采用脂肪酶自β-内酯产生L-肉碱的方法
【专利摘要】本发明的主题是产生L-肉碱的方法，其中使β-内酯转变为L-肉碱，其中方法包括使β-内酯酶促转变为(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯，所述β-内酯是4-(卤代甲基)氧杂环丁烷-2-酮。
【专利说明】采用脂肪酶自β_内酯产生L-肉碱的方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及产生L-肉碱的方法。
【【背景技术】】
[0002]肉碱(维生素Bt ；3-羟基-4-三甲基铵基-丁酸盐)是自氨基酸赖氨酸及甲硫氨酸生物合成的季铵化合物。在活细胞中，需要其在脂质破裂期间将脂肪酸自胞质溶胶运输至线粒体，用于产生代谢能量。其被用作营养物补充物。肉碱以2种立体异构体存在。有生物学活性的形式是L-肉碱，而其对映异构体，D-肉碱，无生物学活性。当以工业方法产生L-肉碱时，期望以高纯度产生有生物学活性的L-型。
[0003]对于L-肉碱的工业生产描述了各种方法。已知微生物方法，其中直接由细菌产生L-肉碱。在其他方法中，由有机合成产生外消旋体，并随后分离为对映异构体。
[0004]而且，已尝试直接自手性前体合成L-肉碱。一组潜在前体是手性环状内酯。由于在原理上知道获得手性内酯的方法，L-肉碱在内酯环的水解后是可利用的。 [0005]US5, 473, 104公开了自(S)_3_羟基丁内酯制备L-肉碱的方法。该方法是2_步骤方法，其中在第I步骤中将(S)-3-羟基丁内酯转变为对应羟基-活化的内酯，而维持环结构。在第2步骤中，打开活化的内酯环，并用三甲基胺导入三甲基铵基团。总之，反应相对复杂，因为需要用苛刻的化学品活化中间体。
[0006]CH680 588A5公开了自β -内酯前体产生L-肉碱的方法，其中在2_步骤过程中将手性2-氧杂环丁烷酮转变为L-肉碱。在第I步骤中，使4-(氯甲基)-2-氧杂环丁烷酮经历水解步骤，其中打开环，并获得4-氯-3-羟基丁酸。在随后步骤中，用三甲基胺将酸转变为L-肉碱。但是，手性β_内酯的产生需要相对复杂的重金属催化剂，且产率常常不足。
[0007]Nelson&Spencer (J.0rg.Chem.2000, 65，1227-1230)公开了由酶法拆分用脂肪酶自β_内酯外消旋体获得对映体富集的β_内酯的方法。使用的底物是各种烷基-及芳基-β-内酯外消旋体。如总结于表1，产率仅对有限数量的反应是足够的。对映立体选择性强烈依赖于β -内酯的取代基，且小取代基甲基的对映体产率是非常低的(表1)。反应需要有机溶剂，诸如苄基醇，其由于环境原因，对于工业应用是不期望的。反应时间相对长(通常是72小时)。
[0008]US2006/0046286公开由酶促酯化自β -内酯获得手性β _ 丁内酯及3_羟基羧酸酯的方法。至于Nelson&Spencer,推荐使用脂肪酶。反应需要有机溶剂,诸如甲苯,及约16小时的相对长的反应时间。底物是β_ 丁内酯。在多数实验中，底物不是外消旋体，而是有光学活性的(R)-P-丁内酯。特定反应通常以增强的对映体纯度产生(R)-P-丁内酯，然而(S)-3-羟基丁酸酯，如果有，仅以相对低量获得(实施例1，6，7)。
[0009]由于对映体纯L-肉碱是重要工业产物，期望提供进一步有效的产生方法。特别是，期望提供以相对简单方式、以高总产率及对映体产率产生L-肉碱的方法。
[0010]【发明要解决的技术问题】
[0011]本发明要解决的技术问题是提供产生L-肉碱的方法，其克服上述的缺点。特别是，技术问题是提供有效及简单产生L-肉碱的方法。[0012]总产率以及手性产率应高。方法步骤数应相对低，且方法应不需要复杂的设备。总之，方法应具有高的原子经济性，且应是成本及人力有效的。使用的化学品应是容易可利用的，且应不是太昂贵的。
[0013]本发明要解决的另一问题是提供温和的方法，其避免苛刻的条件及苛刻的化学品。应避免影响环境的化学品，诸如有机溶剂或重金属，或可影响工人健康的那些，诸如芳族溶剂。应避免虽然可作为痕量杂质存在于产物中，但必需去除的重金属催化剂。特别是，应使用不包含贵金属，诸如钼的昂贵的催化剂。总体能量输入应低。特别是，反应应在相对低温及经相对低反应时间实施。
【
【发明内容】
】
[0014]意外地，由权利要求的方法解决了本发明要解决的技术问题。贯穿说明书公开了进一步的本发明的实施方式。
[0015]本发明的主题是产生L-肉碱的方法，其中使(6-内酯转变为L-肉碱，其中方法包括使P -内酯酶促转变为(R) -4-卤代-3-羟基丁酸或(R) -4-卤代-3-羟基丁酸酯，所述3 -内酯是4-(卤代甲基)氧杂环丁烷-2-酮。
[0016]所述肉碱是L-肉碱((R)-肉碱，左卡尼汀XL-肉碱是肉碱的有生理学活性的立体异构体。酶促转变的反应产物是(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或其酯，依赖于是在水性介质或在醇中实施酶促转变。此中间产物可在随后反应步骤中转变为L-肉碱。如对于对应L-肉碱，酸或酯的手性碳构型是(R)。由此，可通过由三甲基铵基利用亲核取代来取代中间体的卤素原子，而手性保持未受影响来简单实施随后转变为L-肉碱。
[0017]在本发明的【具体实施方式】中，(6-内酯是4_(氯甲基)氧杂环丁烷-2-酮，4-(溴甲基)氧杂环丁烷-2-酮或4-(碘甲基)氧杂环丁烷-2-酮。优选使用4-(氯甲基)氧杂环丁烷-2-酮。
[0018]优选地，酶对于P -内酯的(R)-异构体是立体选择性的。换言之，优选酶唯独地，或至少主要地，将(R)-内酯转变为对应(R)-酸或酸酯。由此，当底物是P -内酯外消旋体，或至少包含(S)-P-内酯及(R)-内酯时，酶选择性地将(R)-P-内酯转变为对应(R)-酸或酸酯，然而(S)-P-内酯保持未受影响或基本上未受影响。由此，在反应混合物中保持及蓄积对应(S)-P-内酯。由此，在产物中富集(R)-酸或酸酯。而且，会在产物中富集
(S)-P-内酯。二种化合物可由于它们在水及有机溶剂中的不同溶解度而彼此分离。当自^ -内酯外消旋体起始时，理想酶促反应会产生50%Mol_%(R)-酸或酸酯(100%ee的光学纯度)及50Mol-%的残留的(S)-P-内酯的混合物，随后会将其从混合物除去。
[0019]在本发明的优选的实施方式中，(6-内酯是外消旋体。优选地，获得对映体过量的(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯。对映体过量(关于(S)-4-卤代-3-羟基丁酸或酯)优选是高于80%，更优选高于90%、95%或99%对映体过量(ee)。
[0020]酶促转变在溶剂的存在下实施。优选地，溶剂包含水。水可以1-相系统或2-相系统存在。在水存在下，获得(R)-4-卤代-3-羟基丁酸。酶促转变则是酶促水解。酶促水解的结果，获得(R)-4-氯-3-羟基丁酸，(R)-4-溴-3-羟基丁酸或(R)-4-碘-3-羟基丁酸。[0021]优选地，溶剂仅是水。当使用水作为溶剂时，初始反应混合物是溶液或悬浮液。在此实施方式中，反应混合物优选是1-相系统，其中未观察到水相及液体有机相之间的清楚的相分离。
[0022]在本发明的另一优选的实施方式中，在2相系统中实施酶促转变，其中在水相中富集(R)-4-卤代-3-羟基丁酸。在2-相系统中，在有机相中富集相对非-极性的β-内酯底物，而在水相中富集离子酸产物。由此在结束反应之后，相可被分离，且水相已包含相对纯产物。有机相可包含任何溶剂，其中内酯是高度可溶性的，而酸的可溶性差。与此相t匕，水性介质中的1-相系统总体需要更少有机溶剂，由此由于经济及环境原因是有利的。
[0023]溶剂的实例包括烃，诸如脂肪族烃诸如戊烷，己烷，庚烷，辛烷，癸烷及环己烷，芳族烃诸如甲苯及二甲苯；卤化的烃诸如二氯甲烷，1，2- 二氯乙烷，氯仿，四氯化碳及邻-二氯苯；醚诸如二乙基醚，二异丙基醚，叔-丁基甲基醚，二甲氧基乙烷，乙二醇二乙基醚，四氢呋喃，1，4- 二噁烷及1，3- 二氧杂环戊烷；酰胺诸如甲酰胺；亚砜诸如二甲基亚砜。
[0024]在本发明的另一实施方式中，溶剂是醇，优选包含I~5个碳原子的醇，更优选甲醇、乙醇或丙醇。当在醇中及在水缺失下实施酶促转变时，产物是线性酯。随后，当酯转变为L-肉喊时，其是被去_酯化的。
[0025]在本发明的优选的实施方式中，在酶促转变之后，从溶液除去残留的内酯。优选地，通过用溶剂萃取来除去残留的内酯。例如，当在一-相系统中实施溶液时，残留的β_内酯可用酯，诸如乙酸乙酯，或用己烷萃取。优选地，实施用相对低量的溶剂的多次萃取。
[0026]在优选的实施方式中，酶是水解酶(酶学委员会编号EC3)。水解酶自底物由水解产生2种产物。优选地，水解酶是酯酶(EC3.1)或肽酶(EC3.4)。酯酶是将酯水解为酸及醇的水解酶，诸如脂肪酶。肽酶(蛋白`酶)是进行蛋白质水解(即，水解肽键)的酶。
[0027]在本发明的优选的实施方式中，酶是脂肪酶。脂肪酶对于(R)-P-内酯是选择性的。优选地，脂肪酶来自真菌、酵母或细菌。此意为所述生物是脂肪酶的来源。但是，脂肪酶可为人工的、尤其重组体脂肪酶。该脂肪酶是可商购的，例如购自公司N0V0ZymeS、Aman0Enzyme 或 Nagase0
[0028]优选地，酶是三酰甘油脂肪酶。该3.1.1.3类酶的脂肪酶催化甘油三酯水解为脂肪酸及甘油。
[0029]来自真菌、酵母或细菌的脂肪酶常常作为无活性前体体内合成。这些前体经处理及分泌。该脂肪酶是一般细胞外脂肪酶。通过切割下N-端肽，诸如信号肽或前肽产生成熟蛋白。根据本发明，脂肪酶优选是成熟脂肪酶。换言之，其优选是有活性的形式。本发明的方法优选是体外方法。
[0030]脂肪酶可包含氨基酸Ser-His-Asp的催化性三联体。例如，该脂肪酶见于酵母，诸如假丝酵母属(Candida)。
[0031]在本发明的优选的实施方式中，脂肪酶来自假丝酵母属(Candida)，假单胞菌属(Pseudomonas),曲霉属(Aspergillus),芽孢杆菌属(Bacillus)或嗜热丝孢菌属(Thermomyces)。脂肪酶可为该脂肪酶的衍生物,优选具有至少75%、优选至少90%的序列同一性的衍生物。
[0032]优选地,脂肪酶来自假丝酵母属(Candida),假单胞菌属(Pseudomonas)或曲霉属(Aspergillus)。更优选地,脂肪酶来自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)或南极假丝酵母(Candida antarctica)。脂肪酶可为该脂肪酶的衍生物,优选具有至少75%、优选至少90%的序列同一性的衍生物。
[0033]衍生物可由氨基酸取代、缺失、插入或修饰获得。优选地，衍生物由重组DNA修饰方法获得。该重组脂肪酶可相比它们的天然前体具有更高稳定性及效率。
[0034]尤其优选的是来自洋葱假单胞菌的脂肪酶和/或来自南极假丝酵母的脂肪酶B。发现这些酶以高的总产率及对映体产率提供期望的产物。
[0035]在高度优选的实施方式中，酶是SEQ ID NO:1的自洋葱假单胞菌的脂肪酶(UniProt 标识号 P22088[45-364];Joergensen et al.,J.Bacteriol.1991; 173，p559-567)。成熟蛋白是具有320个氨基酸的蛋白质。其源于包含信号肽及前肽的364个氨基酸的前体。
[0036]在另一优选的实施方式中，酶是具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的来自洋葱假单胞菌的脂肪酶。洋葱假单胞菌(P.cepacia)包含几种脂肪酶，其具有与SEQ IDN0:1具有高同源性的氨基酸序列。例如，酶可为洋葱假单胞菌碱性脂肪酶(NCBI Acc.No:ABX71757.1;Dalai et al.，J.Biotechnol.Appl.Biochem.2008; 51，p23_31 )。此喊性脂肪酶与SEQ ID NO:1的脂肪酶具有约98%序列同一性。酶也可为洋葱假单胞菌脂肪酶(Genbank:ABN09945.1;Yanget al., J.Mol.Catal., B Enzym.2007;45，p91_96)。此脂肪酶与SEQ ID NO:1的脂肪酶具有约92%序列同一性。
[0037]SEQ ID NO: 2的自南极假丝酵母的脂肪酶B (UniProt标识符P41365 [26-342])是具有317个氨基酸的蛋白质。成熟蛋白源于包含信号肽及前肽的342个氨基酸的前体。
[0038]优选地，衍生物是SEQ ID NO:1的自洋葱假单胞菌的脂肪酶和/或SEQ ID NO: 2的自南极假丝酵母的脂肪酶B的衍生物，优选与SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO: 2具有至少75%、优选至少90%的序列同一性的衍生物。如本文所用，序列同一性优选由BLAST根据标准参数测定。可由氨基酸取代、缺失、插入或修饰获得的该脂肪酶的衍生物，及获得该衍生物的方法，为本领域所知。例如，具有增加的催化性活性的来自洋葱假单胞菌的脂肪酶B的衍生物及它们的产生方法公开于Puech-Guenot et al., J.Biomol.Screen.2008; 13 (I)，p72_79。具有增加的催化性活性的来自南极假丝酵母的脂肪酶B的衍生物及它们的产生方法公开于Qian et al., J.Mol.Biol.2009; 393; pl91-201 ?
[0039]在本发明的优选的实施方式中，在(TC和50°C之间、优选20V和40V之间、特别约25°C或约30°C之间的温度实施酶促转变。考虑到使用的具体酶来调整温度。
[0040]在本发明的优选的实施方式中，在包含0.1~50重量％β_内酯，更优选0.1和10重量％之间或0.5和3重量％之间的β -内酯的水溶液中实施酶促转变。
[0041]在适当的缓冲剂中实施反应。使缓冲剂适应于使用的具体酶。通常，pH会是大致中性，例如5和9之间，或7和8之间。如果必需，可在反应期间通过添加碱或酸来使pH保持稳定。
[0042]在优选的实施方式中，反应混合物由缓冲剂，酶及内酯组成。可添加添加剂，例如增强酶的稳定性或更新的那些，诸如盐，金属离子或辅因子。总之，反应需要仅少量的化学品，且可以相对简单方式在温和的温度实施。[0043]当获得期望的量的酸或酸酯时，终止反应。反应可通过去除酶，例如通过过滤终止。当使用β -内酯外消旋体作为底物及高度选择性的酶时，达50%的β -内酯可转变为对应(R)-酸或(R)-酸酯。在去除及分离之后，残留的(S)-13-内酯可用于其他反应。[0044]反应时间可在I~50小时之间，优选2~20小时之间。发现用一些酶可在10小时之内、特别在8小时之内达到有效更新。
[0045]用于实施发明的开环反应的单-卤化的内酯为本领域所知。考虑到酶的立体选择性，β_内酯外消旋体可用于本发明的方法。单-卤化的β_内酯是可例如由对应环氧化物的低压羰基化获得的，如公开于US2007/0213524A1，或起始于不饱和的酸使用Lewis 酸及次氯酸盐，如描述于 Lopez-Lopez, Jose ；Tetrahedron Letters2007,48 (10)，1749-1752。
[0046]在本发明的优选的实施方式中，在催化剂存在下由[2+2]环加成反应获得手性4_(卤代甲基)氧杂环丁烷-2-酮。在本发明的特定实施方式中，使用手性内酯。此可增加在本发明的反应中的对映体产率。手性β_内酯可在手性催化剂的存在下由乙烯酮与醒X-CH2-CHO的[2+2]环加成获得,其中X选自Cl、Br及I。乙烯酮(ketene或ethenone,式C2H2O)是无色气体，其由于分子中的2个相邻双键而是高度反应性的。
[0047]在本发明的优选的实施方式中，使酶促转变中获得的4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯随后用三甲基胺(TMA)转变为L-肉碱。优选地，卤素原子在亲核取代反应中被三甲基胺基取代。可使TMA与β-内酯在碱存在下接触。碱可在使β-内酯与TMA接触之后添加。
[0048]在本发明的方法的优选的实施方式中，β -内酯在2-步骤方法中转变为L-肉碱。在第I步骤中，使4-(氯甲基)-2-氧杂环丁烷酮经历酶促水解，其中β -内酯环被打开，并获得4-氯-3-羟基丁酸。在随后步骤中，用三甲基胺将所述酸、酯转变为L-肉碱。
[0049]本发明的合成L-肉碱的例示方法显示于以下方案I。方法包括乙烯酮及式Cl-CH2-CHO的醛的[2+2]环加成。使得到的β -内酯外消旋体I经历酶促环切割反应而产生对应(R)-酸2a (在水作为溶剂中)或(R)-酯2b (在醇中)。然后用TMA使酸2a或酯2b转变为L-肉碱。
[0050]
【权利要求】
1.产生L-肉碱的方法，其中使P-内酯转变为L-肉碱，所述方法包括使P -内酯酶促转变为(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯，所述(6-内酯是4-(卤代甲基)氧杂环丁烷-2-酮。
2.前述权利要求之至少一项的方法，其中(6-内酯是外消旋体。
3.权利要求2的方法，其中获得对映体过量的(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯。
4.前述权利要求之至少一项的方法，其中在水性介质中实施酶促转变，并获得(R) -4-卤代-3-羟基丁酸。
5.前述权利要求之至少一项的方法，其中在两相溶液中实施酶促转变，其中在水相中富集(R)-4-卤代-3-羟基丁酸。
6.前述权利要求之至少一项的方法，其中，在酶促转变之后，从溶液除去残留的(6-内酯。
7.权利要求6的方法，其中通过用溶剂萃取来除去残留的(6-内酯。
8.前述权利要求之至少一项的方法，其中所述酶是脂肪酶。
9.前述权利要求之至少一项的方法，其中所述脂肪酶来自假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudom onas)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)或嗜热丝孢菌属(Thermomyces),或具有至少75%、优选至少90%的序列同一丨I"生的该脂肪酶的衍生物。
10.前述权利要求之至少一项的方法,其中脂肪酶来自洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)、突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、南极假丝酵母(Candidaantarctica)，脂肪酶优选具有SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，或具有至少75%、优选至少90%的序列同一性的该脂肪酶的衍生物。
11.前述权利要求之至少一项的方法，其中在(TC和50°C之间，优选在20°C和400C之间的温度实施酶促转变，和/或其中在包含0.1~10重量-内酯的水溶液中实施酶促转变。
12.前述权利要求之至少一项的方法，其中在乙烯酮和式X-CH2-CHO的醛的[2+2]环加成中的在前步骤中合成(6-内酯，其中X选自Cl、Br及I。
13.前述权利要求之至少一项的方法，其中用三甲基胺使酶促转变中获得的4-卤代-3-羟基丁酸或(R) -4-卤代-3-羟基丁酸酯转变为L-肉碱。
14.前述权利要求之至少一项的方法，其中酶促转变中(R)_4-卤代-3-羟基丁酸或(R) -4-卤代-3-羟基丁酸酯的总产率在基于P -内酯总初始量的40%及50%之间，和/或其中(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯的对映体纯度是至少90%。
15.产生(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯的方法，其中方法包括(6-内酯酶促转变为(R)-4-卤代-3-羟基丁酸或(R)-4-卤代-3-羟基丁酸酯，所述.3 -内酯是4-(卤代甲基)氧杂环丁烷-2-酮。
【文档编号】C12P7/62GK103703138SQ201280036473
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年7月25日 优先权日:2011年7月27日
【发明者】M·阿维, E·克莱格拉夫 申请人:龙沙有限公司