eier图。显然在 该verum组内的未发展存活时间明显短于生物标记物阳性verum患者（相比图3a)。
[0060] 图4a显示了生物标记物阳性患者对生物标记物阴性患者的Kaplan-Meier图，仅 从verum治疗的组中得到（实线：生物标记物阳性患者；虚线：生物标记物阴性患者）。明 显地，生物标记物阳性患者相比生物标记物阴性患者在存活可能性上有明显优势，甚至是 当两组都接受verum治疗MGN1703时。
[0061] 图4b显示了生物标记物阳性和阴性患者的安慰剂组的Kaplan-Meier图（实线： 生物标记物阳性患者；虚线：生物标记物阴性患者）。明显地当两组均仅用安慰剂治疗时， 两组均显示出或多或少相同的未发展存活。明显地，生物标记物适合于评估患者是否是 TLR-9激动剂的治疗的反应者。另外，安慰剂组显示了生物标记物与患者的全部健康状况引 起的效应无关。
[0062] 本发明提供了一种新型的预测性生物标记物，其针对采用TLR-9激动剂，特别是 具有带未甲基化CG基序的单链末端环的双链茎的共价闭合的自补DNA链治疗癌症的反应 者。基线处的活化的NKT细胞（⑶3+/⑶56+/⑶69+)的频率的确定允许评估是否患者是对 DNA构建体的治疗的反应者的可能性。重要的是，在安慰剂组，带有反应者类特性的患者，表 现了与非反应者相同的方式，显示了生物标记物阳性verum患者的延长的未发展存活时间 实际上归因于选择的治疗的生物标记物的施用，不只是更好的全身健康或任何非特异性效 应。
[0063] 材料和方法
[0064] 样品处理
[0065] FACS的全血（10mL)收集在StreckCytO-Chex?BCT试管中。在血液样品取样 后2小时内送至分析实验室。根据建立的实验，样品被存放于室温。评估浆细胞样树突细 胞（pDCs)、骨髓状树突细胞（mDCs)、单核细胞、天然杀伤（NK)细胞、NKT细胞、B细胞、T细 胞和其他细胞群体的频率和活化状态。
[0066] 分析方法
[0067] 荧光活化细胞分类（FACS)根据建立的原理实施。全血样品用荧光标记抗体进行 染色并且被孵育。免疫细胞的表型分析采用FACScalibur(BeCt〇nDickinson)流式细胞仪 实施。各分析的细胞群体的频率存档为患者的各样品。
[0068] 对特定细胞群体的活化的人PBMC的分析
[0069] 浆细胞样树突细胞（pDC)的⑶40表达
[0070] 细胞用下列单克隆抗体的组合进行染色：抗-系列标记-FITC，（包含针对⑶3、 CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 的抗体的抗体鸡尾酒）；抗-CD123-PE;抗-HLA-DR-PerCP; 抗-CD40-APC;PDC被定为：谱系阴性，HLA-DR阳性，CD123阳性细胞。在PDC群体中CD40 被用作活化标记物。
[0071] 使用了活化标记物CD69的NK-、NK-T和T细胞的活化
[0072] 细胞用下列单克隆抗体的组合来染色：抗⑶3-FITC;抗⑶56-PE;抗⑶69-APC。
[0073] NK细胞被定为：CD3阴性、CD56阳性细胞
[0074] NK-T细胞被定为：⑶3阳性、⑶56阳性细胞
[0075] T细胞被定为：⑶3阳性、⑶56阴性
[0076] ⑶69被用作所有3个群体的活化标记物。
[0077] 骨髓状树突细胞（mDC)的⑶86表达：
[0078] 细胞用下列单克隆抗体的组合进行染色：抗-系列标记-FITC，（包含针对⑶3、 CD14、CD16、CD19、CD20、CD56 的抗体的抗体鸡尾酒）；抗-CDllc-PE;抗-HLA-DR-PerCP; 抗-CD86-APC
[0079] MDC被定为：谱系阴性，HLA-DR阳性，CDllc阳性细胞。
[0080] 在MDC群体中⑶86被用作活化标记物。
[0081] B细胞和单核细胞的⑶86表达；单核细胞的⑶169表达
[0082] 细胞用下列单克隆抗体的组合进行染色：抗⑶14-FITC;抗⑶169-PE;抗 CD19-PerCP;抗CD86-APC
[0083] B细胞被定为⑶19阳性细胞。在B细胞群体中⑶86被用作活化标记物。
[0084] 单核细胞被定为⑶14阳性细胞。在单核细胞群体中⑶86和⑶169被用作活化标 记物。
【主权项】
1. 一种通过确定活化的自然杀伤T (NKT)细胞的频率来预测或监测患癌症或自身免疫 疾病的患者是否对TLR-9激动剂的治疗有反应的方法。2. 根据权利要求1的方法，其中所述TLR-9激动剂为包括至少一个序列基序N1N2CGN 3N4 的DNA构建体，其中N1N2和N 3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱氧胞苷，G是脱氧鸟 苷，A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。3. 根据权利要求1-2的方法，其中确定活化的NKT细胞在全部NKT细胞群体中所占的 比例。4. 根据权利要求1-3的任一项的方法，其中对TLR-9激动剂治疗有反应者具有的活化 的NKT细胞频率为活化的NKT细胞在全部NKT细胞群体中占至少3%。5. 根据权利要求1-4的任一项的方法，其中预先进行非DNA药物的诱导治疗。6. 用在癌症治疗方法中的TLR-9激动剂，其特征在于患者具有升高的活化的NKT细胞 水平。7. 根据权利要求6的激动剂，其至少包含DNA构建体，所述DNA构建体包括至少一个序 列基序N1N2CGN 3N4,其中N1N2和N 3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱氧胞苷，G是脱氧 鸟苷，A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。8. 根据权利要求7的激动剂，其中N 1N2是选自包含GT、GG、GA、AT或AA的组的元件， N3N 4是选自包含CT或TT的组的元件。9. 根据权利要求7或8的激动剂，其中所述DNA是包含单链或双链DNA的线性开链DNA 构建体，或是包含至少一个具有单链环的末端的线性双链DNA构建体。10. 根据权利要求7-9的任一项的激动剂，其中序列基序N 1N2CGN3N4位于所述DNA序列 的单链和/或双链区域内。11. 根据权利要求1-8的任一项的激动剂，包括至少一个L-DNA核苷酸。12. 根据权利要求7-11的任一项的激动剂，其中至少一个核苷酸被官能团修饰，所述 官能团选自包括羧基、胺基、酰胺基、醛亚胺基、缩酮基、缩醛基、酯基、醚基、二硫基、硫醇基 和醛基的组。13. 根据权利要求7-11的任一项的激动剂，其中所述DNA构建体连接化合物，所述化合 物选自包括肽、蛋白质、碳水化合物、抗体、脂质、胶束、囊泡、合成分子、聚合物、微弹、金属 颗粒、纳米颗粒或固相的组。14. 根据权利要求7-12的任一项的激动剂，其中所述DNA构建体为药物组合物的一部 分。15. 根据权利要求13的激动剂，其中所述药物组合物为疫苗。16. -种预测或监测患癌症或自身免疫疾病的患者是否对TLR-9激动剂的治疗有反应 的试剂盒，其包括对活化的NKT细胞在全部NKT细胞群体中的频率进行检测和定量的工具。17. 根据权利要求15的试剂盒，其中所述TLR-9激动剂包含包括至少一个序列基序 N1N2CGN 3N4的DNA构建体，其中N 1N2和N 3N4是A、C、T和G的任意组合，并且C为脱氧胞苷，G 是脱氧鸟苷，A是脱氧腺苷且T是脱氧胸苷。
【专利摘要】本发明大体上涉及根据癌症患者是否将对特异性治疗有反应来识别癌症患者。更具体地，本发明涉及一种用于识别对TLR-9激动剂治疗的反应者的方法和工具。
【IPC分类】G01N33/50, G01N33/574
【公开号】CN105247365
【申请号】CN201480024805
【发明人】M·施罗夫, M·施密特, K·卡普, B·维蒂希
【申请人】莫洛根股份公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年5月15日
【公告号】CA2907980A1, EP3004875A1, US20160115479, WO2014191222A1