专利名称：具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA_RH5及其编码基因与应用。
背景技术：
1994年Fuqua等人首次发现微生物群体在生长过程中，因群体密度增加，其生理生化特性发生变化，出现少量菌体或单个菌体所不具备的一些特征。种群密度达到阈值时，所分泌的自诱导信号分子(autoinducers, Al)也达到一定浓度。Al与受体结合后，通过信号传导而影响特定基因表达，调控群体生理特征，这就是所谓的群体感应(quorum-sensing, QS)。
随着病原菌耐药性特别是多重耐药性的日益严重，抗菌药作用新靶点的发现和新型抗菌药物的研发显得尤为重要。众多病原菌的致病基因受到QS的调控，包括毒力因子、黏附因子以及介导病原菌抵抗宿主免疫和药物的相关基因。在众多的Al中研究最为深入的是调控革兰氏阴性群体感应的信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL)。迄今发现的酰基高丝氨酸内酯降解酶有两大类，一类是酰基高丝氨酸内酯酶，一类是酰基高丝氨酸酰基转移酶。而红球菌中产生的一种氧化还原酶(QsdA)是一类具有酰基高丝氨酸内酯酶活性的淬灭酶。目前已报道的N-酰基高丝氨酸内酯酶，底物特异性较为广泛，缺乏底物专一性，这使得在应用时对没有致病性的菌种的正常调控受到影响。因此，发掘专一性强，针对性强的新N-酰基高丝氨酸内酯酶，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA_RH5及其编码基因与应用。本发明所提供的QsdA_RH5蛋白来自红平红球菌(Rhodococcus erythropolis),具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能，为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白质。为了使(a)或(b)中的QsdA-RH5蛋白便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氣基末端或竣基末端连接上如表I所不的标签。表I标签的序列
标签残基数序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列I衍生的蛋白质。
2.权利要求I所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述基因，其特征在于所述基因为如下I)或2)或3)的DNA分子 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性蛋白的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于 所述重组表达载体是将所述基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的； 所述重组菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)QsdA_RH5,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 6569。
6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求I所述蛋白在降解N-酰基高丝氨酸内酯或制备N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述N-酰基高丝氨酸内酯为C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL、C8-HSL、ClO-HSL 和 C12-HSL 中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述降解的pH值为7.0— 9.0，或7.0—8. 0，或 7. 5—8. 0 ;具体可为 8. 0,7. 5,7. 0 或 9. O。
10.根据权利要求7—9中任一所述的应用，其特征在于所述降解的温度为0 — 65°C，或 10—50°C，或 10—40°C，或 10—35°C，或 20-35°C，或 25-35°C，或 30-35°C;具体可为(TC、l(TC、2(TC、25t、3(rC、35t、4(rC、5(rC*65t。
全文摘要
本发明公开了具底物特异性的N-酰基高丝氨酸内酯酶QsdA-RH5及其编码基因与应用。所述蛋白QsdA-RH5是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-酰基高丝氨酸内酯酶功能的由序列表序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的QsdA-RH5蛋白，具有底物特异性，可降解各种无取代集团的N-酰基高丝氨酸内酯，其作为N-酰基高丝氨酸内酯酶的比活力为292.83U/mg，在pH范围为4.0-12.0间都很稳定，可保持90%以上的酶活；热稳定性较好，在70℃保温10min的相对酶活仍为100%。本发明所提供的QsdA-RH5蛋白可用于制备新型生防酶制剂。
文档编号C12N15/63GK102965357SQ20121050944
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者周志刚, 张美超, 杨雅麟, 徐俐, 李青, 姚斌, 于会民, 何夙旭 申请人:中国农业科学院饲料研究所