专利名称：融合蛋白及其制备方法、编码该蛋白的dna序列、表达载体、宿主细胞、含有该蛋白的药物 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体而言，本发明涉及一种含有促胰岛素分泌素的融合蛋 白及其制备方法、编码该融合蛋白的DNA序列、含有该DNA序列的表达载体、含有该表达载 体的宿主细胞、和含有该融合蛋白的药物组合物。
背景技术：
糖尿病是一种常见的代谢内分泌病，其基本病理为胰岛素绝对或相对分泌不足和 胰升糖素活性增高所引起的代谢紊乱。糖尿病主要分为胰岛素依赖型(I型)糖尿病、非 胰岛素依赖型(II型)糖尿病、与营养不良有关的糖尿病和继发性糖尿病四种，其中II型 糖尿病占90%以上。II型糖尿病的发病机理为基因缺陷基础上存在胰岛素抵抗为主并伴 有胰岛素分泌缺陷或胰岛素分泌缺陷为主并伴有胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生增加，病理 上表现为胰岛素分泌相对不足。目前主要的非胰岛素治疗产品是在饮食和运动治疗不足以控制血糖的基础上 应用的降糖产品。II型糖尿病的治疗以口服降糖药为主，包括磺脲素药物、双胍类药物、 α -葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮衍生物类、胰岛素及其他一些药物。在实际的临床应用 中，单一的治疗很难达到长期满意地控制血糖，一般情况下多为多种药物联合应用。但是随着病程的延长，口服降糖药失效的问题越来越引起临床医生的重视。每年 有5% 10%最初对口服降糖药物治疗有效者回变为继发失效，尤以磺脲类药物多见，其 发生频率一般随病程延长而增多，因而在老年糖尿病患者中多见。对于这种病人，可以采用 胰岛素补充治疗，或停用口服药而完全改用胰岛素治疗。促胰岛素分泌素(EXendin-4，EX-4)是从大毒蜥口腔分泌物中分离出来的一种39 个氨基酸的多肽(Eng 等，J. Biol. Chem.，265 :20259-62,1990 ；Eng 等，J. Biol. Chem.，267 7402-05，1992)，其氨基酸序列与类胰高血糖素肽(glucagon-like peptide, GLP-1)有 53%的同源性，并在多种动物模型中表现出了与GLP-I类似的抗糖尿病药的作用(Goke等， J. Biol. Chem.，268 19650-55，1993)。这些作用包括刺激机体生成胰岛素以降低血糖，抑 制进食后胰高血糖素的释放，减缓营养物质吸收入血流的速率。临床试验显示Exendin-4 表现出良好的抗糖尿病和降血糖的作用，因此目前被认为是肠促胰岛素类似物的第一类治 疗新药。与现有的降糖药相比，Exendin-4最大的优势在于其独特的作用机制，它可以在高 血糖时刺激胰岛素的分泌，而低血糖时不刺激胰岛素的分泌，这样就有效防止了低血糖的 发生，大大提高了用药的安全性，减少了胰岛素的用量，有效改善了患者的生活质量及用药 危险性。肽类药物由于受体内蛋白酶降解和肾脏快速清除作用，体内半衰期较短，用药周 期短。Exendin-4在临床上需要每天注射两针，给病患带来极大的不便和痛苦。因此，开发 长效的制剂就具有十分重要的意义。
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IgG类免疫球蛋白是人体血液中最丰富的蛋白，其半衰期可达21天。已有报道 显示将IgG的Fc片段与其他蛋白融合，可显著增加其他蛋白在体内的生物活性和半衰期 (Capon等，Nature，337 :525-531,1989 ；Chamow等，Trends Biotechnol.，14 :52_60，1996)。 这种方法已经应用于一些临床上很重要的细胞因子和可溶性受体，如sTNF-aR、LFA3、 CTLA-4、IL-2、IFN-a 等，并获得了成功。人IgG各亚类(G1、G2、G3、G4)具有不同的生物活性(称作效应子功能)。这些效 应子功能通常由与Fcy受体(FCYR)的相互作用或通过结合补体1 (Clq)亚成分来介导， 其中所述的补体1亚成分识别并结合免疫球蛋白G或免疫球蛋白M的重链，启动经典补体 途径。与Fc γ R的结合可以导致抗体依赖细胞介导的细胞裂解，即抗体依赖细胞的细胞毒 作用(Antibody-d印endent cellularcytotoxicity, ADCC)；而与补体因子的结合可以导 致补体介导的细胞裂解，即补体依赖的细胞毒作用(Complement-dependentcytotoxicity ，⑶C)。不同IgG亚类的上述活性是不一样的，IgGU IgG3、IgG4与Fc γ R受体结合活性较 强，其中IgGl最强，而IgG2几乎没有结合；IgGl、IgG3能有效结合Clq，并激活补体级联反 应，IgG2对补体的固定作用很弱，而IgG4似乎在激活补体级联反应的能力方面相当有缺陷 (Jefferis et al，Immunol. Rev.，163 :59-76,1998)。在仅利用Fc部分延长半衰期的能力的异源融合蛋白质的设计中，将Fc的效应子 功能最小化是重要的，此时，IgG2 Fc是优选的。同时，为了进一步降低融合蛋白中Fc的功 能效应，可对Fc 的功能区域进行突变(Jefferis et al, Immunol. Rev.，163 =59-76,1998)。然而，目前并未见到有关IgG类免疫球蛋白用于Exendin-4以改善其体内半衰期 的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性得以保持、并且体内半衰期得到改善的融合蛋 白。本发明的目的还在于提供编码该融合蛋白的DNA序列。本发明的目的还在于提供含有该DNA序列的表达载体。本发明的目的还在于提供含有该表达载体的宿主细胞。本发明的目的还在于提供含有该融合蛋白的药物组合物。为了实现本发明的目的，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含1)促胰岛素分泌素；2)连接肽；以及3)人 IgG2 Fc 突变体(mFc)；其中所述融合蛋白从N端到C端依次为促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变体。优选地，所述促胰岛素分泌素为重组促胰岛素分泌素，由其形成含有重组促胰岛 素分泌素的融合蛋白(简称rEx-4-mFc)。优选地，所述连接肽具有如SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。所述人IgG2Fc突变体为人IgG2Fc的突变体，其包含322位的点突变-MG — GCG, 相应的氨基酸突变为Lys —Ala。此处Fc中氨基酸序列标记322是按EU编号方式(Kabat， Ε. Α.等人，1991,《Sequences of proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH 出版 91-3242)编排的。优 选地，所述人IgG2 Fc突变体具有如SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列。优选地，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本发明还提供一种分离的用于编码所述融合蛋白的DNA序列，该DNA序列包含自 5’到3’端的用于依次编码促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变体的DNA。优选地所 述DNA序列具有如SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。本发明还提供一种用于在CHO细胞中分泌表达SEQ ID NO :1所述的融合蛋白的氨 基酸序列(即在SEQ ID NO 1序列前插入人11-2信号肽序列)，其具有如SEQ ID NO 3所 示的序列。本发明还提供一种用于编码SEQ ID NO 3所示的蛋白的DNA序列，该DNA序列为 如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。本发明还提供一种含有所述DNA序列的表达载体；优选地所述表达载体为真核表 达载体；更优选地所述真核表达载体为将所述DNA序列插入pAAV2-ne0的Kpn I/EcoR I位 点而形成的。本发明还提供一种含有所述表达载体的宿主细胞，优选地所述宿主细胞为CHO-Kl 细胞。本发明还提供一种治疗糖尿病的药物组合物，其包含所述融合蛋白；以及药学 上可接受的载体。优选地，所述糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、与营养不良有关的糖 尿病和继发性糖尿病。本领域技术人员可以理解，本发明所述的药物组合物适用于多种给药方式，例如 口服给药、经皮给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药 方式，可将本发明所述的药物组合物制成各种合适的剂型，其中包含有效量的本发明所述 的融合蛋白和药学上可接受的载体。合适剂型的实例为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服剂、用于皮肤表面的贴剂、气雾齐U、
鼻喷剂、以及注射剂等。含有本发明所述的融合蛋白的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉末以用于胃 肠外给药。冻干粉末在使用前可加入适当溶剂或其他药学上可接受的载体将粉末重新配 制。溶剂一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。剂型中还可含有其他常规组分，如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲液、渗透压调 节剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂等。本发明所述的药物组合物中使用的稳定剂优选 柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇、神经节糖苷等。一种示例性的药物组合物注射液的配方包括 rEx-4-mFc 0. 01-5mg ；NaCl 8mg ；柠檬酸钠!Bmg或磷酸盐2. 15mg ；神经节糖苷25_50mg或甘 氨酸15-30mg或甘露醇15-20mg ；注射用水1ml。若有特殊治疗要求，本发明所述的药物组合物还可包含其他活性药理成分，这种 联合使用有利于治疗。本发明所述的药物组合物中的融合蛋白的量可以在一个较大范围内变动，本领域 技术人员可以根据一些已知的因素(诸如根据疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂 型、给药途径等)很容易地加以确定。本发明还提供了所述融合蛋白的制备方法，该方法包括
提供用包含编码所述融合蛋白的DNA序列的表达载体转化的宿主细胞，培养转化 后的宿主细胞，对培养物进行离心，然后将离心后的上清液依次用亲和层析法、离子交换层 析法和分子筛层析法进行纯化，从而获得所述融合蛋白。优选地，所述亲和层析法优选使用rProtein A Sepharose FF亲和层析柱，所述离 子交换层析法优选使用Q Sepharose FF层析柱，所述分子筛层析法优选使用Superdex 200 柱。本发明人选择裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段，同时为了减低其补体依赖性 细胞毒性(CDC)，将第322位氨基酸Lys突变为Ala (Duncan等，Nature, 332 738-740， 1988)。经过突变后的人IgG2Fc片段(mFc)通过一段连接肽接至Exendin-4的C-末端，构 建Ex-4-mFc融合蛋白。融合蛋白通过人IgG Fc铰链区中的半胱氨酸残基连接，形成同源二 聚体。该同源二聚体类似于人IgG分子但无CHl区域和轻链，其在体内表现出来的药代动 力学性质与相似种型的人源化单克隆抗体相似。因此，本发明所述的融合蛋白在体内的半 衰期大大高于Exendin-4肽。本发明实现了融合蛋白在哺乳动物细胞CHO中的高效表达， 且纯化工艺简单，利于进一步的大规模制备。总之，本发明具有下列优点1、本发明所述的融合蛋白在动物的药代实验中显示出显著延长的半衰期。2、本发明选择突变的IgG2的Fc片段作为融合片段，从而避免副作用的产生。3、本发明所述的方法表达量高，稳定性好，易于放大生产，成本低廉。4、本发明所述的工程细胞连续传代100代后，仍能稳定地分泌表达rEx-4-mFc融 合蛋白。通过滚瓶培养方式进行培养，用ELISA方法检测培养上清中的表达量，统计30余 次的数据，表达量均在60 100mg/L/7d之间。每次细胞培养的规模都在30 40L左右。 滚瓶培养方式的一个特点，就是便于在一定规模下放大生产，通常可方便地放大到350 400L。5、对于纯化而言，由于本发明所述的融合蛋白在细胞培养上清中含量高，而纯化 工艺中的rProtein A Sepharose FF亲和层析步骤具有很高的纯化效率，每毫升凝胶可结 合50mg左右的融合蛋白，因此更易于放大生产。6、本发明所述的融合蛋白的临床使用剂量很小，为微克级。因此，其成本更为低 廉
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图1是重组质粒pEx-4-mFc的构建流程图。图2示出人IgG2 Fc的RT-PCR产物的电泳图(1 %的琼脂糖凝胶电泳)，其中泳道 M 为分子量标准(IOObp DNA ladder (Invitrogen))，泳道 1 为 IgG2 Fc 的 RT-PCR 产物。
图3示出真核表达载体pAAV2_neo。图4示出重组质粒pCR2. l-Ex-4-Fc的酶解产物的电泳图(1 %的琼脂糖凝胶电 泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(11Λ DNAladder (Invitrogen))，泳道1和3分别代表 阳性克隆的Kpn I/EcoR I双酶解产物，泳道2和4分别代表阳性克隆的BamH I/EcoR I双 酶解产物。图5示出重组质粒pEx-4-mFc的酶解产物的电泳图(1 %的琼脂糖凝胶电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(11Λ DNAladder (Invitrogen))，泳道1和2分别代表阳性克隆 的Kpn I/EcoR I双酶解产物。图6示出细胞基因组DNA的Εχ-4-mFc片段的PCR产物的电泳图(1 %的琼脂糖凝 胶电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(llibplus DNA ladder (Invitrogen))，泳道Cl代 表CHO-Kl，泳道C2代表空载质粒pAAV2-neo转染CHO-Kl，泳道1_11代表2-E11的11个克 隆，C3代表Ex-4-mFc片段(阳性对照)。图7示出细胞总RNA的Εχ-4-mFc片段RT-PCR产物的电泳图(1 %的琼脂糖凝胶 电泳)，其中泳道M为DNA分子量标准(11Λ ρIusDNA ladder (Invitrogen))，泳道Cl代表 CHO-Kl，泳道C2代表空载质粒pAAV2-neo转染CHO-Kl，泳道1_11代表2-E11的11个克隆， C3代表Ex-4-mFc片段(阳性对照)。图8示出纯化后蛋白的电泳图(1%的琼脂糖凝胶电泳)，其中泳道M为蛋白分子 量标准(BenchMark Protein Ladder (Invitrogen))，泳道 1 代表上样 1 μ g 的情况，泳道 2 代表上样5yg的情况。图9示出纯化后蛋白的高效液相色谱图。图10示出rEx-4-mFc的免疫印迹分析结果，其中泳道M为蛋白分子量标准 (SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard, Invitrogen),泳道 1 为 rEx-4-mFc。图11示出rEx-4和rEx-4_mFc对刺激胰岛瘤细胞cAMP产生的作用。图12示出rEx-4和rEx-4-mFc对刺激胰岛瘤细胞胰岛素产生的作用。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对 本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只 要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。以下分子克隆技术操作方法，如无特别说明，均参照下列文献进行《分子克隆实 验指南》(黄培堂等译，[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002)。DNA操作中所用的DNA 提取试剂盒(UNIQ-10)、DNA胶回收试剂盒(UNIQ-IO)及连接试剂盒等购自上海生工生物工 程技术服务有限公司。限制性内切酶购自i^ermentas Life Science公司，克隆载体pCR2. 1、 总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、克隆用大肠杆菌宿主JM109等均购自hvitrogen公司。 LB培养基配方为蛋白胨，0.5%酵母膏，NaCl ；LB琼脂糖平板配方为蛋白胨， ；^酵母膏，丨^妝口二^琼脂糖。其中蛋白胨和酵母膏购自英国Oxid公司。实施例1连接有连接肽的Exendin-4目的基因及人IgG2 Fc片段基因的制备采用全基因合成的方法得到含信号肽、Exendin-4及G5S连接肽的目的蛋白的基 因(由上海生工公司合成)，其核苷酸序列如SEQ IDNO :7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 8 所示。其中，在核苷酸序列的5’端包含人11-2信号肽序列，并在3’端包含用于与人IgG2 Fc片段连接的G5S连接肽序列。为了便于插入克隆载体pCR2. I(Invitrogen)中，在5’端 设计Kpn I酶切位点，3’端设计BamH I酶切位点。设计如下引物来扩增人IgG2 Fc片段cDNA 5’ 引物5’ CGG GAT CCG AGC GCA AAT GTT GTG TCGAGT GC 3’3，引物5，GGA ATT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAGAGG 3，
为了能将PCR产物插入克隆载体pCR2. 1中，在5’引物中设计入BamH I酶切位点， 在3’引物中设计入EcoR I酶切位点。利用总RNA提取试剂盒(Invitrogen)，按照试剂盒的说明从正常人血液提取人淋 巴细胞总RNA，以人淋巴细胞总RNA为模板，RT-PCR扩增人IgG2Fc片段。将RT-PCR反应混 合物在50°C变性30分钟后，按下列条件进行反应逆转录反应94°C变性30秒；55°C退火30秒；68°C延伸1分钟。反应10个循环。PCR反应94°C变性30秒；60°C退火30秒；68°C延伸1分钟。反应25个循环。然 后68 °C再延伸12分钟。反应完成后，使用的琼脂糖凝胶电泳来检测RT-PCR产物。如图2所示，得到 预计大小(约700bp)的DNA片段。经测序，扩增的人IgG2 Fc cDNA片段的核苷酸序列如 SEQ ID NO :9所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。实施例2重组质粒的构建如上所述，在目标基因的5’端设计Kpn I酶切位点，3’端设计BamH I酶切位点， 从而可将目标基因片段直接插入克隆载体PCR2.1的多克隆位点Kpn I/BamH I中，然后再 将人IgG2 Fc片段插入到多克隆位点BamH I/EcoR I中，即可得到Εχ-4-Fc融合片段。在 该重组克隆中进行人IgG2 Fc片段的点突变，测序鉴定后再用Kpn I/EcoR I插入真核表达 载体pAAV2-neo。表达载体pAAV2_neo是在pcDNA3. 1 (Invitrogen)基础上改造而来，加上 AAV2的末端重复序列，以增加整合片断在基因组内的稳定性(质粒图谱见图幻。重组质粒 的构建过程详见图1。1.重组质粒 pCR2. l-Ex-4-Fc 的构建将实施例1中合成的目的基因片段插入pCR2. 1的Kpn I/BamH I位点，得到 连接产物PCR2. l-Ex-4。之后使用pCR2. l_Ex_4转化大肠杆菌JM109，转化菌体涂布于 LB(含100 μ g/ml氨苄青霉素)平板，37°C培养过夜，挑选阳性克隆进行筛选。然后进 行酶切鉴定。将人IgG2Fc片段插入鉴定正确的重组质粒的BamH I/EcoR I位点，得到 连接产物PCR2. l-Ex-4-Fc。之后，使用pCR2. Ι-Εχ-4-Fc来转化大肠杆菌JM109，转化菌 体涂布于LB (含100 μ g/ml氨苄青霉素)平板，37°C培养过夜，挑选阳性克隆进行筛选。 pCR2. l-Ex-4-Fc的酶切鉴定结果见图4，其中阳性克隆分别用Kpn I/EcoR I及BamH I/EcoR I回切出目的片段。将测序鉴定正确的阳线克隆进行下一步的点突变过程。2. IgG2Fc的点突变-重组质粒pCR2. Ι-Εχ-4-mFc的构建以上述pCR2. l-Ex-4-Fc阳性克隆为基础，设计点突变引物5' CCTTTGTTGGAGACCGCGCACTTGTACTCC 3'，其目的是实现322位的点突变-MG — GCG,相应的氨基酸突变为Lys — Ala0该突 变是采用Mrategene的点突变试剂盒(Strategene)进行。按试剂盒的说明进行操作，将 筛选得到的阳性克隆进行测序鉴定，测序结果表明突变后的序列与SEQ ID N0:4—致。测 序鉴定正确的阳性克隆进行下一步的克隆构建。3.真核表达载体pEx-4-mFc的构建将Ex-4-mFc片段从上述pCR2. Ι-Εχ-4-mFc阳性克隆质粒上切下来，插入到 pAAV2-neo的Kpn I/EcoR I位点，从而得到重组质粒ρΕχ-4-mFc。使用ρΕχ-4-mFc转化大 肠杆菌JM109，转化菌体涂布于LB (含100 μ g/ml氨苄青霉素)平板，37°C培养过夜，挑选阳性克隆进行筛选。重组质粒pEx-4-mFc的酶切鉴定结果见图5，其中，1和2分别表示阳性 克隆用Kpn I/EcoR I回切出目的片段。选阳性克隆进行下一步的CHO稳定表达株的筛选。实施例3 CHO稳定表达株(E4F/CH0细胞)筛选及鉴定取10 μ g实施例2中制备的pEx-4-mFc质粒，利用脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染CHO-Kl细胞(ATCC)。两天后按1 5的比例传代，加入0. 4mg/ml 的G418 (Invitrogen)筛选，10天可见克隆形成。消化120个边缘明显分开、细胞状态良好 的单克隆接种于5个M孔板中，于37°C、5% CO2培养箱中培养(第一轮筛选)，培养基为含 10%胎牛血清的DMEM/F12anvitrogen)。除非另有说明，否则下述培养中的培养温度和培 养基与此相同。取三天后的培养上清用ELISA法检测融合蛋白的表达情况，从中选出表达阳性的 46个克隆分别接种于2个对孔板(第二轮筛选)。培养3天后，取上清用ELISA法检测融 合蛋白的表达情况，从中选取表达较高的5个克隆1-C9、1-F2、2-C5、2-E11、2-F10，进一步 用有限稀释法进行筛选。分别接种96孔板(3细胞/孔/200 μ 1)(第三轮筛选)，待细胞长满(大约13天) 后，取培养上清用ELISA法检测融合蛋白的表达情况，2-Ε11为均一的克隆，分别挑取表达 较高的6个克隆接种M孔板，各平行接2孔。待细胞长满后，其中一孔用于保种，另一孔接 种6孔板。待6孔板内的细胞长满后，抽提基因组DNA和总RNA，用PCR鉴定整合入基因组 的插入片段的存在情况，用RT-PCR鉴定插入片段的转录(即表达)情况，结果如图6和7 所示。结果表明2-Ε11为正确的重组克隆。取2-Ε11接种96孔板(1细胞/孔/200 μ 1)(第四轮筛选)，待细胞长满(大约 15天)后，取培养上清用ELISA法检测融合蛋白的表达情况，均为均一的克隆，将其中表达 最高的分别扩增、保种，进行下一步表达和纯化。pEx-4-mFc转化CHO-Kl细胞后，将稳定表 达的细胞命名为E4F/CH0细胞。实施例4制备重组Ex-4-mFc融合蛋白大规模培养实施例3中所述的E4F/CH0细胞，使用离心机(Avanti J-26XP，BECHMAN 公司，美国)进行离心，从而收集上清液，上清液用IM的NaOH调节ρΗ至7. 3，依次采用以下 方法进行纯化1.蛋白A亲和层析将上述样品上于经缓冲液A(10mM磷酸盐，ρΗ7. 3)平衡的重组蛋白A亲和层析柱 (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare 公司)，用缓冲液 A 洗涤亲和柱至基 线，用缓冲液B(50mM柠檬酸盐，pH3. 5)洗脱，收集洗脱峰溶液并立即用IM Tris调节ρΗ至 8. 0。2.阴离子交换柱层析将步骤1中获得的蛋白溶液用缓冲液C(20mM Tris-HCl, pH8. 0)稀释10倍，上于 经缓冲液C平衡的Q Sepharose Fast Flow层析柱。用缓冲液EK20mM Tris, pH8. 0,300mM NaCl)洗脱，收集洗脱峰的溶液。3.凝胶过滤选用凝胶过滤Superdex 200 prep grade 柱(GE Healthcare 公司)对步骤 2 中 获得样品进行精细纯化并转换样品缓冲系统，平衡液为缓冲液E (IOmM磷酸盐，pH7. 0，150mMNaCl)，并用缓冲液E洗脱，收集洗脱峰溶液，纯度达到98 %以上(图8)，从而制得重组 Ex-4-mFc融合蛋白。实施例5 rEx-4-mFc的理化性能鉴定1. SDS-PAGE 纯度分析采用SDS-PAGE系统(参见郭尧君，《蛋白质电泳实验技术》，科学出版社，1999年) 进行非还原型电泳，用Bio-Rad GS800扫描测定，rEx-4-mFc纯度为98.9% (图8)。2.高效液相色谱纯度分析采用亲水硅胶体积排阻法测定，选用色谱柱为Waters PR0TEINPAK 300sw(7. 5_X 30cm)，排阻极限 400KDa。流动相:0. mN￡i2HP04 与 0. IM KH2PO4 等体积混合， pH7. 0 ；上样量100 μ 1，检测波长^Onm。峰面积归一法分析其纯度为98. (图9)。3. N-末端氨基酸序列分析采用Edman降解法测定按照实施例4纯化得到rEx-4-mFc的N-末端15个氨基酸 序列为His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp LeuSer Lys Gln Met Glu。N-末端氨基 酸序列分析结果与理论序列完全相同，说明制备的rEx-4-mFc的一级结构是正确的。4.免疫印迹反应将兔抗Exendin-4、rEx-4-mFc、AP-羊抗兔 IgG (购自 Sigma 公司)、NBT (购自 USB 公司)、BCIP (购自USB公司)用常规WesternBlot法(郭尧君，《蛋白质电泳实验技术》，科 学出版社，1999)进行免疫印迹分析，结果呈阳性(见图10)。检测结果表明，通过本发明所述的rEx-4-mFc的结构、纯度等项检测指标符合《中 国药典》(第三部，2005年版)的相关要求。实施例6 rEx-4-mFc刺激胰岛瘤细胞cAMP的产生Exendin-4特异性的与肺膜及胰岛瘤细胞的GLP-I受体相互作用；与GLP-I —样， 在分离的大鼠胰岛和小鼠胰岛瘤细胞β-TC-l中，在葡萄糖的刺激下，其呈剂量依赖的诱 导胰岛素的分泌；同样，也刺激大鼠胰岛瘤细胞RIN-5F胞内CAMP升高，该法已作为判定 Exendin-4生物学活性的重要指标(李克坚等，重组促胰岛素分泌素生物学活性测定方法 的研究，《药物分析杂志》，2006，12 1691)。在96孔细胞培养板中接种2 X IO4个细胞/孔， 培养2 3天至细胞汇合率达80 %左右，无血清高糖培养基洗涤细胞1次，加入用含0. 1 % BSA无血清培养基稀释的不同浓度rEx-4-mFc，37°C反应30min，去上清，裂解细胞抽提cAMP 并用酶免法检测。结果表明，在相同分子数的条件下，rEx-4-mFc保持与Exendin-4相似的 刺激大鼠胰岛瘤细胞RIN-5F胞内cAMP升高的作用(图11)。实施例7 rEx-4-mFc刺激胰岛瘤细胞胰岛素的产生在96孔细胞培养板中接种2 X IO4个/孔细胞，培养2 3天至细胞汇合率达80 % 左右，无血清培养基洗涤细胞1次，加入用含0. 1% BSA和0. 4%胎牛血清高糖培养基稀释 的不同浓度rEx-4-mFc，培养2天，取上清并用酶免法检测分泌的胰岛素。结果也表明，在 相同分子数的条件下，rEx-4-mFc保持与Exendin-4相同的促胰岛瘤细胞胰岛素分泌作用 (图⑵。实施例8 rEx-4-mFc的冻干粉针取实施例4制备的rEx-4-mFc，按照下列配方制备冻干粉针。
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权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1)促胰岛素分泌素；2)连接肽；以及3)人IgG2Fc突变体；其中所述融合蛋白从N端到C端依次为促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变体。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述促胰岛素分泌素为重组促胰岛 素分泌素。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽具有如SEQID N0:5所 示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人IgG2Fc突变体为人IgG2Fc 的第322位氨基酸Lys突变为氨基酸Ala而形成的突变体；优选地所述人IgG2 Fc突变体 具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
6.一种分离的用于编码根据权利要求1至5中任意一项所述的融合蛋白的DNA序列， 该DNA序列包含自5’到3’端的用于依次编码促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变 体的DNA，优选地所述DNA序列具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
7.含有权利要求6所述的DNA序列的表达载体，优选地所述表达载体为真核表达载体， 更优选地所述真核表达载体为将权利要求6所述的DNA序列插入pAAV2-ne0的Kpn I/EcoR I位点而形成的。
8.含有权利要求7所述的表达载体的宿主细胞，优选地所述宿主细胞为CHO-Kl细胞。
9.一种治疗糖尿病、优选治疗I型和II型糖尿病、与营养不良有关的糖尿病以及继发 性糖尿病的药物组合物，其包含根据权利要求1至5中任意一项所述的融合蛋白；以及药学上可接受的载体。
10 一种根据权利要求1至5中任意一项所述的融合蛋白的制备方法，该方法包括提供用包含编码所述融合蛋白的DNA序列的表达载体转化的宿主细胞，培养转化后 的宿主细胞，对培养物进行离心，然后将离心后的上清液依次用亲和层析法、离子交换层 析法和分子筛层析法进行纯化，从而获得所述融合蛋白，其中所述亲和层析法优选使用 rProteinA Sepharose FF亲和层析柱，所述离子交换层析法优选使用Qkpharose FF层析 柱，所述分子筛层析法优选使用Superdex 200柱。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白，其包含促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变体；其中所述融合蛋白从N端到C端依次为促胰岛素分泌素、连接肽和人IgG2 Fc突变体。本发明还涉及该融合蛋白的制备方法。该融合蛋白可在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简单，利于进一步的大规模制备。本发明所获得的融合蛋白不仅具有天然促胰岛素分泌素的生物活性，还具有血清半衰期更长的优点，可刺激胰岛素的分泌，抑制进食后胰高血糖素的释放，从而可用于各种类型的糖尿病的治疗。
文档编号C12N15/85GK102070717SQ20091022293
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者何凯, 叶学君, 张仁怀, 杨立明, 汪猜, 闻亚磊, 阳勇, 韩为跃 申请人:东莞太力生物工程有限公司