专利名称：生产l-赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物工业。更具体地讲，本发明涉及通过发酵生产L-赖氨酸的方 法，以及用于该生产方法的微生物。
背景技术：
在通过发酵生产L-赖氨酸时，通常使用从天然或人工突变菌株中分离的菌株， 以便提高其产量。有许多能产生L-赖氨酸的人工突变菌株是众所周知的，其中的很多是 S-2-氨乙基半胱氨酸(AEC)抗性菌株，并且属于短杆菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏 菌属。另外，业已披露了用于提高氨基酸产量的各种方法，例如，使用通过重组DNA获得的 转化体。例如，对于埃希氏菌属细菌来说，在以下文献中业已披露了用其中的二氢吡啶二 羧酸合成酶(DDPS)活性增强了的菌株生产L-赖氨酸的方法日本专利申请公开(Kokai) No. 56-18596，US4，346，170 和‘应用微生物学和生物技术，，15，pp. 227-231 (1982)。另外，韩 国专利申请NO. 92-8382中业已披露了通过用向其中导入了源于棒杆菌属细菌的DDPS的埃 希氏菌属细菌生产L-赖氨酸的方法。另外，在国际公开N0.W095/16042中披露了通过用一 种质粒转化过的菌株生产L-赖氨酸的方法，所述质粒含有源于埃希氏菌属细菌的编码二 氢吡啶二羧酸合成酶的DNA，它具有使L-赖氨酸的反馈抑制作用脱敏的突变；编码其L-赖 氨酸的反馈抑制已经脱敏的天冬氨酸激酶的DNA ；编码二氢吡啶二羧酸还原酶的DNA ；以及 编码源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶的DNA。对于短杆菌属细菌来说，据国际公开NO. W095/11985披露，通过增强细胞内烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的活性，可以提高L-赖氨酸产量。另外，在日本专利申请公开 NO. 60-87788和日本专利公开(Kokoku)NO. 6-102028中分别披露了用仅仅增强了其磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶活性的菌株生产L-赖氨酸的方法，和用仅仅增强了天冬氨酸-半醛脱氢酶 活性的菌株生产L-赖氨酸的方法。在通过发酵进行的氨基酸工业生产中，生产是以大规模形式进行的。因此，即使是 若干个百分点的产量提高，都可以产生显著的工业价值，并且，因此需要产量提高，而无论 产量的提高如何。
发明内容
本发明的一个目的是，提供一种与常规方法相比改善了的通过发酵生产L-赖氨 酸的方法。为了实现上述目的，本发明人进行了不懈地研究。结果，本发明人发现，如果具有 特定特性的埃希氏菌属细菌的天冬氨酸_半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性增强，并且，如果在上述埃希氏菌属细菌中，除了上述酶之外特定的一种或多种酶的活性增强 的话，所述细菌的L-赖氨酸生产力可以提高，并且，他们根据这些发现完成了本发明。就是说，本发明提供了 第一方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1) 二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶 和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2) 二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或 四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，天冬氨 酸_半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性增强；第二方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1) 二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶 和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2) 二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或 四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶的细胞内活性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶或天冬氨酸_半醛脱氢酶 的细胞内活性增强；第三方面，一种埃希氏菌属细菌，其中(1) 二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶 和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2) 二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性或 四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，其中，磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的细胞内活性和天冬氨酸_半醛脱氢酶 或天冬氨酸酶的细胞内活性增强(在下文中，上述三个方面的细菌被统称为“本发明的细 菌”)。在本发明的细菌中，优选天冬氨酸_半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性增强。另外，在本发明的细菌中，天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧 酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和天冬氨酸_半醛脱氢 酶优选均源于埃希氏菌属细菌，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶和天冬氨酸酶(如果有的 话)优选分别源于埃希氏菌属细菌，二氢吡啶二羧酸合成酶优选源于埃希氏菌属细菌或短 杆菌属细菌，而二氨基庚二酸脱氢酶优选源于短杆菌属细菌。在本发明的细菌中，优选的是它的细胞内活性是增强的，是通过下面的各项中的 一项或其任意组合而增强的。(1)导入具有所述酶的基因的质粒。(2)增加染色体上所述酶的基因拷贝数量。(3)改变染色体上所述酶的基因的启动子序列。另外，在本发明的细菌中，优选通过获得其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的 二氢庚二酸合成酶以及其L-赖氨酸的反馈抑制作用被脱敏化的天冬氨酸激酶，来增强二 氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的细胞内活性，并且，通过导入二氨基庚二酸脱氢酶 基因，来增强二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性。本发明还提供了生产L-赖氨酸的方法，该方法包括在合适的培养基中培养本发 明的任何细菌，以便在培养基中产生并且积累L-赖氨酸，以及从培养物中收集赖氨酸(以 下又称之为“本发明的生产方法”)。
图1表示源于RSF1010的质粒RSF24P的制备过程，它含有dapA*24。
图2表示含有dapA*24和lysC*80的质粒RSFD80的制备过程。
图3表示含有dapA*24，lysC*80和dapB的质粒pCABl的制备过程。
图4表示含有dapA*24，lysC*80, dapB和ddh的质粒pCABD2的制备过程。
图5表示含有dapA*24，lysC*80, dapB, dapD和dapE的质粒pCABDEl的制备过程。
图6表示含有ppc的质粒pppc的结构。
图7表示含有asd的质粒pasd的结构。
图8表示含有pntAB (pntA和pntB)的质粒p丽THY的制备过程。
图9表示含有aspA的质粒pMW118: :aspA的制备过程。
图10表示含有ppc和asd的质粒ppcd的制备过程。
图11表示含有ppc和pntAB的质粒pPTS的制备过程。
图12表示含有ppc和aspA的质粒pAPW的制备过程。
图13表示含有ppc，pntAB和asd的质粒pPTd的制备过程。
图14表示含有ppc，pntAB和aspA的质粒pAPT的制备过程。
图15表示含有ppc，pntAB和aspA的质粒pAPTK的制备过程。
图16表示含有asd的质粒pSd的制备过程。
图17表示含有ppc，pntAB, aspA和asd的质粒pKD的制备过程。
图18表示含有tetpM的质粒pUTES的制备过程。
图19表示含有tetpM和位于tetpM下游的、源于乳发酵短杆菌的dapA的质粒PUEBL3的制备过程。
图20表示含有源于乳发酵短杆菌的dapA(BreV. dapA)、lysC、dapB和ddh的质粒pCABD(B)的制备过程。
具体实施例方式<1>本发明的细菌本发明的细菌是埃希氏菌属细菌，其中(1) 二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激 酶和二氢吡啶二羧酸还原酶的细胞内活性增强，和(2) 二氨基庚二酸脱氢酶的细胞内活性 或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的细胞内活性增强，并且，以下 酶的细胞内活性进一步增强(1)天冬氨酸_半醛脱氢酶或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，(2)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶(以下又称之为“转 氢酶”)或天冬氨酸-半醛脱氢酶，或(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和转氢酶，和天冬氨酸_半醛脱氢酶或天冬氨酸酶。本发明的细菌优选是埃希氏菌属细菌，其中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，转氢酶，天 冬氨酸_半醛脱氢酶和天冬氨酸酶的细胞内活性进一步增强。本发明的细菌优选属于大肠杆菌。在本说明书中，短语“细胞内活性增强”表示与野生型菌株(例如，大肠杆菌W3110 菌株)或亲本菌株(该菌株中本发明所特指的组合中所包括的所有酶的细胞内活性都没有 增强)相比，细胞内酶活性增强，还表示一种细菌具有一种野生型菌株或亲本菌株所没有 的酶活性。用于测定上述酶活性的方法是公知的，并且，本领域技术人员可以方便地证实其
7细胞内活性的增强。增强所述细胞内活性的方法包括以下方法及其组合，但并不局限于这些。首先，要提到提高所述酶的表达量的方法。具体地讲，提高酶表达量的方法包括以下方法。(1)导入含有酶基因的质粒作为质粒，可以使用能在埃希氏菌属细菌细胞中自主复制的载体。可以用公知方 法将其导入。就是说，可以将感兴趣的基因插入所述载体，并且可以用该载体转化埃希氏菌 属细菌。该载体优选是多拷贝型质粒。所述基因可以由相同质粒或不同质粒携带。某些基因可以由相同质粒携带。当使 用两种或两种以上质粒时，优选使用具有稳定的分配系统的质粒，该系统使得这些质粒能 在细胞中稳定的共存。导入所述基因的顺序没有特别限制。(2)增加染色体上酶基因的拷贝数量通过用Mu噬菌体等扩增染色体DNA上的DNA，增加所述拷贝数量。染色体DNA上的DNA可以是埃希氏菌属细菌原来就有的，或是通过使用转导、转 座子(Berg, D.E.和Berg C. M.，生物技术，1，417 (1983))，Mu噬菌体(日本专利申请公开 NO. 2-109985)，或同源重组的方法(分子遗传学实验，冷泉港实验室(1972))插入宿主微生 物染色体中的。(3)改变酶基因的启动子序列可以改变启动子序列，以便提高基因的转录量，并进而提高表达量。例如，可以通 过将突变导入启动子来增强该启动子，以便提高位于该启动子下游的基因的转录量。除了 将突变导入所述启动子以外，可以新导入能在埃希氏菌属细菌中起作用的启动子，如lac， trp，taC，trC，和PL。另外，可以通过新导入增强子提高基因转录量。尽管所述启动子序列 可以是染色体上酶基因的启动子或质粒上酶基因的启动子，但是优选染色体上酶基因的启 动子。例如，日本专利申请公开NO. 1-215280披露了将诸如启动子的基因导入染色体DNA。上述酶基因的来源没有特别限制，因此，各种来源的都可以使用，只要该基因能够 在埃希氏菌属细菌中表达，并且其基因产物能在埃希氏菌属细菌中起作用就行。下面将说明获得大肠杆菌的L-赖氨酸生物合成系统基因和转氢酶基因，和乳发 酵短杆菌的二氢吡啶二羧酸合成酶和二氨基庚二酸脱氢酶基因的方法。可以从含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)的质粒pS2(Sabe，H.等，基因，31， 279(1984))或pT2获得该基因。可以通过用Aatll和Aflll消化pS2，获得含有ppc的DNA 片段。另外，还可以通过用Smal和Seal消化pT2，获得含有ppc的DNA片段。具有pT2的 大肠杆菌F15菌株(AJ12873)于1993年7月15日保藏在通商产业省工业技术院生命工学 工业技术研究所(邮政编码 305-8566，l-3Higashi 1-chome, Tsukuba-shi，Ibaraki-ken， 日本)，并且获得的保藏号为FERM P-13752。然后，按照布达佩斯条约的规定于1994年7 月11日转为国际保藏，所获得的保藏号为FERM BP-4732。通过PCR扩增可以获得天冬氨酸激酶基因(lysC)，所述扩增使用大肠杆菌染色体 DNA做模板，并使用根据lysC的已知核苷酸序列制备的两种类型的寡核苷酸引物(Cassan， M.，Parsot, C.，Cohen, G. N.，和 Patte, J. C.，生物学化学杂志 261，1052 (1986))(例如，在 国际
发明者中西一夫, 児岛宏之, 小岛淳一郎, 菊池庆实, 西村康史, 铃木智子 申请人:味之素株式会社