一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法。该方法是将泰蚕茧剪碎后放入碳酸氢钠溶液中进行脱胶处理，再将脱胶后的泰蚕丝进行水洗、烘干；将脱胶干燥后的泰丝放入氯化钙?甲酸溶液中，泰丝可以被快速溶解形成丝素蛋白溶液；将过滤后的丝素蛋白溶液进行干燥处理，便可得到再生蚕丝蛋白膜。本发明方法可避免传统方法制膜的繁琐过程；降低生产后所形成有机废水处理的难度，朝着环境友好型方向发展；通过调节氯化钙的浓度，可制得光滑、难溶于水和热稳定性高的蚕丝膜。这种再生蚕丝蛋白膜不仅具有良好的生物相容性，还可以拥有不同透明度、光滑平整度和水溶性以及热稳定性，根据其产品所需的性能灵活调控，可以更好的应用于化工、医药和食品行业。
【专利说明】
一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法
技术领域
[0001 ]本发明属于高分子领域，涉及一种再生蚕丝蛋白膜的加工处理方法，尤其是在蚕丝蛋白膜制作方法上，展示出了简单高效的特点，同时该方法可以调控膜的结构与热稳定性。本发明可为蚕丝蛋白在化工、医药、食品等领域的研究与应用提供了一定的实验和理论依据。
【背景技术】
[0002]蚕丝蛋白，又名丝素蛋白，是由蚕茧脱胶提取而得的纤维蛋白质，它是由18种氨基酸组成，主要是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸，这些都与人体皮肤的角质蛋白中的氨基酸很接近。此外，这18种氨基酸中含有8种人体所必需的氨基酸。蚕丝蛋白具有良好的生物特性，如无毒、无刺激性，生物相容性，最小的炎性反应，促进伤口愈合的能力等。蚕丝蛋白这些独特的生物特性，正不断激发专家学者们的研究兴趣。为此，近年来国内外学者对蚕丝的研究热度是在逐年攀升。
[0003]泰国家蚕丝，顾名思义，它也是家蚕丝的一种，产自于泰国Nakornratchasima皇后养蚕中心。其颜色呈黄色，玻璃化转变温度较低，有较好的韧性([J] Journal of ThermalAnalysis and Calorimetry.2015,122(3): 1069-1076)，现如今泰丝虽主要是用来做高档服饰，但随着对蚕丝生物特性研究热度的攀升，近些年已有部分专家学者将泰丝与明胶共混制作骨支架，并将其应用于临床医疗上。本项发明我们选用泰丝做研究，期待可以为泰丝在该领域的研究提供一定的帮助。
[0004]蚕丝蛋白在稀溶液中主要以无规则线团结构为主，但在一定的外界条件下(温度、浓度、PH值、金属离子和溶剂等)可以使蚕丝蛋白的主要两种结构发生相互转变，从而改变蚕丝的化学稳定性和力学性能，其中丝蛋白的主要两种结构分别为:silkl结构(无规线团和α-螺旋结构)，si IkII结构(β-折叠结构)。对于蚕丝蛋白溶液，我们可以制成薄膜、凝胶和海绵状等各种形状，作为伤口敷料、生物传感器和药物控释载体等材料，在生物医药领域有巨大的应用前景。
[0005]关于金属离子(钙离子)对丝素结构的影响，根据文献([J]光谱法研究钙离子对丝素蛋白溶解过程中结构的影响.2014,33(12):1410-1415和[J]氯化钙对尼龙6无定型转变过程的在位红外研究.2004.24(3): 295-298)总结得出:氯化钙在蚕丝蛋白溶液中，一方面钙离子与丝素蛋白分子链上的酪氨酸和丝氨酸的侧链羟基发生配位螯合作用，破坏了丝素蛋白分子链上的氢键;另一方面钙离子对羰基具有强的诱导作用，有利于共振式的碳氮双键结构的形成。因此改变了丝素蛋白的构象，进而可能改变其热稳定性。依据此原理，我们可以制备出结构与热稳定性可控的蚕丝膜。
[0006]在传统的制备蚕丝膜过程中:丝素需要在沸腾的氯化钙溶液中才能快速溶解形成再生丝素蛋白溶液([J]蚕丝不同溶解方法的研究.2011，52( 11): 665-668.)，而且这种方法会使丝素蛋白的活性几乎全部丧失；用氯化钙\乙醇\水三元溶液或者溴化锂溶液来溶解丝素(CN 104448844A)，发现其溶解过程是很缓慢的；另外，丝素蛋白溶液的透析不但是一个缓慢的过程，而且还是一个浪费水资源的过程。例如:中国发明专利“丝素蛋白水凝胶的制备方法”(CN 104045841A)中滤液需经过自来水透析8-10小时，再用蒸馏水透析8-10小时；中国发明专利“一种难溶于水的柔韧丝素膜的制备方法” (CN 104448844A)需要将丝素蛋白溶液透析3天，期间每隔2小时换一次去离子水。
[0007]以上制备膜或水凝胶的方法不仅耗时还浪费资源，还不适合工业化生产。因此，需寻找一种简单高效，环境友好的方法来解决膜制作过程中的繁琐及浪费资源问题。
【发明内容】
[0008]本发明针对目前已有的丝素蛋白膜制备方法中需经过二次处理才制得难溶于水或者其他特性的丝素膜，以及操作步骤多，使用有机溶剂多，部分生物特性会被破坏，环境不友好等缺陷，做了简化和改进处理。本申请将提供一种再生蚕丝蛋白膜及其制备方法。该方法简单高效，方便灵活;根据氯化钙浓度的高低，可以灵活地调控丝素膜的形态、结构和丝素膜水溶性、热稳定性。
[0009]在本发明的实施例中，所用的材料为泰蚕丝。泰蚕丝是家蚕丝的一种，属于天然的高分子材料，具有良好的生物相容性、生物降解性。现逐渐为人们所关注，大多是源于蚕丝所含的氨基酸与人体内的相同及独特的晶型结构，有着良好的理化性能。现在蚕丝的应用领域正积极向食品、化工和生物医学等领域延伸，如用蚕丝蛋白来制造药物缓释剂、生物传感器、角膜及伤口敷料等。本发明可为天然高分子材料在食品、化工和生物医学等领域提供新方法和途径，为泰国蚕丝产品的研发和应用打下基础。
[0010]本发明所采用的技术方案是:
[0011 ] —种再生蚕丝蛋白膜的制备方法，包括以下步骤:
[0012](I)将剪碎的泰蚕茧放置在浓度为0.21wt%的碳酸氢钠沸水溶液中进行30-60min的脱胶处理，再用去离子水洗涤2-3次;最后将洗好的脱胶泰蚕丝自然风干；
[0013](2)将步骤(I)中风干好的脱胶泰蚕丝放入氯化钙-甲酸溶液，在室温下即可被快速溶解，形成蚕丝蛋白溶液；
[0014](3)将步骤(2)中的蚕丝蛋白溶液用微孔滤膜过滤，再将滤液浇铸在聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具上，烘干，从而制得泰蚕丝蛋白膜。
[0015]所述步骤(2)中脱胶泰蚕丝与氯化钙-甲酸溶液中的溶解比例范围是1.0Og:100.0Og-1.00g:6.00g。
[0016]所述步骤(2)中氯化钙最高浓度可达到35wt%。当氯化钙溶液浓度小于2.0wt%时，再生蚕丝蛋白膜中蚕丝蛋白分子的构象主要是Silkn结构(β-折叠结构)，其宏观现象表现为膜难溶于水；当氯化钙浓度大于等于2.0?〖％时，蚕丝蛋白的构象主要是SilkI结构(无规线团和螺旋结构)，膜表现出易溶于水的特性。同时还发现:随着氯化钙浓度的增大，再生丝素蛋白膜表面变的更加平整光滑，膜的热稳定性也在逐渐增大。
[0017]所述步骤(3)中微孔滤膜为孔径0.45-2.ΟΟμπι。
[0018]所述步骤(3)中干燥温度控制在35-70°C范围内，干燥时间为3-24小时。
[0019]作为上述技术方案的优选，步骤(I)中脱胶处理的工艺条件:碳酸氢钠的浓度为
0.21wt%，蚕苗与碳酸氢钠的浴比1.0Og:400ml，脱胶30min。
[0020]作为上述技术方案的优选，步骤(2)中将脱胶后的泰蚕丝素按0.17g泰蚕丝素:1.90g氯化钙溶液的比例加入到氯化钙溶液中溶解，得到8.2wt %的泰丝蛋白溶液。
[0021]作为上述技术方案的优选，步骤(3)中泰蚕丝蛋白溶液用孔径0.45μπι的聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤，将滤液浇铸在PDMS上，再将其放置在45 V烘箱内干燥5小时。
[0022]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:本发明通过高纯度的甲酸为溶剂(88 %的分析纯度、98 %的色谱纯度、85 %、90 %或95 %工业级纯度)，以氯化钙(96 %的分析纯度)为溶质配置成氯化钙-甲酸溶液。在常温下使用该溶液便可快速溶解泰丝素，其操作过程简单方便，生产成本低，生产周期短；降低了生产后所形成的有机废水处理的难度，朝着环境友好方向发展。此外，还可以通过氯化钙的含量来调控再生蚕丝膜的形貌、结构、水溶性和热稳定性，以满足不同领域对材料性能的需求。
[0023]本发明制备的膜可作为面膜、伤口敷料、眼角膜、支架材料和食品包装等材料分别应用于化工、医药、食品等不同领域。
【附图说明】
[0024]图1不同氯化钙浓度下制备的泰蚕丝蛋白膜的电镜图(图中Α、Β和C分别对应实施例1、实施例2和实施例3中的制备的蚕丝蛋白膜)。
[0025]图2不同氯化钙浓度下制备的泰蚕丝蛋白膜的红外吸收光谱(图中Α、Β和C分别对应实施例1、实施例2和实施例3中的制备的蚕丝蛋白膜)。
[0026]图3不同氯化钙浓度下制备的泰蚕丝蛋白膜的热重分析图谱(图中Α、Β和C分别对应实施例1、实施例2和实施例3中的制备的蚕丝蛋白膜)。
【具体实施方式】
[0027]实施例1:
[0028]称取5.0Og剪碎的泰蚕丝茧壳，放入到2000ml浓度为0.21wt%的碳酸氢钠沸水溶液中进行30min的脱胶处理。再用去离子水反复洗涤2-3次后，移至通风处自然风干，便可得到脱胶泰蚕丝。
[0029]配置浓度为1.5wt%的氯化钙-甲酸溶液并称取该溶液1.90g，将其放置在规格2ml离心管中，再将0.17g脱胶泰蚕丝放置溶液中进行溶解，发现泰蚕丝2分钟就可以被溶解完全，便可得到泰蚕丝蛋白溶液。
[0030]用孔径为0.45μπι的PTFE微孔滤膜过滤泰丝蛋白溶液，将滤液浇铸在PDMS上，再将其放置在45°C烘箱内干燥5小时便可制得泰蚕丝蛋白膜。
[0031]实施例2:
[0032]称取5.0Og剪碎的泰蚕丝茧壳，放入到2000ml浓度为0.21wt%的碳酸氢钠沸水溶液中进行30min的脱胶。再用去离子水反复洗涤2-3次后，移至通风处自然风干，便可得到脱胶泰蚕丝。
[0033]配置浓度为2.0wt%的氯化钙-甲酸溶液并称取1.90g，将其放在规格2ml离心管中，再将0.17g脱胶后的泰蚕丝放置溶液中进行溶解，发现泰蚕丝Imin就可以被溶解完全，便可得到泰蚕丝蛋白溶液。
[0034]用孔径为0.45μπι的PTFE微孔滤膜过滤泰蚕丝蛋白溶液，将滤液浇铸在PDMS上，再将放置在45°C烘箱内干燥5小时便可制得泰蚕丝蛋白膜。
[0035]实施例3:
[0036]称取5.0Og剪碎的泰蚕丝茧壳，放入到浓度为0.21wt %的碳酸氢钠沸水溶液中进行30min的脱胶。再用去离子水反复洗涤2-3次后，移至通风处自然风干，便可得到脱胶泰蚕丝。
[0037]配置浓度为6.0wt %的氯化钙-甲酸溶液并称取该溶液1.90g，将其放置在规格2ml离心管中，再将0.17g脱胶后的泰蚕丝放置溶液中进行溶解，发现泰蚕丝30s就可以被溶解完全，便可得到泰蚕丝蛋白溶液。
[0038]用孔径为0.45μπι的PTFE微孔滤膜过滤泰丝蛋白溶液，将滤液浇铸在PDMS上，再将其放置在45°C烘箱内干燥5小时便可制得泰蚕丝蛋白膜。
[0039](I)蚕丝蛋白膜表面形貌结构的比较
[0040]图1为上述实施例中泰蚕丝蛋白膜的电镜图，图1A是在1.5wt%的氯化钙浓度下制得的泰蚕丝蛋白膜，可以看到有丝素纤维结构；当氯化钙浓度达到2.0wt% (图1B)时，膜表面纤维结构膨润到一定程度后出现了溶解现象；图1C是6.0wt%浓度下制得的蚕丝蛋白膜表面纤维溶解更完全。由此推出:随着溶液中氯化钙含量的增加，蚕丝蛋白膜表面的纤维结构逐渐逐渐膨润，膜表面逐渐变得均匀和平整。
[0041](2)蚕丝蛋白膜的分子结构的比较
[0042]图2是1800cm—?ΗδΟαιΓ1范围内泰蚕丝蛋白膜的傅里叶变换红外曲线。图2中曲线A是氯化I丐浓度为1.5*1:%制作的蚕丝蛋白膜的红外特征峰分别出现在1623cm—1和1516cm一、表明蚕丝蛋白结构在此波数下主要是silkn结构(β-折叠结构)，在水中表现出难溶于水的性质；当溶液中氯化钙浓度达到2.0wt% (图2中的曲线B)时，酰胺I区出现两个弱吸收峰，分别在1623cm—1和1645cm—S酰胺Π区出现两个吸收峰，分别在1516cm—1和1535cm—S然而在1645cm—1和1535cm—1是si IkI结构(无规线团和α-螺旋结构)为主;可以看出2.0wt %浓度下制备的蚕丝蛋白膜的分子结构是同时含有β-折叠结构、α-螺旋结构和无规线团结构。说明2.0wt%氯化I丐是蚕丝蛋白的结构由silkn向silkl转变的过渡浓度。当溶液的浓度达到
6.0wt % (图2中曲线C)时，蚕丝蛋白膜的分子构象以si Ikl结构(α-螺旋结构和无规线团结构)为主，宏观现象表现为膜会极易溶于水的特性。
[0043 ] (3)蚕丝蛋白膜的热稳定性的比较
[0044]图3中曲线Α、Β和C分别对应于上述实施例1，实施例2和实施例3的泰蚕丝蛋白膜的热重分析谱图，从图3看出由曲线A的起始分解温度Tcinset为272°C ;曲线B的T_et达到283°C ；对于曲线C可达297°C，通过比较得出蚕丝蛋白膜的起始分解温度随着溶液中氯化钙浓度的增大而增大，且残余量也是在增加的，进一步说明蚕丝膜的热稳定是随着氯化钙的浓度增大而增大的。
[0045]由此可见，本发明是可以获得结构与性能可控的蚕丝膜，且制做过程简单方便，无毒，环境友好。
【主权项】
1.一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将剪碎的泰蚕茧放置在浓度为0.21wt%的碳酸氢钠沸水溶液中进行30-60min的脱胶处理，再用去离子水洗涤2-3次;最后将洗好的脱胶泰蚕丝自然风干； (2)将步骤(I)中风干好的脱胶泰蚕丝放入氯化钙-甲酸溶液，在室温下即可被快速溶解，形成蚕丝蛋白溶液； (3)将步骤(2)中的蚕丝蛋白溶液用微孔滤膜过滤，再将滤液浇铸在聚二甲基硅氧烷模具上，烘干。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中的脱胶处理，泰蚕茧与碳酸氢钠沸水溶液浴比为1.0Og: 400ml。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的氯化钙-甲酸溶液，以氯化钙为溶质，甲酸为溶剂，所配置的氯化钙-甲酸溶液浓度不超过35wt%。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化钙的纯度为96%，甲酸的纯度是:88%的分析纯、98 %的色谱纯、85 %、90 %或95 %工业级纯度。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中的微孔滤膜的孔径0.45-2.00μmD6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中将脱胶后的泰蚕丝素，按0.17g泰蚕丝素:1.90g氯化钙溶液的比例加入到氯化钙溶液中进行溶解，得到8.2wt%的泰丝蛋白溶液;步骤(3)中泰蚕丝蛋白溶液用孔径0.45μπι的聚四氟乙烯滤膜过滤，将滤液浇铸在聚二甲基硅氧烷模具上，再将其放置在45 °C烘箱内干燥5小时。7.根据权利要求1所述的一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法，其特征在于:利用氯化钙浓度来调节膜中丝素蛋白的结构，以及膜表面的形貌和热稳定性。8.根据权利要求7所述的一种再生蚕丝蛋白膜的制备方法，其特征在于:当氯化钙溶液浓度小于2.0wt %时，再生蚕丝蛋白膜中蚕丝蛋白分子的构象主要是SiIk Π结构，其宏观现象表现为膜难溶于水；当氯化钙浓度大于等于2.0?〖％时，蚕丝蛋白的构象主要是SilkI结构，膜表现为易溶于水的特性。
【文档编号】C08J5/18GK105885070SQ201610289639
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】王昉, 于海洋, 顾正桂
【申请人】南京师范大学