鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白orf132的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种保藏编号为CCTCCN O：C2014172的杂交瘤细胞株，以及该杂交瘤细胞株分泌鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体。所述的鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆抗体，可以识别天然鲤疱疹病毒3型，并具有很好的特异性，可广泛用于鲤疱疹病毒3型的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治、ORF132蛋白功能研究等。
CCTCC NO:C2014172
20141023
【专利说明】鲤疱疹病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体、杂交瘤细 胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及一种鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白ORF132的单克隆 抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] 鲤疱瘆病毒3型（Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)又称锦鲤疱瘆病 毒（Koi Herpesvirus，KHV)，属于痕疼病毒目（Herpesvirales)，异痕疼病毒科 (Alloherpesviridae)，鲤疱瘆病毒属（Cyprinivirus)，是一种双链线性DNA病毒，具 有囊膜结构。该病毒严重威胁鲤（Cyprinus carpio)及其观赏品种：锦鲤，致死率高达 80% -100%。鲤疱瘆病毒3型基因组约295kb，编码156个不同的0RF，目前已经确定其中 的14个0RF编码囊膜蛋白。囊膜蛋白位于病毒最外层，在病毒与宿主细胞的识别、互作以 及入侵过程中发挥着重要作用，也是建立检测方法和防治手段的重要靶分子。
[0003] 0RF132是鲤疱瘆病毒3型的一个高度保守并且特异的囊膜蛋白分子， 也是病毒的一个结构蛋白（Michel B, Leroy B 等，The genome of cyprinid herpesvirus3encodes 40proteins incorporated in mature virions,Journal of General Virology, 2010, 91:452 - 462 ；Yi Y, Zhang H等，Extracellular virion proteins of two Chinese CyHV-3/KHV isolates, and identification of two novel envelope proteins, Virus Research，2014, 191:108 - 116)，对其核苷酸序列和氨基酸使用 NCBI blast软件在蛋白质数据库和DNA数据库进行在线分析显示：0RF132是鲤疱瘆病毒3型的 特有基因，目前GenBank中已经登录了 4个毒株的0RF132序列，包括GZ11株，美国株（U)、 以色列株（I)、日本株（J)，其中GZ11株、U株、J株的0RF132基因序列完全一致，与上述3 个毒株相比，I株的0RF132基因存在一个碱基的差异：第17位碱基由T变为A，对应的第 6位氨基酸由异亮氨酸（lie)变为天冬酰胺（Asn)。根据文献（刘振兴，柯浩等，锦鲤疱瘆 病毒囊膜蛋白0RF132的克隆及分析，广东农业科学，2011，6:134-136)报道，0RF132蛋白的 97-170位氨基酸片段为主要B细胞表位区段，具有良好的免疫原性，并且该片段的氨基酸 序列在已知的鲤疱瘆病毒3型中完全一致，是一个理想的鲤疱瘆病毒3型诊断靶位。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种分泌鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体 的杂交瘤细胞株4E11。
[0005] 本发明还提供了由上述保藏编号为CCTCCNO :C2014172的杂交瘤细胞株制备的单 克隆抗体。
[0006] 本发明还提供了上述单克隆抗体在检测鲤疱瘆病毒3型上的应用。
[0007] 本发明所采用的技术方案是：
[0008] -种分泌鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11，已 于2014年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)，保藏编号为 CCTCCNO :C2014172。
[0009] -种鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO: C2014172的杂交瘤细胞株产生。
[0010] 所述单克隆抗体为IgGl亚类。
[0011] 一种检测鲤疱瘆病毒3型的试剂盒，含有保藏编号为CCTCCNO :C2014172的杂交瘤 细胞株产生的鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体。
[0012] 本发明所述的分泌鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体的杂交瘤细 胞株4E11已于2014年10月23日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养 物保藏中心（CCTCC，地址：武汉大学），保藏日期2014年10月23日，保藏编号CCTCCNO: C2014172。
[0013] 本发明主要具有如下有益效果：
[0014] 本发明通过发明人长期研宄鲤疱瘆病毒3型，选取了该病毒特有的，且具有较高 的免疫原性的鲤疱瘆病毒3型0RF132基因，通过大量的实验研宄，筛选到能稳定分泌鲤疱 瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4E11。
[0015] 本发明制备得到的杂交瘤细胞株4E11能稳定、大量制备鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白 0RF132的单克隆抗体，该抗体为IgGl亚类，可以识别天然鲤疱瘆病毒3型，并且与同属于 异疱瘆病毒科的斑点叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV ;又称为鮰疱瘆病毒1型， Ictalurid herpesvirus l，IcHV-l)无交叉反应，表现出很好的特异性，可广泛用于鲤疱瘆 病毒3型的病原学诊断、血清学检测、免疫学检测及防治等。
[0016] 本发明制备的单克隆抗体可以特异性识别鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132,可以 与该蛋白特异性结合，应用于免疫共沉淀、抗体封闭等0RF132相关的蛋白功能研宄。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为重组CyHV-30RF132的诱导表达，其中，1:未诱导的重组CyHV-30RF132蛋 白工程菌裂解液，2 :IPTG诱导的重组CyHV-30RF132蛋白工程菌裂解液，3:纯化的重组 CyHV-30RF132 蛋白。
[0018] 图2为重组蛋白的Western Blot鉴定结果，其中，1 :纯化的重组CyHV-30RF132蛋 白，2 :诱导的重组CyHV-30RF132蛋白工程菌裂解液。
[0019] 图3为CyHV-3感染的CCB细胞IFA检测结果；其中，A1 :DAPI染色，示细胞核；A2 : Cy3免疫染色A3 :A1、A2叠加图。
[0020] 图4为未感染的CCB细胞IFA检测结果；其中，B1 :DAPI染色，示细胞核；B2 :Cy3 免疫染色，B3 :B1、B2叠加图。
[0021] 图5为CCV感染的CC0细胞IFA检测结果；其中，Cl :DAPI染色，示细胞核；C2 :Cy3 免疫染色，C3 :C1、C2叠加图。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024] 主要实验材料和来源：按照水产动物诊断试验手册（OIE，2013)的方法分离鲤疱 瘆病毒3型，分尚的毒株命名为：HZ419株。
[0025] 实施例1:杂交瘤细胞株CCTCC NO :C2014172,单克隆抗体4E11的制备和应用
[0026] 一、免疫原的制备
[0027] 1、鲤疱瘆病毒3型0RF132重组表达载体的构建、重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴 定
[0028] 参照文献（刘振兴，柯浩等，锦鲤疱瘆病毒囊膜蛋白0RF132的克隆及分析，广东农 业科学，2011，6:134-136)以末端带有￡(：〇1?1和把11(1111酶切位点的引物01^132?((11^八八 TTCCGCCGTATATCGAGGCACTT SEQ ID NO. 1)/0RF132R(CCCAAGCTTTCTTAGACCTTTTAGACGATTTT GG，SEQ ID NO. 2)扩增该基因的主要B细胞表位区段编码序列（289?510位核苷酸），反应 程序：94°C预变性 2min，之后 35 个循环：94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，最后 72°C 5min。将 上述PCR产物纯化后，经HindIII、EcoRI双酶切后插入pET-32a(+)载体，构建重组0RF132 的表达载体，转化大肠杆菌ToplO。测序证实，该段基因正确插入到表达载体，并且此段序 列与GZ11株，U株、J株、I株的对应核苷酸序列一致性为100%。将包含上述载体的ToplO 工程菌扩大培养，提取质粒，转入Rosetta菌株中。参照pET表达手册（Novagen)，进行重组 蛋白的诱导表达，参照MERCK蛋白纯化说明书纯化重组蛋白并进行Western Blot鉴定。结 果见图1，图2。如图所示，构建的重组工程菌株诱导以后可以观察到一条28kDa的目的条 带，经Western Blot鉴定为重组表达的鲤疱瘆病毒3型0RF132蛋白。
[0029] 二、动物免疫及抗体效价检测
[0030] 以纯化的重组0RF132蛋白作为抗原免疫12周龄BALB/c小鼠，免疫3次，每次间 隔两周，第一次免疫，抗原加等体积的弗氏完全佐剂，后两次加等体积的弗氏不完全佐剂， 免疫剂量为60 y g/只，免疫途径为背部和腹部皮下多点注射。采用间接ELISA检测免疫小 鼠的血清抗体效价。具体方法如下：
[0031] 2. 1 ELISA所用溶液的配制：
[0032]包被缓冲液：（0. 05mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9. 6):1. 59g Na2C03, 2. 93g NaHC03溶于 800mL双蒸水中，调节pH值至9. 6,并定容至1000mL。
[0033]洗涤缓冲液（pH7. 4PBST) :0? 2g KH2P04,2. 9g Na2HP04.12H20,8. 0g NaCl，0. 2gKCl， 0.5mL Tween-20 (0.05 % V/V)以上各物质准确称量后，加双蒸水完全溶解后，调pH值至 7. 4,定容至 1000mL。
[0034] 封闭液：牛血清白蛋白（BSA) lg加入100mL的PBST中，混匀溶解。
[0035] 抗体稀释液：0. lg BSA溶于100mL PBST中，混匀溶解。
[0036]底物缓冲液：A液：Na2HP04 ? 12H20 7. 16g溶于100mL双蒸水；B液：C6H807 ? H20 2. lg，溶于100mL双蒸水。
[0037] TMB底物显色液：TMB 50mg溶于25mL无水乙醇中4°C避光保存。
[0038] TMB工作液：临用前配制，TMB底物显色液0.5mL，底物缓冲液：A液2. 57mL，底物 缓冲液液2. 43mL，双蒸水5mL，再加入30% H2020. 8 y L混勾，现用现配。
[0039]终止液：（2mol/L H2S04):双蒸水178. 3mL，逐滴加入浓硫酸（98% ) 21. 7mL〇
[0040] 2. 2 间接ELISA步骤：
[0041] 1、包被：用包被液稀释重组ORF132蛋白至浓度为3. 125yg/mL，100yL/^L，WA 96孔ELISA板，4°C包被过夜；弃去包被液，加入200 y L/孔PBST洗涤液，静置3min，弃洗涤 液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0042] 2、封闭：加封闭液，100 y L/孔，37°C条件下封闭2h，弃去封闭液，加入200 y L/孔 PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0043] 3、加样：每孔加入100yL血清，37°C作用lh，作用完毕后弃去血清样品。加入 200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0044] 4、加酶标二抗：每孔加lOOyL 1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 抗体，37°C作用lh，作用完毕后弃去二抗，加入200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将 ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0045] 5、加显色液：加入100 y L/孔的TMB底物显色液，显色液要用新鲜配制的，37°C避 光显色lOmin。
[0046] 6、加入终止液：显色完毕后，立即加入终止液终止反应，每孔50 yL。
[0047] 7、测0D值：用酶标仪测定0D450nm处吸光值。
[0048] 三、杂交瘤细胞的融合、筛选与扩大培养
[0049] 根据上述间接ELISA的检测结果，取效价较高的免疫小鼠进行细胞融合，融合前 三天加强免疫，用不加佐剂抗原腹腔注射，剂量为60 y g/只。取加强免疫后的小鼠脾细胞 与骨髓瘤SP2/0细胞，按常规PEG融合法制备杂交瘤细胞；用重组表达的0RF132包被ELISA 板，进行间接ELISA检测（操作方法同二），初步筛选到43株阳性克隆，再通过鲤疱瘆病毒3 型全病毒包被的ELISA板（包被浓度为20 y g/mL)，采用间接ELISA (除包被抗原更换为全 病毒外，其他操作方法同二）从初筛的阳性克隆中筛选能够识别天然鲤疱瘆病毒3型的阳 性克隆4株，并扩大培养；同时采用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，进行3次；对亚克 隆后的细胞株进行3次冻存、复苏试验，最终筛选到2株稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤 细胞株。经过抗体亚类分析，2株细胞分泌的单克隆抗体分别为IgM和IgGl亚类，由于小鼠 IgM半衰期短，并且通常会形成多聚体，分子量大，在免疫组化等试验中会影响其组织、细胞 的穿透性，因此，我们对IgGl亚类的单克隆抗体进一步研宄，并将分泌IgGl亚类单克隆抗 体的杂交瘤细胞株4E11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10月23日， 保藏编号为CCTCCNO :C2014172。其中，杂交瘤细胞4E11分泌抗体的稳定性分析和单克隆 抗体亚类鉴定如下。
[0050] 杂交瘤细胞4E11分泌抗体的稳定性分析：
[0051] 将杂交瘤细胞CCTCCNO :C2014172在液氮中冻存1个月后复苏，以纯化的鲤疱瘆病 毒3型全病毒为抗原包被ELISA板，（包被浓度为20 y g/mL)采用间接ELISA法（除包被 抗原更换为全病毒外，其他操作方法同二）测定细胞培养上清液中的抗体效价，然后再次 放入液氮中冻存；1个月后再次取出复苏，如此连续重复冻融3次。比较分析几次杂交瘤细 胞培养上清的抗体效价的测定值。结果表明，杂交瘤细胞CCTCCNO :C2014172经过3次反复 冻融，其细胞培养上清液抗体效价恒定，均为1:2560,说明分泌的单抗具有良好的稳定性。
[0052] 单克隆抗体亚类鉴定：
[0053]米用 Sigma 公司的 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents，测定杂 交瘤细胞4E11分泌的免疫球蛋白的亚类类型，结果表明本发明所述的单克隆抗体4E11为 IgGl亚类。
[0054] 四、杂交瘤细胞株4E11培养上清与腹水单抗效价的测定
[0055] 将杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水，连续倍比稀释，然后用间接ELISA(操作方 法同上）测定其效价。结果显示，杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1:2560,腹水抗体效价 为 1:102400。
[0056] 五、单克隆抗体4E11腹水的大量制备
[0057] 取10周龄雌性健康BALB/c小鼠，lmL/只腹腔注射石蜡油；1周后，0.5mL/只腹腔 注射浓度为5X 107/mL的杂交瘤细胞CCTCCNO :C2014172;待腹水产生足量后，收集腹水并 以2000g离心5min，上清液即为含单克隆抗体4E11的腹水。所获得的腹水可于一 80°C或 液氮中保存。
[0058] 六、单克隆抗体4E11的纯化
[0059] 采用rProteinG(GE Healthcare)亲和层析方法从上述腹水中纯化单克隆抗体，具 体步骤按试剂盒的说明书操作。纯化后的单克隆抗体4E11调整到250 y g/mL，经ELISA测 定（操作方法同二），其效价为1:102400。
[0060] 七、单克隆抗体4E11用于鲤疱瘆病毒3型的免疫荧光检测
[0061] 相关试剂配制同上。免疫荧光操作步骤参考博士德公司SABC_Cy3免疫组化试剂 盒进行，具体步骤如下。
[0062] 1、样品制备：鲤疱瘆病毒3型（HZ419株）接种96孔板培养的CCB细胞（鲤脑细 胞系），待出现CPE后，用-20 °C预冷甲醇固定，室温固定30min。弃去甲醇，加入200 y L/孔 PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0063] 2、封闭：加入200 y L/孔封闭液，37°C孵育2h，弃去封闭液，加入200 y L/孔PBST， 静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0064] 3、单抗结合：用抗体稀释液将纯化的4E11单克隆抗体（250 y g/mL) 1:100稀释， 37°C孵育lh，弃去抗体反应液，加入200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0065] 4、二抗结合：用抗体稀释液将生物素标记的羊抗小鼠IgG 1:100稀释，37°C孵育 lh，弃去抗体反应液，加入200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0066] 5、SABC-Cy3结合：用抗体稀释液将SABC-Cy31:100稀释，37°C孵育30min，弃去 SABC-Cy3,加入200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0067] 6、DAPI染色：加入100 y L/孔DAPI染色5min，弃去染液，加入200 y L/孔PBST， 静置3min，弃洗涤液，重复3次。
[0068] 7、荧光倒置显微镜（AxioObserverA1)观察拍照。
[0069] 结果见图3。结果显示，在CCB细胞的胞质区能观察到红色荧光，单克隆抗体4E11 可以特异性识别鲤疱瘆病毒3型的天然抗原（0RF132蛋白），能够应用于鲤疱瘆病毒3型的 检测。
[0070] 八、单克隆抗体4E11的特异性检测
[0071] 采用七中的免疫荧光检测方法，对未感染鲤疱瘆病毒3型的CCB细胞（鲤脑细 胞系）和感染斑点叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV;又称为鮰疱瘆病毒1型， Ictalurid herpesvirus l，IcHV-l)的CC0细胞（斑点叉尾鮰卵巢细胞系）进行免疫焚光 检测。结果见图4和图5。其中，图4显示，在未感染CyHV-3的细胞中未检测到红色荧光， 说明单抗4E11与CCB细胞无交叉反应。图5显示，在感染CCV的CCO细胞中未检测到红色 荧光，说明单抗4E11与CCV无交叉反应。
[0072] 从实验结果可知，单克隆抗体4E11与CCB细胞以及CCV无交叉反应，显示了良好 的特异性。
[0073] 九、单克隆抗体4E11应用于鲤疱瘆病毒3型的抗原捕获ELISA
[0074] 相关试剂配制同上，具体步骤如下：
[0075] 1、捕获抗体包被：用包被液稀释纯化的单克隆抗体4E11至终浓度为4 y g/mL， 100 y L/孔，加入ELISA板，4°C包被过夜；弃去包被液，加200 y L/孔PBST洗涤液，静置 3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0076] 2、封闭：加封闭液，lOOyL/孔，37°C条件下封闭2h，弃去封闭液，加200 yL/孔 PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0077] 3、加样：加入感染鲤疱瘆病毒3型（采用0IE推荐的PCR检测方法确诊）的锦鲤的 血清以及设立健康锦鲤血清的阴性对照，100 UL/孔，37°C作用lh，作用完毕后弃去样品。 加200 y L/孔PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0078] 4、加检测抗体：加100 y L/孔，终浓度5 y g/mL的鸡抗鲤疱瘆病毒3型 IgY (制备方法参照 Zhenxing Liu, Hao Ke 等，Oral Passive Immunization of Carp Cyprinus carpio with Anti-CyHV-3Chicken Egg Yolk Immunoglobulin(IgY), Fish Pathology, 2014, 49 (3) : 113 - 120)，37°C作用lh，作用完毕后弃去检测抗体，加200 y L/孔 PBST，静置3min，弃洗涤液，将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0079] 5、加酶标抗体：加100 yL/孔1:8000稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗鸡抗体 (Sigma)，37°C作用lh，作用完毕后弃去酶标抗体，加200 yL/孔PBST，静置3min，弃洗涤液， 将ELISA板在吸水纸上用力拍干，重复三次。
[0080] 6、加显色液：加入100 yL/孔TMB底物显色液，显色液要用新鲜配制的，37°C条件 下避光显色5min。
[0081] 7、加入终止液：显色完毕后，立即加入终止液终止反应，每孔50 yL。
[0082] 8、测0D值：用酶标仪测定0D450nm处吸光值。
[0083] 结果显示，阳性血清与阴性血清的0D值分别为1. 102、0. 245, P/N>2. 1，由杂交瘤 细胞CCTCCNO :C2014172产生的单克隆抗体4E11可以应用于鲤疱瘆病毒3型感染的血清学 诊断。
[0084] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1. 一种分泌鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编 号为 CCTCCNO :C2014172。
2. 鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏编号为 CCTCCNO :C2014172的杂交瘤细胞株产生。
3. 根据权利要求2所述的鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体，其特征在 于，所述单克隆抗体为IgGl亚类。
4. 权利要求2-3任一项所述的鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体在制备 检测鲤疱瘆病毒3型的试剂中的应用。
5. -种检测鲤疱瘆病毒3型的试剂盒，其特征在于，包括有保藏编号为CCTCCNO : C2014172的杂交瘤细胞株产生的鲤疱瘆病毒3型囊膜蛋白0RF132的单克隆抗体。
【文档编号】C12N5/20GK104450627SQ201410823311
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】刘振兴, 柯浩, 马艳平, 郝乐, 马江耀, 梁志凌 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所