检测brca1基因表达的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术及临床分子诊断技术领域，特别是涉及一种用荧光定量PCR 方法快速高效地检测人类BRCA1基因mRNA表达水平的引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全球第二大常见恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中居首位。且发生率呈直线 上升趋势。5~10%的乳腺癌是因为携带高外显率的乳腺癌易感基因突变所致。其中最常 见的易感基因是BRCA1基因。
[0003]BRCA1(breastcancelsusceptibilitygene1)基因定位于 17q21，约 81kb，含有 23个外显子。BRCA1作为一种抑癌基因，呈常染色体显性遗传，其表达的蛋白含1863个氨 基酸，具有重要的生物学活性，参与细胞周期调控、DNA损伤修复、基因的转录调节，细胞凋 亡和泛素化等，当BRCA1基因的表达出现问题时，会导致DNA修复功能障碍、细胞代谢和增 殖，最终导致肿瘤的发生。
[0004] 新辅助化疗是重要的乳腺癌综合治疗手段之一，其中铂类化合物和微管类化疗药 以其抗癌谱广、作用强等特点成为最常使用的肿瘤化疗药物。然而铂类化合物和微管类化 疗药的疗效存在显著的个体差异。这种差异与乳腺癌组织中BRCA1基因mRNA表达水平密 切相关，在乳腺癌细胞株中BRCA1 mRNA的表达水平低可增加对铂类药物的敏感性，但对微 管药物耐药；而BRCA1的过表达则使损伤的DNA迅速修复，导致瘤细胞对铂类药物耐药，同 时却对微管类化疗药敏感。因此研究BRCA1基因的表达水平对铂类化疗药物及抗微管类药 物的指导用药具有重大的临床意义。
[0005] 用于检测BRCA1表达的方法包括蛋白水平的免疫组化和荧光定量PCR法等。其中 免疫组化法实验过程较为繁琐，需要的试剂种类繁多，周期长，试验结果主观性高；荧光定 量PCR中SYBR GreenI法特异性差，而双探针杂交法成本价格较高。上述现有技术的缺陷 均限制了BRCA1表达检测的适用范围。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中的上述问题，本发明采用实时荧光定量PCR技术结合Taqman 探针法用于检测BRCA1基因的表达水平。具体地，本发明提供了检测BRCA1基因表达的引 物和探针，包括该探针的检测试剂盒，还提供了该检测试剂盒的使用方法。
[0007] 本发明提供的检测BRCA1基因表达的引物和探针，包括：
[0008] BRCA1基因上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，
[0009] BRCA1基因下游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，
[0010] BRCA1基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，序列5'端标记荧 光报告基团，3'端标记淬灭基团。
[0011] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的引物和探针，BRCAlTaqman荧光探针核苷酸序 列5'端的荧光报告基团为FAM，3'端的淬灭基团为MGB。
[0012] 本发明提供的一种检测BRCA1基因表达的试剂盒，包括以上任一所述的检测 BRCA1基因表达的引物和探针。
[0013] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括用于检测内参基因B2M表达的 引物和探针：
[0014] B2M基因上游引物：核苷酸序列如SEQIDN0:4所示，
[0015] B2M基因下游引物：核苷酸序列如SEQIDNO: 5所示，
[0016] B2M基因Taqman荧光探针：核苷酸序列如SEQIDN0:6所示。当然地，该Taqman 探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0017] 选择内参基因是为了校正实验中出现的误差，确保实验结果的正确性。通过实验 验证以及软件GeNorm和NormFinder分析发现，B2M较GAPDH及⑶SB等为内参的肿瘤和正 常组内及组间的表达差异最小。
[0018] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，还包括第一链cDNA合成试剂，荧光定 量PCR检测反应液，阳性对照品及阴性对照品；其中阳性对照品为BRCA1基因标准品和B2M 基因标准品，阴性对照为DEPC水。其中，BRCA1标准品可以为含有梯度浓度BRCA1基因组 质粒DNA的溶液，B2M标准品可以为含有梯度浓度B2M基因组质粒DNA的溶液。
[0019] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，所述第一链cDNA合成试剂包括：反转 录酶1~5U、反转录10XRTBuffer适量、dNTPs1~2mM、BRCA1基因反转录引物对1~ 10pM、内参基因B2M反转录引物对1~10pM，DEPC水适量。
[0020] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒，所述荧光定量PCR检测反应液包括： Premix、BRCAl基因上下游引物对1~10pM、BRCAl基因Taqman荧光探针1~10pM、B2M基 因上下游引物对1~10pM、B2M基因Taqman荧光探针1~10pM、DEPC水适量；Premix可以 促使BRCA1基因和B2M基因的扩增效率都可以达到相近100%。所述Premix包括DNA聚合 酶1~2U、2. 0~5.OmMMgCl2、0. 2~0· 8mMdNTPs、10XBuffer、RNaseH。所述Buffer为 用于荧光定量PCR反应的缓冲液，现有常规试剂，可以直接购买市售商品或者自行配制。
[0021] 本发明提供的以上任一所述的检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法，其包括 的步骤如下：
[0022] (1)以乳腺癌组织和癌旁正常组织为待检样品，提取待检样品中的RNA，反转录成 样品cDNA;
[0023] (2)荧光定量PCR:以样品cDNA作为模板，用检测BRCA1基因表达的引物和探针、 检测内参基因B2M表达的引物和探针进行荧光定量PCR反应；BRCA1基因标准品与B2M基 因标准品及阴性对照品也与样品cDNA同时上机进行相同的操作；同一PCR反应绘制两种标 准品的标准曲线；
[0024] (3)数据采集和分析：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，分析标准曲 线的R2在0. 99以上，BRCA1基因和B2M基因扩增效率应在94~100%范围，再根据荧光定 量PCR仪器给出的Ct值，按照以下公式进行计算：
[0025] ΛCt(乳腺癌组织）=Ct(乳腺癌组织BRCA1基因）-Ct(乳腺癌组织B2M基因）；
[0026]ΛCt(癌旁正常组织）=Ct(癌旁正常组织BRCA1基因）-Ct(癌旁正常组织B2M 基因）；
[0027] ΛΛCt=ΛCt(乳腺癌组织）-ΛCt(癌旁正常组织）
[0028] 相对表达率=2ΛΛ%相对表达率>1判断为乳腺癌BRCA1基因高表达；相对表 达率<1判断为乳腺癌BRCA1基因低表达。
[0029] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法中，步骤（1)中反转录程序 为：50°C，30min;95°C，5min;5°C，5min1个循环。
[0030] 优选地，上述检测BRCA1基因表达的试剂盒的使用方法中，步骤（2)中荧光定量 PCR反应程序为：95°C预变性2min;95°C15s，60°C30s40个循环，当荧光基团选择FAM时 在60°C30s时采集荧光信号。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0032] 1.应用范围广：本发明的引物、探针及由其构成的试剂盒，能检测新鲜冰冻组织、 石蜡包埋样本、血液等多种不同形态的样品，均具有较高的灵敏度及特异性，应用范围广。
[0033] 2.操作简便：本发明的试剂盒中使用预混酶Premix，可一步加样，无需将样本与 酶混合，操作简便同时也降低了污染可能性。
[0034] 3.灵敏度高：本发明可对lng的样本进行有限扩增，检测结果可信。
[0035] 4.特异性高：本发明提供的BRCA1基因的上下游引物均为特异性引物，使用 Taqman探针法进彳丁定量。革巴序列由引物和探针双重控制，具有很尚的特异性。
[0036] 5.准确度好：以正常组织作为定量媒介，同步PCR反应过程，在同等实验条件下的 测量实现Ct值相互比较，可以减少实验过程造成的误差，实现荧光定量PCR检测BRCA1基 因的mRNA水平检测。
[0037] 6.快速：本发明的试剂盒检测速度快，可在2小时内完成。
【附图说明】
[0038] 图1是阳性对照品B2M基因荧光定量PCR扩增结果标准曲线图；
[0039] 图2是阳性对照品BRCA1基因荧光定量PCR扩增结果标准曲线图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0041] 实施例1 :本发明试剂盒的制备
[0042] 本发明试剂盒组成如下：
[0043] (1)第一链cDNA合成体系的配制见表1.
[0044] 表 1
[0047] (2)荧光定量PCR反应液配制见表2。
[0048] 表 2
[0049]
[0050] 注：Premix主要成分：DNA聚合酶 1 ~2U、2. 0 ~5.OmMMgCl2、0. 2 ~0· 8mMdNTPs、 10XBuffer、RNaseH(核糖核酸酶Η)。Premix是为了适应BRCA1及B2M引物探针特定自行 配制的预混液，可以快速准确地对目的基因进行检测定量；Premix制剂是PCR反应液的混 合试剂，操作方便简单避免了PCR操作中混