专利名称：产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法
技术领域：
本发明涉及一种产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法，属于工业微生物技术。
背景技术：
核黄素(riboflaVin)是一种水溶性B族维生素，亦称维生素B2，植物和许多微生物细胞都能合成这种维生素。由于人体细胞和其它动物细胞自身不能合成核黄素，而核黄素又在细胞的新陈代谢中发挥不可缺少的作用，因此核黄素是人体和动物所必需的维生素。在生物体内核黄素以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，它作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。核黄素缺乏会妨碍细胞的氧化作用，使物质代谢发生障碍。核黄素作为常用临床药物，用于辅助治疗口角炎、角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病；核黄素在食品工业中可作为食用色素和营养添加剂使用，以满足人体每天0.3～1.8mg核黄素的需要；核黄素在饲料工业中用做饲料添加剂，动物饲料中必须含有1～4mg/kg的核黄素才能满足其生长需要。
核黄素可以通过以葡萄糖为起始原料的全化学法合成，以D-核糖作为主要原料的化学半合成法，以及微生物发酵法生产，其中微生物发酵法生产核黄素至今已有约60年的历史。发酵法具有生产工艺简单、原料廉价并可再生、对环境污染小等优点。真菌和细菌均可用于生产核黄素，主要生产菌种有棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、解朊假丝酵母(Candida famata)、阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、酿酒酵母(Saccharomyces sp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等。Stepanov等(法国专利2546907)用基因工程方法构建了产核黄素工程菌B.subtilis 304/pMX45，采用流加工艺发酵48小时产核黄素可达4.5g/L。Perkins等(美国专利5925538)构建的工程菌B.subtilis RB50∷[pRF69]60在限制流加葡萄糖的条件下发酵48小时后可产核黄素13-14g/L，56小时后达15g/L。但仍然需要对发酵培养基进行优化、用廉价的原料发酵来降低成产成本，并简化工艺控制过程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法，所述的产核黄素的工程菌株产核黄素量高，其生产核黄素的方法过程简单。
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种产核黄素的工程菌株，该菌名称为Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保臧编号CGMCC1579，保藏时间2005年12月26日。其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L8-氮鸟嘌呤、100mg/L6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。
以上述的产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，其特征在于包括以下过程将在细菌完全培养基(LB)平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于含5μg/mL卡那霉素的种子培养基中，在37℃、240转/分钟振荡通气培养8～14小时，将培养好的种子液按3～7％(V/V)的接种量，接种于含2.0～2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，在通气速率0.6～1.5vvm，搅拌转速600～1200r/min，培养温度36～43℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和2mol/L NaOH或15％(V/V)氨水将pH值控制在6.2～7.4。发酵过程中的溶氧维持在10％以上，调节罐压0.02～0.05MPa。当培养液中的残糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加培养基，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在2～10g/L，发酵进行40～60小时后结束，核黄素的终浓度为10～12g/L。
所述使用的细菌完全培养基(LB)的组分及其含量为10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/L NaCl，pH 7.0；所述使用的种子培养基的组分及其含量为20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，5g/L玉米浆，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4，0.5g/LK2HPO4，0.005g/L卡那霉素，pH 7.2；所述使用的初始发酵培养基的组分及其含量为15～20g/L的碳源，2～10g/L的有机氮源，5～10g/L的无机氮源，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，0.5～1.0g/L KH2PO4，0.5～1.0g/L K2HPO4，10～30mg/L FeCl2，10～40mg/L MnSO4；所述使用的流加培养基的组分及其含量为500～650g/L的碳源，2～15g/L的有机氮源，5～20g/L的无机氮源，0.5～2.0g/L MgSO4·7H2O，1～8g/L KH2PO4，1～5g/L K2HPO4。
上述的碳源是葡萄糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、蔗糖、果糖、麦芽糖、糊精、淀粉或甘油；有机氮源是脲、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、酵母抽提物、玉米浆、酸水解酪素、豆粉、豆饼水解液、牛肉膏或鱼粉；无机氮源是氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾或硝酸钠。
本发明的优点在于该培养方法可以用工业葡萄糖替代季节性较强的、运输和储存不便的糖蜜为碳源进行核黄素生产，该培养方法可用廉价的无机氮源来减少较为昂贵的酵母抽提物等有机氮源的用量，可以进一步降低生产成本。本发明中的发酵工艺简单，便于生产过程中的控制。
具体实施例方式
以下将通过具体的实例来描述本发明，提供下列实例仅为更好地解释本发明，因此本发明不被下列实例所限制。
实施例1将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液按5％(V/V)的接种量，接种于含2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L葡萄糖，2g/L酵母抽提物，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4，0.5g/LK H2PO4，1g/L K2HPO4，20mg/L FeCl2，30mg/L MnSO4，通气速率1.0vvm，，搅拌转速800r/min，41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发酵过程中的溶氧维持在15％以上，罐压为0.02MPa。当培养液中的残糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为650g/L葡萄糖，2g/L酵母抽提物，15g/L NaNO3，0.5g/L MgSO4，5g/L K2HPO4，5g/L KH2PO4，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在5g/L以下，发酵进行48小时后结束。整个发酵过程大约补充2.0L流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达12g/L以上。
实施例2将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养8小时，将培养好的种子液按7％(V/V)的接种量，接种于含2.2L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L葡萄糖，10g/L酵母抽提物，5g/L NaNO3，0.8g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，20mg/L FeCl2，20mg/L MnSO4，通气速率1.2vvm，搅拌转速1000r/min，41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.5。发酵过程中的溶氧维持在10％以上，罐压为0.02MPa。当培养液中的残糖低于1％时开始向发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为600g/L葡萄糖，15g/L酵母抽提物，5g/L NaNO3，1g/L MgSO4，5g/L KH2PO4，5g/L K2HPO4，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在10g/L以下，发酵进行40小时后结束。整个发酵过程大约补充2.2L流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达11g/L。
实施例3将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液按5％的接种量，接种于含2.0L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L蔗糖，10g/L酵母粉，5g/L NaNO3，0.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L KH2PO4，20mg/LFeCl2，20mg/L MnSO4，通气速率1.0vvm，，搅拌转速1000r/min，41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发酵过程中的溶氧维持在10％以上，罐压为0.03MPa。当培养液中的葡萄糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为500g/L蔗糖，25g/L酵母粉，5g/L NaNO3，3g/L MgSO4，2g/L KH2PO4，3g/L KH2PO4，控制流加速度使发酵罐中葡萄糖浓度维持在10g/L以下，发酵进行56小时后结束。整个发酵过程大约补充2.3L流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达10g/L。
实施例4将在LB培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于装有150mL种子培养基的1000mL三角瓶中，在摇床上37℃、240转/分钟振荡通气培养12小时，将培养好的种子液按7％的接种量，接种于含2.0L初始发酵培养基的5L发酵罐中，初始发酵培养基为15g/L糖蜜(按糖含量计)，2g/L酵母抽提物，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4，0.5g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，10mg/L FeCl2，10mg/L MnSO4，，通气速率1.2vvm，搅拌转速1000r/min，41℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和15％氨水将pH值控制在6.8。发酵过程中的溶氧维持在10％以上，罐压为0.04MPa。当培养液中的葡萄糖浓度低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加培养基，流加培养基为450g/L糖蜜(按糖含量计)，2g/L酵母抽提物，15g/L NaNO3，1g/L MgSO4，8g/L K2HPO4，5g/L KH2PO4，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在6g/L以下，发酵进行42小时后结束。整个发酵过程大约补充2.5L流加培养基，发酵液中核黄素的终浓度可达12g/L。
权利要求
1.一种产核黄素的工程菌株，该菌名称为Bacillus subtilis F4-RH33，已保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号CGMCC1579，保藏时间2005年12月26日，其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8-氮鸟嘌呤、100mg/L6-巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。
2.一种以权利要求1所述的产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，其特征在于包括以下过程将在细菌完全培养基平板上37℃培养24小时的F4-RH33接种于含5μg/mL卡那霉素的种子培养基中，在37℃、240转/分钟振荡通气培养8～14小时，将培养好的种子液按体积比3～7％的接种量，接种于含2.0～2.5L初始发酵培养基的5L发酵罐中，在通气速率0.6～1.5vvm，搅拌转速600～1200r/min，培养温度36～43℃的条件下进行培养，发酵过程中用1mol/L H2SO4和2mol/L NaOH，或体积比15％的氨水控制pH值在6.2～7.4之间；调节罐压0.02～0.05MPa，使发酵过程中的溶氧维持在10％以上，当培养液中的残糖低于10g/L时开始向发酵罐中加入流加培养基，控制流加速度使发酵罐中糖浓度维持在2～10g/L，发酵进行40～60小时后结束，核黄素的终浓度为10～12g/L；所述使用的细菌完全培养基的组分及其含量为10g/L蛋白胨，5g/L酵母抽提物，5g/LNaCl，pH 7.0；所述使用的种子培养基的组分及其含量为20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，5g/L玉米浆，10g/L NaNO3，1.5g/L MgSO4·7H2O，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.005g/L卡那霉素，pH 7.2；所述使用的初始发酵培养基的组分及其含量为15～20g/L的碳源，2～10g/L的有机氮源，5～10g/L的无机氮源，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，0.5～1.0g/LKH2PO4，0.5～1.0g/L K2HPO4，10～30mg/L FeCl2，10～40mg/L MnSO4；所述使用的流加培养基的组分及其含量为500～650g/L的碳源，2～15g/L的有机氮源，5～20g/L的无机氮源，0.5～2.0g/L MgSO4·7H2O，1～8g/L KH2PO4，1～5g/L K2HPO4。
3.权利要求2所述的产核黄素的工程菌株生产核黄素的方法，其特征在于；碳源是葡萄糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、蔗糖、果糖、麦芽糖、糊精、淀粉或甘油；有机氮源是脲、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、酵母抽提物、玉米浆、酸水解酪素、豆粉、豆饼水解液、牛肉膏或鱼粉；无机氮源是氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾或硝酸钠。
全文摘要
本发明公开了一种产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法，属于工业微生物技术。所述的产核黄素的工程菌株为Bacillus subtilis F4－RH33，其特征在于，该菌株可抗150mg/L玫瑰黄素、200mg/L 8－氮鸟嘌呤、100mg/L 6－巯基鸟嘌呤、100mg/L德夸菌素和5mg/L卡那霉素。上述工程菌株生产核黄素的过程包括将在细菌完全培养基预培养的F4－RH33接种于种子培养基中，将培养好的种子液接种于含有初始发酵培养基的发酵罐中，在适当的通气速率、搅拌转速、温度、和pH值条件下进行培养，并在培养过程以适当的速度加入流加培养基，发酵进行40～60小时后结束，核黄素的终浓度为10～12g/L。本发明的优点在发酵工艺简单，原料廉价且便于生产过程中的控制。
文档编号C12R1/125GK1891814SQ20061001372
公开日2007年1月10日 申请日期2006年5月17日 优先权日2006年5月17日
发明者赵学明, 陈涛, 陈洵, 武秋立, 李晓静 申请人:天津大学