以ddH20代替PCR产物2做载体自连对照。连接物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为25ug/ml卡那霉素 的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml卡那霉素(25ug/ml)的 LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并用Ml I与 EcoRV限制性内切酶酶切鉴定，并通过聚合酶链式反应和测序鉴定阳性克隆。2. 2腺病毒骨架质粒DNA的制备将鉴定的阳性克隆命名为pENTR2B-gp85，将pENTR2B-gp85与腺病毒骨架质粒 pAD-CMV/DEST进行重组。重组体系为2x LR重组酶混合液5. OuL, pENTR2B-gp85 :2. 5uL， pAD-CMV/DEST :2. 5U 1。25 °C 反应过夜。重组产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为50ug/ml氨苄霉 素的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml氨苄霉素(50ug/ml) 的LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并通过聚合 酶链式反应和测序鉴定阳性克隆。见图2。将鉴定的阳性克隆命名为pAd_gp85。用质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits提取pAd-gp85质粒，具体实验步骤见QIAGEN Plasmid MidiKits使用手册。限制性内 切酶I^acI线性化pAd-gp85质粒，_20°C保存备用，见图2。
实施例三3. 1穿梭质粒的构建根据gene bank公布的EBV膜蛋白gp25基因序列(gene bank查询号 GPAY96162. 8)，设计PCR引物如下上游引物P5 TCGGATCCACCATGCGTGCTGTTGGTGTATTTC ；下游引物P6 :AGCCCCCGCGATGCCATGCGT ；PCR 反应体系为去离子水 ddH2016. 3uL，PCR Buffer 2. 5uL，上游引物 Pl :0. 5uL, 下游引物 P2 :0. 5uL, dNTP4. OuL, Taq 酶:0. 2ul，GDI 模板 luL，共计 25U1。以 ddH20 代替模 板做阴性对照。PCR 反应条件为95°C，5min 变性；95°C、30s、55°C、45s、72°C、lmin，共 30 个循环， 72°C、7min。PCR扩增的片段长度为600bp ；(请补充)见图1将PCR产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳回收，得PCR产物1。回收步骤见回收步 骤见 Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将回收的PCR产物用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶方法进行电 泳回收，得PCR产物2 ；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将腺病毒穿梭质粒pENTR2B用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，用DNA回收试 剂盒回收；得PENTR2B回收产物；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将PCR产物2和pENTR2B回收产物在连接酶的作用下定向连接，连接体系为 IOxbuffer :1. OuL, PCR 产物 2 -AuL, pENTR2B 回收产物 2uL, ligase :0. 5uL, ddH20 :2. 5uL。 连接条件为16 °C过夜。以ddH20代替PCR产物2做载体自连对照。连接物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为25ug/ml卡那霉素 的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml卡那霉素(25ug/ml)的 LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并用Ml I与 EcoRV限制性内切酶酶切鉴定，并通过聚合酶链式反应和测序鉴定阳性克隆。3.2腺病毒骨架质粒DNA的制备将鉴定的阳性克隆命名为pENTR2B-gp25，将pENTR2B-gp25与腺病毒骨架质粒 pAD-CMV/DEST进行重组。重组体系为2x LR重组酶混合液5. OuL, pENTR2B-gp85 :2. 5uL， pAD-CMV/DEST :2. 5U1。25°C反应过夜。重组产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为50ug/ml氨苄霉 素的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml氨苄霉素(50ug/ml) 的LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，用聚合酶链 式反应鉴定阳性克隆。见图2。将鉴定的阳性克隆命名为pAd_gp25。用质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits提取pAd-gp25质粒，具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Midi Kits使用手册。限制性 内切酶I^acI线性化pAd-gp25质粒，_20°C保存备用。实施例44. 1穿梭质粒的构建根据gene bank公布的EBV膜蛋白gp78基因序列(gene bank查询号 GPAY96162. 8)，设计PCR引物如下
上游引物P7 :GTCGGTACCATGGGCACTCATTTAGTGCTTCTATTG下游引物P8 :ATACTCGAGTCACCAGTGCACCCAGGTGGTCT ；PCR 反应体系为去离子水 ddH2016. 3uL, PCR Buffer2. 5uL，上游引物 Pl :0. 5uL, 下游引物 P2 :0. 5uL, dNTP4. OuL, Taq 酶:0. 2ul, GDI 模板 luL，共计 25U1。以 ddH20 代替模 板做阴性对照。PCR 反应条件为95°C，5min 变性；95°C、30s、55°C、45s、72°C、lmin，共 30 个循环， 72°C、7min。PCR扩增的片段长度为780bp ；见图1将PCR产物以琼脂糖凝胶方法进行电泳回收，得PCR产物1。回收步骤见回收步骤 见 Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将回收的PCR产物用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶方法进行电 泳回收，得PCR产物2 ；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将腺病毒穿梭质粒pENTR2B用Ml I与EcoRV限制性内切酶酶切，用DNA回收试 剂盒回收；得PENTR2B回收产物；回收步骤见Minelute gel extraction kit (QIAGEN)使用手册。将PCR产物2和pENTR2B回收产物在连接酶的作用下定向连接，连接体系为 IOxbuffer :1. OuL, PCR 产物 2 -AuL, pENTR2B 回收产物 2uL, ligase :0. 5uL, ddH20 :2. 5uL。 连接条件为16 °C过夜。以ddH20代替PCR产物2做载体自连对照。连接物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为25ug/ml卡那霉素 的LB平板中，37°C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml卡那霉素(25ug/ml)的 LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，并用Ml I与 EcoRV限制性内切酶酶切进行鉴定，并通过聚合酶链式反应和测序鉴定阳性克隆。4. 2腺病毒骨架质粒DNA的制备将鉴定的阳性克隆命名为pENTR2B-gp78，将pENTR2B-gp78与腺病毒骨架质粒 pAD-CMV/DEST进行重组。重组体系为2x LR重组酶混合液5. OuL, pENTR2B-gp85 :2. 5uL， pAD-CMV/DEST :2. 5U1。25 °C 反应过夜。重组产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并涂布于含有浓度为50ug/ml氨苄霉 素的LB平板中，37 °C培养8-10小时，挑选10-20个克隆，接种于2ml氨苄霉素(50ug/ml) 的LB液体培养基中，继续以37°C下振摇8-10小时。然后用碱法裂解提取质粒，用聚合酶链 式反应鉴定阳性克隆。见图2。将鉴定的阳性克隆命名为pAd_gp78。用质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits提取pAd-gp25质粒，具体实验步骤见QIAGEN Plasmid MidiKits使用手册。限制性内 切酶I^c I线性化pAd-gp78质粒，_20°C保存备用。将鉴定的阳性克隆命名为pAd_gp78。用质粒大量提取试剂盒QIAGENPlasmid Midi Kits提取pAd-gp78质粒，具体实验步骤见QIAGEN Plasmid MidiKits使用手册。限制性内 切酶I^acI线性化pAd-gp78质粒，_20°C保存备用。上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本 发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要 求范围之内。
权利要求
1.一种大肠杆菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏名称为大肠杆 JM109/Pentr2B-gp350/220，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年1月 29 日，保藏号为CCTCC NO :M2010030o
2.一种复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒为含EB病毒糖蛋白 gp350/220编码基因的复制缺陷型腺病毒。
3.一种复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒为含EB病毒糖蛋白gp85编 码基因的复制缺陷型腺病毒。
4.一种复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒为含EB病毒糖蛋白gp78编 码基因的复制缺陷型腺病毒。
5.一种复制缺陷型重组腺病毒，其特征在于，该重组腺病毒为含EB病毒糖蛋白gp25编 码基因的复制缺陷型腺病毒。
6.一种如权利要去2 5任一项所述的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，其特征在 于，该方法包括(1)将编码EB病毒糖蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25的DNA序列克隆到适当的腺 病毒穿梭质粒中；得到携带gp350/220、gp85、gp78或gp25的DNA编码序列的重组腺病毒 穿梭质粒；(2)通过转化大肠杆菌感受态细胞，将所述重组腺病毒穿梭质粒扩增；抽提适量的重 组腺病毒穿梭质粒；(3)通过限制性内切酶消化重组腺病毒穿梭质粒，回收含相关启动子序列、和 gp350/220、gp85、gp78或gp25的全长cDNA序列的DNA片段，并将该片段定向克隆到腺病 毒骨架质粒中，得到重组腺病毒质粒；(4)将步骤C3)所得到的重组腺病毒质粒导入适当的腺病毒包装细胞，得到复制缺陷 型重组腺病毒。
7.如权利要求6所述的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述的腺病 毒穿梭质粒是PENTR2B。
8.如权利要求6所述的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述的腺病 毒骨架质粒pAD-CMV/DEST。
9.如权利要求6所述的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法，其特征在于，所述的包装 细胞是293细胞。
10.权利要2所述的复制缺陷型重组腺病毒在治疗和/或预防EB病毒相关鼻咽癌方面 的用途。
全文摘要
本发明属于生物基因工程与生物医药领域，具体地，涉及含EB病毒膜蛋白gp350/220、gp85、gp78或gp25基因的复制缺陷型重组腺病毒载体及其制备方法。本发明所述的含EB病毒膜蛋白gp350/220基因的复制缺陷型重组腺病毒可用于开发治疗和/或预防鼻咽癌的疫苗和药物。
文档编号C12R1/19GK102108336SQ20101020239
公开日2011年6月29日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者吕小斌, 曾益新, 熊耿, 谢彦博 申请人:中山大学肿瘤防治中心