专利名称：产l－赖氨酸的微生物和用其生产l－赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及产L-赖氨酸的微生物和用其生产L-赖氨酸的方法。更具体地说，本发明涉及对抗生素莫能菌素具有抗性，并且能够以高收率产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJM107(KCCM-10227)，并涉及通过用所述微生物发酵而生产L-赖氨酸的方法。
此前已用属于棒杆菌的各种营养缺陷型菌株，或者抗药性或敏感菌株生产L-赖氨酸。还用抗生素抗性菌株生产L-赖氨酸，例如杆菌肽抗性(日本专利1,765,413)、磺胺药抗性(韩国专利公开81-1746)或伊枯草菌素(iturin)抗性(日本专利2,578,413)菌株，或者是对两种或更多种抗生素，如链霉素和利福平具有抗性的菌株(美国专利4,623,623)。但是，尚没有报导对抗生素莫能菌素具有抗性的菌株。
发明内容
本发明的发明人广泛研究了以工业规模和经济的方式生产L-赖氨酸的通过发酵生产L-赖氨酸的方法。结果，本发明的发明人发现，通过提供产L-赖氨酸的对莫能菌素具有抗性的棒杆菌，可以提高L-赖氨酸的生产率。
莫能菌素是产自放线菌之一，链霉菌的抗生素。已知其影响细菌细胞膜功能和质子原动力(Joumal of Natural Product，49，35-47，1986)。具体地说，担当离子载体的莫能菌素改变细菌细胞膜和质子原动力，从而改变细菌的生理学性质。
为了有效生产L-赖氨酸，在细胞内生物合成的L-赖氨酸，应该由膜蛋白，L-赖氨酸输出器(exporter)较好地分泌至细胞外。已知通过质子原动力跨细胞膜形成的膜电位与由L-赖氨酸的输出器细胞外分泌L-赖氨酸有关(Eur.J.Biochem，220，137-143，1991)。根据莫能菌素的反应机理，本发明的发明人通过提供对莫能菌素具有抗性的棒杆菌而增加L-赖氨酸的生产率。
在本发明中，棒杆菌包括属于棒杆菌属或短杆菌属的任何微生物。在本发明中，可以使用任何菌株作为亲株，只要其能够产生L-赖氨酸且属于棒杆菌。它的一个具体实例是谷氨酸棒杆菌CH77。
本文以下将更详细地解释本发明。
莫能菌素抗性株可以如下获得在30℃下用终浓度为500μg/ml的化学诱变剂，N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍处理107-108/ml的亲株30分钟，并分离在含有不允许亲株生长的浓度的莫能菌素的基本琼脂平板培养基中生长的菌株。通过进一步培养所获得的莫能菌素抗性株，评价其产生L-赖氨酸的能力，并选择具有改善的生产L-赖氨酸的能力的菌株，可以获得本发明的突变株。
上述亲株和从其衍生而来的莫能菌素抗性株具有如下特征亲株谷氨酸棒杆菌CH77(KFCC-10881)是S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性、氨基羟基戊酸抗性、甲基赖氨酸抗性、叠氮化钠抗性、高丝氨酸渗漏且需亮氨酸的。
突变株谷氨酸棒杆菌CJM107(KCCM-10227)是S-(2-氨基乙基)半胱氨酸抗性、氨基羟基戊酸抗性、甲基赖氨酸抗性、叠氮化钠抗性、高丝氨酸渗漏且需亮氨酸的，另外，其是莫能菌素抗性的。
莫能菌素抗性株，谷氨酸棒杆菌CJM107，根据布达佩斯条约，保藏于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，361-21，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，汉城102-091，韩国，保藏日为2000年11月15日，保藏号为KCCM-10227。
通过以下方法测试亲株CH77和突变株CJM107对莫能菌素的抗性。细胞在Luria-Bertani(LB)液体培养基中生长16小时。然后，用消毒的生理盐水将细胞洗涤两次，接着，适当稀释并在含7000μg/l莫能菌素的基本琼脂平板培养基[每1升蒸馏水(pH7.0)含葡萄糖10g、(NH4)2SO42g、尿素2g、KH2PO41g、K2HPO43g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O10mg、MnSO4·7H2O10mg、生物素100μg、盐酸硫胺素100μg、CaCl2·2H2O 100μg、Na2B4O7·10H2O 80μg、(NH4)6MoO27·4H2O 40μg、ZnSO4·7H2O 10μg、CuSO4·7H2O 10μg、MnCl2·4H2O 10μg、FeCl3·6H2O 1mg、琼脂20g，如果需要，L-亮氨酸0.1g，如果需要，L-苏氨酸0.1g，如果需要，L-甲硫氨酸0.1g]中培养4天。各菌株的生长如以下表1所示。表1谷氨酸棒杆菌CH77和CJM107对莫能菌素的抗性
+++充分生长，-不生长可以将常规用于氨基酸发酵的培养基用于培养本发明中使用的微生物。也就是说，任何培养基，只要其含有可以被所用菌株同化的碳源、氮源、无机盐、生长因子等，就可以用于本发明。糖类，如糖蜜、蔗糖、葡萄糖、果糖等，可以用作碳源。无机氮源，如氨、硫酸铵、尿素、氯化铵等，以及有机氮源，如酵母提取物、酵母水解产物、大豆饼粉酸水解产物、蛋白胨、玉米浆等，可以用作氮源。磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙等，可以用作无机化合物。另外，如果需要，可以使用维生素，如生物素和硫胺素，以及氨基酸，如亮氨酸、高丝氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸等。
培养在25-35℃下在有氧条件下进行，例如通过振荡培养或通气搅拌深层培养进行。培养基的pH在6-8的范围内，优选保持在中性附近。可以用碳酸钙、尿素或氨调节pH。通常，培养1-7天后，L-赖氨酸形成并积累在所得培养物肉汤中。培养完成后，用硫酸或盐酸处理培养物肉汤，接着，通过使用离子交换树脂处理、浓缩、盐析以及等电聚焦组合，可以从培养物肉汤中回收L-赖氨酸。
离心完成结晶后获得的浆液，获得第一湿产物。通过分批法再次浓缩母液并结晶，获得第二湿产物。合并第一和第二湿产物，并干燥，获得46g含98.5％L-赖氨酸的干燥产物。实施例3在含预处理糖蜜和粗糖的培养基中培养CJM107菌株。培养后，将硫酸加入1升L-赖氨酸发酵肉汤中，以将pH调节到2.0，从而将Ca2+转化为CaSO4。接着，施加肉汤使其被逆流吸附于阳离子交换树脂(Dianion SK-1B，SK-1BL)，所述阳离子交换树脂以铵离子形式再生。随后，用脱盐的水洗涤之，以除去残存在树脂层中的细胞团块，接着通过用2 N氢氧化铵洗脱而从其回收L-赖氨酸的浓缩部分。将回收的部分浓缩后，将浓缩液调节至pH5.0，并冷却至20℃，从而形成L-赖氨酸晶体。
离心完成结晶后获得的浆液，获得第一湿产物。通过分批法再次浓缩母液并结晶，获得第二湿产物。合并第一和第二湿产物，并干燥，获得47g含99％L-赖氨酸的干燥产物。
工业实用性根据本发明，通过由人工诱变产生产L-赖氨酸的对莫能菌素有抗性的棒杆菌，可以增加L-赖氨酸的发酵浓度和收率。因此，对莫能菌素具有抗性，并且能够产生L-赖氨酸的棒杆菌对于L-赖氨酸生产而言非常有用。
权利要求
1.对莫能菌素具有抗性且产生L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)CJM107(保藏号KCCM-10227)。
2.生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括通过在有氧条件下在发酵培养基中在25-35℃下振荡培养权利要求1的谷氨酸棒杆菌CJM10720小时而活化所述微生物，然后在25-35℃下在有氧条件下在发酵培养基中振荡培养所述微生物1-7天。
全文摘要
本发明公开了对抗生素莫能菌素具有抗性，并且产生L－赖氨酸的棒杆菌，以及通过直接发酵生产L－赖氨酸的方法，所述方法包括在发酵培养基中培养所述微生物，在所得培养物肉汤中积累L－赖氨酸，并从其回收L－赖氨酸。
文档编号C12P13/00GK1406275SQ01805762
公开日2003年3月26日 申请日期2001年12月28日 优先权日2000年12月30日
发明者金成俊, 李庚翰, 成珍锡, 林相曹, 张在佑 申请人:第一制糖株式会社