专利名称：回流工艺生产ε－聚－L－赖氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是一种回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法。
背景技术：
ε-聚-L-赖氨酸是由白色链霉菌分泌的含有25～30个赖氨酸残基的多肽，它水溶性好，易溶于水、微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂；抑菌谱广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑制作用，最低抑菌浓度低于100μg/mL，但对于霉菌和酵母菌的抑制浓度要高一些，最低抑菌浓度低于250μg/mL，且对耐热性芽孢杆菌和一些病菌也有抑制作用，在一定条件下，可使某些噬菌体明显失活；热稳定性高，ε-聚-L-赖氨酸在100℃煮沸30min或120℃灭菌20min情况下也不会降解；ε-聚-L-赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，也是世界范围内各国允许在食品中强化的一种氨基酸，因此其安全性高。2004年1月FDA批准ε-聚-L-赖氨酸可以作为食品添加剂使用，并主要用于肉制品、高盐食品、快餐、色拉、蛋糕和面点类食品等。因此ε-聚L-赖氨酸是一种非常理想的生物防腐剂。
已知有一种发酵生产ε-聚-L-赖氨酸的方法(岩田敏治等人在中国申请的专利，专利名称为大量生产ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，专利号为97182253.0)是在培养基中培养菌株B21021(FERM BP-5926)，然后从培养基中分离和纯化ε-聚-L-赖氨酸。该菌株是通过对小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理而获得的，其对浓度为10mg/mL或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
在现有的ε-聚-L-赖氨酸提取工艺中，后期的穿透液和后期的洗脱液是直接排放出去的，没有任何措施进行处理或者再利用，容易造成环境污染。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种采用回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，该方法可将提取过程的后期穿透液循环使用，流加发酵生产ε-聚-L-赖氨酸，后期的洗脱液用于下一批洗脱。
实现本发明的技术方案是一种回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的生产方法是步骤1采用从土壤中筛选所获得的白色链霉菌(Streptomyces albulus)在培养基进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为pH 6.8左右、温度25～35℃、好气条件下振荡培养或搅拌培养，培养15～30h，80～100h结束发酵；步骤2将结束发酵后的发酵液离心、过滤除去菌体及部分固形物，上清液经脱色及采用阴离子交换树脂去除游离强酸根后，经阳离子交换树脂进行吸附后，用盐酸洗脱，收集前期洗脱液脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸；后期洗脱液留存待用。
步骤3在发酵罐内采用白色链霉菌(Streptomyces albulus)进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为pH 6.8左右、温度25～35℃、转速220r/min左右，好气条件下振荡培养或搅拌培养15～30h，流加提取过程的后期穿透液，继续培养40～60h，结束发酵后离心除去菌体及部分固形物，上清液采用阳离子交换树脂交换后进行吸附并洗脱，收集前期洗脱液经脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸；后期洗脱液留存待用。
步骤4循环步骤3。
而且，所述的实验室保藏菌种白色链霉菌(Streptomyces albulus)是对S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性。
而且，所述的阳离子交换树脂为D152型弱酸性阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为已处理为氯型或氢氧根的D392型弱碱性的阴离子交换树脂。
本发明的优点和积极效果是本发明改变了现有生产工艺步骤，将提取的后期洗脱液液流加发酵生产ε-聚-L-赖氨酸，不仅提高了ε-聚-L-赖氨酸的产率，节约了成本而且减少了环境污染；由于采用阴离子交换树脂对发酵液进行脱色，脱色效果明显，损失减少。
具体实施例方式
以下对本发明的实施例做进一步详述，但不局限于本实施例需要说明的是实施例1及实施例2基本上叙述的是现有的生产工艺；实施例3及实施例5基本上叙述的是现有的循环生产工艺；实施例4及实施例6为分别与实施例3与实施例5相对比的创新工艺。
实施例15L发酵罐，装入2.7L培养基，接种300mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好气培养96h，空气流速为3L/min～7.5L/min。当pH降至5.8左右时，流加氨水(25～28％)维持pH为5.8至发酵液中的残糖浓度降至10g/L时通过流加使残糖浓度维持在10g/L左右，同时不再控制pH让其自然降至4并控制在4。流加物葡萄糖800g/L，(NH4)2SO480g/L。
培养96h，结束发酵，离心除去菌体及部分固形物，上清液用D152型弱酸性阳离子交换树脂进行洗脱，收集前期洗脱液，经过滤，真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸。后期洗脱液留待以后洗脱用。
实施例230L发酵罐，装入13.5L培养基，接种1500mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，待DO降至30％时自动控制为30％，好气培养96h，空气流速为15L/min～30L/min。当pH降至5.8左右时，流加氨水(25～28％)维持pH为5.8至发酵液中的残糖浓度降至10g/L时通过流加使残糖浓度维持在10g/L左右，同时不再控制pH让其自然降至4并控制在4。流加物葡萄糖800g/L，(NH4)2SO480g/L。
培养96h，结束发酵，离心除去菌体及部分固形物，上清液用D152型弱酸性阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集前期洗脱液脱色，过滤，经真空浓缩，旋风干燥器干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸。后期洗脱液留待下次洗脱用。
实施例3500mL三角瓶(本实施例中的发酵罐是以三角瓶为例进行叙述，以下同)，装90mL培养基，向培养基中接入10mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，转速220r/min，好气培养48h。
培养48h后ε-聚-L-赖氨酸的产量如表1所示。
实施例4500mL三角瓶，装90mL培养基，向培养基中接入10mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，转速220r/min，好气培养24h时，流加10mL提取过程的后期穿透液，继续培养至48h。
培养48h后ε-聚-L-赖氨酸的产量如表1所示。
表1
实施例5500mL三角瓶，装90mL培养基，向培养基中接入10mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，转速220r/min，好气培养60h。
培养60h后ε-聚-L-赖氨酸的产量如表2所示。
实施例6500mL三角瓶，装90mL培养基，向培养基中接入10mL白色链霉菌的种子培养液，30℃培养，转速220r/min，好气培养24h时，流加10mL提取的后期穿透液，继续培养至60h。
培养60h后ε-聚-L-赖氨酸的产量如表2所示。
表2
权利要求
1.一种回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于生产方法是步骤1采用从土壤中筛选所获得白色链霉菌(Streptomyces albulus)在培养基进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为pH6.8左右、温度25～35℃、好气条件下振荡培养或搅拌培养，培养15～30h，80～100h结束发酵；步骤2将结束发酵后的发酵液离心除去菌体及部分固形物，上清液采用阳离子交换树脂进行交换吸附后洗脱，收集的前期洗脱液，经阴离子交换树脂脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸；后期洗脱液留待下次备用；步骤3在发酵罐内采用白色链霉菌(Streptomyces albulus)进行ε-聚-L-赖氨酸发酵生产，培养条件为pH6.8左右、温度25～35℃、转速220r/min左右，好气条件下振荡培养或搅拌培养15～30h，流加提取过程中产生的后期穿透液，继续培养40～60h，结束发酵后离心除去菌体及部分固形物，上清液采用阳离子交换树脂进行洗脱，前期洗脱液经阴离子交换树脂脱色后，再经过滤、真空浓缩、干燥，得到ε-聚-L-赖氨酸；收集后期洗脱液留存待用；步骤4循环步骤3。
2.根据权利要求1所述的回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于所述的实验室从土壤中筛选获得菌种白色链霉菌(Streptomyces albulus)是对S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性。
3.根据权利要求1所述的回流工艺生产ε-聚-L-赖氨酸的方法，其特征在于所述的阳离子交换树脂为D152型弱酸性阳离子交换树脂；所述的阴离子交换树脂为已处理为氯型和氢氧根型的D392型弱碱性的阴离子交换树脂。
全文摘要
本发明涉及一种回流工艺生产ε－聚－L－赖氨酸的方法，是采用从土壤中筛选所获得的白色链霉菌(Streptomyces albulus)[对S－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(以下简称AEC)、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]进行ε－聚－L－赖氨酸的发酵生产，将提取过程的后期穿透液循环使用，进行流加发酵生产ε－聚－L－赖氨酸；洗脱过程的后期洗脱液循环使用，用于下一批洗脱；用阴离子交换树脂对发酵液进行脱色。本发明改变了已有生产工艺步骤。不仅提高了ε－聚－L－赖氨酸的产率，节约了成本而且减少了发酵废液和洗脱用盐酸废液的排放，减轻环境污染；由于采用阴离子交换树脂对发酵液进行脱色，脱色效果明显，损失减少。
文档编号C12R1/47GK101078021SQ200610013800
公开日2007年11月28日 申请日期2006年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者贾士儒, 曹伟峰, 张恺瑞, 谭之磊, 孙艳芳, 李婷 申请人:天津科技大学