专利名称：多功能型海参养殖用复合微生态制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物制剂技术领域，特别涉及一种包含三种益生菌的，具有抗菌、免疫、促生长等多重功效的多功能型海参养殖用复合微生态制剂。
背景技术：
肠道益生菌是一种大多来源于消化道又作用于消化道的活菌制剂，能有效补充动物消化道内的有益微生物，抑制病原菌的生长，改善消化道菌群平衡，提高水产动物的免疫机能或者生长速度。刺参(Apostichopus japonicus Liao，又称仿刺参)，属无脊椎动物，棘皮动物门， 海参纲，仿刺参属。因其营养价值高，养殖规模不断扩大，目前已经发展成为我国沿海最大的海水养殖品种之一。近年来由于刺参高密度养殖和不规范运作以及病害防治技术的相对滞后，病害问题目趋突出，尤其养殖刺参“腐皮综合征”的暴发，造成了严重的经济损失，制约了该产业的健康持续发展。由于刺参特殊的生活习性和养殖特点，且抗生素药物等疾病预防措施本身又存在一些缺点和局限性，故采用微生态制剂将成为防止刺参养殖疾病发生的有效措施之一。根据来源于自然，回归自然的原则，筛选与原宿主、原生境、原微生态区系、原微生物种群相适应的菌种是开发微生态制剂的最好途径。面对目前海参专用微生态制剂匮乏的局面，从海参肠道筛选益生菌并开发成微生态制剂，避免了不同菌株之间的差异，保证微生态制剂的安全性和高效性。因此，从海参肠道中分离土著益生菌，通过对相关菌株的配伍达到抗菌、免疫、促生长的多重效果，对海参健康养殖有现实意义。迈入21世纪，海参养殖业迅速发展，养殖面积84200公顷，年创产值200亿元，产生了巨大的经济和社会效益，成为我国北方水产养殖的支柱产业之一。随着海参养殖业迅速发展，高密度、工厂化、集约化的养殖模式使生态环境失调严重，各种病害接踵而至。近年来，海参“腐皮综合症”等多种细菌性疾病的流行，使病害问题成为该产业发展的主要瓶颈。抗生素等化学药物的应用对控制病原菌的生长繁殖、防止海参病害起到了一定的积极作用，但由于长期、大量使用抗生素等化学药物，病原菌也产生耐药性，海参肠道与养殖环境中菌群失调，海参免疫力下降，各种疾病复发率较高，同时药物残留严重，危害着养殖动物机体和人类健康。因此，开发应用微生态制剂对海参养殖具有重要的现实意义。海参营底栖生活，通过摄食饲料中添加的肠道微生态制剂可起到抑制有害菌、提高抗病力、促进生长等功效。益生菌大多来源于消化道又作用于消化道的活菌制剂，能有效补充动物消化道内的有益微生物，抑制病原菌生长，改善消化道菌群平衡，提高水产动物的免疫机能或生长速度，因此，微生态制剂是目前常用和研究较多的绿色、安全的饲料添加剂。近年来，人们开始利用微生态制剂改变养殖动物肠道与环境中微生态组成，从而改善养殖生态环境、提高养殖动物的免疫力，尤其是由多菌种组成的复合微生态制剂的开发和应用，为水产养殖业朝着绿色健康养殖的方向发展起着积极作用。
在本发明之前关于水产动物益生菌的报道较多，如权力敏等“水产养殖益生菌素”(专利申请号200610042574. 0)，王连民等“促进淡水鱼生长发育的益生菌组合物”(专利申请号200710057106. 5)，而有关海参肠道与养殖环境益生菌筛选的报道较少。微生态制剂中菌种的选择是微生态制品的关键环节。选择菌种的标准必须以微生态学理论为指导，根据来源于自然，回归自然的原则，选择与原宿主、原生境、原微生态区系、原微生物种群相适应的菌种最理想。来自于动物本身的益生菌避免了不同菌株之间的差异，保证了对宿主有较高的针对性，提高了应用于宿主的安全性和高效性。因此，从海参肠道中分离土著益生菌，通过对相关菌株的配伍达到抗菌、免疫、促生长的多重效果，对海参健康养殖有现
实意义ο
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种适应海参肠道与养殖环境的抗菌、免疫、促生长多重功效的多功能复合微生态制剂，从而减少海参养殖过程中抗生素等化学药物的使用。本发明获得益生菌安全性好，对海参病原菌抑制效果好，并且能提高海参特定生长率、降低海参的死亡率、提高海参的免疫力和肠道消化酶活力，达到了抗菌、免疫、促生长的多重效果。为解决上述技术问题，本发明提供一种多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，包括萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis, 蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，以及载体。所述萎缩芽孢杆菌，优选为分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。所述枯草芽孢杆菌，优选为分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010314。所述蜡样芽孢杆菌，优选为分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010315。所述载体优选为粒径< 80目的沸石粉。所述复合微生态制剂中，萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus，枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，的重量份数比优选为1 2份1 2份1 2份。为解决上述技术问题，本发明还提供一种枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2010314。为解决上述技术问题，本发明又提供一种饲料添加剂，包括枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010314。为解决上述技术问题，本发明另提供一种所述枯草芽孢杆菌菌株作为饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的应用。为解决上述技术问题，本发明再提供一种所述枯草芽孢杆菌菌株在饲料添加剂、 微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。本发明具有以下有益的技术效果，
1)筛选益生菌之间共生性好，对海参病原菌有较好的拮抗作用，并且具有提高海参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能，通过益生菌之间的配伍达到了抗菌、免疫、 促生长的多重功效。2)筛选益生菌是从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。3)使用方法简便，只需将该制剂按照配比添加到饲料中进行投喂即可，适用于幼参养殖培育和各种养殖模式的海参疾病控制。4)使用本发明可减少或替代抗生素的使用，对减少药残、提高海参商品质量、保障食品安全具有重要作用。
图1为本发明实施例所述微生态制剂对海参体腔液酸性磷酸酶活力的影响结果图；图2为本发明实施例所述微生态制剂对海参体腔液碱性磷酸酶活力的影响结果图；图3为本发明实施例所述微生态制剂对海参肠道蛋白酶活性的影响结果图；图4为本发明实施例所述微生态制剂对海参肠道淀粉酶活性的影响结果图。
具体实施例方式以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1 潜在益生菌的筛选及安全性实验取野生健康海参，在无菌条件下对海参进行活体解剖，取其肠道，挤出肠道内容物，用灭菌的15%。的生理盐水冲洗肠道三次，将冲洗后的肠道勻浆，等比稀释后涂布在 TSB培养基和2216E海水琼脂培养基上，选择合适稀释度的平板进行细菌的分离，共得到 240株细菌。对240株纯培养的细菌用酪素水解培养基和淀粉水解培养基培养对其产酶活力进行测定，同时以海参常见病原菌-灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas nigrifaciens)禾口嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlia)为才旨不菌， 利用点种法、十字交叉法和牛津杯法检测所分离细菌对海参病原菌的抑菌作用，共筛选出了 3株抑菌效果好和产酶能力强的细菌。通过对这3株菌进行形态、生理生化和分子鉴定， 结果显示筛选得到的3株益生菌分别为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，将这3株细菌保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号分别为萎缩芽孢杆菌CCTCC M 2010316、枯草芽孢杆菌CCTCC M 2010314、蜡样芽孢杆菌CCTCC M 2010315。3株菌之间的拮抗实验结果显示3株菌之间均无拮抗作用，等比进行配伍，可显著提高对致病菌的拮抗作用，结果见表 1。表1 配伍菌株和单株菌拮抗作用对比结果组别灿烂弧菌致病菌假交替单胞菌嗜水气单胞菌复合微生态制剂30.91 mm33.44 mm35.13 mm萎缩芽孢杆菌21.58 mm24.32 mm22.92 mm枯草芽孢杆菌19.47 mm30.11 mm33.56 mm蜡样芽孢杆菌29.67 mm19.12mm15.51mm挑取活化18h的3株待检测菌株，分别用15%。灭菌的生理盐水制成1 X 1010CFU/mL 的菌悬液，等比稀释至ι χ 105CFU/mL。用注射的方法进行感染试验，每头海参注射0. 2mL菌悬液，阴性对照设为注射相同剂量的灭菌生理盐水组，空白组为不对其进行任何处理的组， 阳性对照设为注射相同剂量的不同浓度梯度的假交替单胞菌(P.nigrifaciens)，感染后， 每天观察海参的摄食活动、生理反应、体表变化及死亡情况。结果显示阳性对照海参出现不同程度的死亡，而3株益生菌实验组均未出现死亡情况，只是在1 X 1010CFU/mL注射组出现摄食差和个别海参吐脏的现象，在IX 109CFU/mL以下组均未出现不良反应。通过上述试验证实3株菌对海参安全无毒。实施例2 三种益生菌活性制剂的制备萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus) CCTCC M 2010316菌粉、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtil is) CCTCC M 2010314 菌粉、赌样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CCTCC M 2010315菌粉的制备方法，包括如下步骤A、平板培养复壮分别将-80°C保存的萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌接种于TSB平板培养基上，于培养Mh，使菌种复壮并形成单菌落；B、种子液的制备将步骤A培养的菌种用15%。灭菌的生理盐水制成1 X 105CFU/mL 的菌悬液，以5%的接种量接种于盛有IOOmL无菌的TSB液体培养基的250mL三角烧瓶中， 280C，170rpm 振荡培养 18 20h ；C、发酵培养将步骤B中的种子液以5%的接种量接种于盛有2L无菌发酵培养基的5L三角瓶中，280C，170rpm振荡培养84h，至活菌数为2 4X 109CFU/mL，中止发酵；
所述发酵培养基为葡萄糖1 2 %，大豆粉饼1 2 %，氯化钠1 %，其余为水；D、益生菌活性菌剂的制备向步骤D的发酵液中加入沸石粉，每IOOmL发酵液中加入IOg沸石粉，170rpm振荡40min后静止40min，将上述发酵液于4°C 6000rpm离心 20min,弃上清，每IOOg沉淀中再加入20 40g的沸石粉混合均勻后，于45 50°C烘干 3 4h，分别得到3株菌的益生菌活性菌剂，活菌测定结果显示所制得的菌剂活菌含量达到 1 X 109CFU/g 以上。实施例3 多功能海参养殖用复合微生态制剂的制备将萎缩芽孢杆菌CCTCC M2010316菌粉、枯草芽孢杆菌CCTCC M 2010314菌粉、蜡样芽孢杆菌CCTCCM 2010315菌粉，按照重量配比1 1 1进行配伍，混勻，制备得到复合微生态制剂。实施例4 复合微生态制剂对海参的生长、存活率、免疫指标及肠道消化酶活力的影响。将所制备的复合微生态制剂按照饲料重量的3%。添加到饲料中，进行投喂海参试验。试验用海参采自某海参养殖公司，暂养7天后，挑选大小相似、活力较好的海参进行试验，海参体重初始为11. 94士 2. 38g，体长4. 96 士 1. 87cm，试验期间，海水盐度为四 31，pH值为7. 46 8. 02，溶解氧为5. Og/L以上，水温为12 16°C，试验周期为60天。试验分为3组，对照组投喂不添加微生态制剂的海参饲料，试验组2为投喂添加3%。单一枯草芽孢杆菌制剂的海参饲料，试验组3为投喂添加3%。本发明的复合微生态制剂的海参饲料， 每组3个重复，每个重复15头海参。在试验的第0d、30d和60d测定海参体重并计算特定生长率(SGR)和存活率，测定海参肠道蛋白酶活性和淀粉酶活性，测定海参体腔液的酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)活性。在投喂试验结束后，从每个重复组中随机抽取10头海参，用灿烂弧菌进行人工攻毒感染试验，每头海参注射200 μ L浓度为1 X 109CFU/mL的灿烂弧菌菌液，记录攻毒后三周内两组的死亡率。试验结果如下在促生长方面，利用单一枯草芽孢杆菌制剂和本发明的复合微生态制剂采用拌饲投喂，进行海参养殖试验，试验结果如表2所示，添加单一枯草芽孢杆菌制剂和本发明的复合微生态制剂组，均能显著提高海参的特定生长率(SGR，Ρ<0. 05)，并且能提高海参的存活率。表2 微生态制剂对海参存活率及特定生长率的影响,
权利要求
1.一种多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，包括萎缩芽孢杆菌 Bacillus atrophaeus, 古 H 包 If lif Bacillus subtilis, ifa # ^ If lif Bacillus cereus,以及载体。
2.根据权利要求1所述多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌，分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010316。
3.根据权利要求1或2所述多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌，分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010314。
4.根据权利要求1 3中任一项所述多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌，分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC M 2010315。
5.根据权利要求1 4中任一项所述多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，所述载体为粒径< 80目的沸石粉。
6.根据权利要求1 5中任一项所述多功能型海参养殖用复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂中，萎缩芽孢杆菌Bacillusatrophaeus，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，赌样芽孢杆菌Bacillus cereus，的重量份数比为1 2份1 2份1 2 份。
7.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2010314。
8.—种饲料添加剂，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株分离于野生刺参肠道，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2010314。
9.一种如权利要求7所述枯草芽孢杆菌菌株作为饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的应用。
10.一种如权利要求7所述枯草芽孢杆菌菌株在饲料添加剂、微生物制剂和/或肠道益生元的制备中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种多功能型海参养殖用复合微生态制剂，包括萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，以及载体。本发明筛选益生菌之间共生性好，对海参病原菌有较好的拮抗作用，并且具有提高海参生长速度、免疫力和肠道消化酶活力的功能，通过益生菌之间的配伍达到了抗菌、免疫、促生长的多重功效。从海参肠道中筛选的土著菌，对海参安全无毒、繁殖速度快、易于培养、对环境适应能力强，能较快的繁殖形成优势菌。使用方法简便，只需将该制剂按照配比添加到饲料中进行投喂即可，适用于幼参养殖培育和各种养殖模式的海参疾病控制。对提高海参商品质量、保障食品安全具有重要作用。
文档编号C12R1/07GK102283328SQ20101060229
公开日2011年12月21日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者廖梅杰, 张正, 李彬, 梁友, 王印庚, 王岚, 荣小军, 薛太山, 陈霞 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所