高效产氢功能基因载体pETD-SL及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效产氢功能基因载体pETD-SL，及其构建方法和应用，涉及基因工程【技术领域】。pETD-SL基因载体为包含有[NiFe]氢酶基因的pETDuet-1质粒。其构建是通过设计引物扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因，并把上述两个基因片段用限制性内切酶酶切并用DNA连接酶将其相继连接到还有对应连接末端的pETDuet-1片段中，进行基因测序，验证基因的完整性。将pETD-SL质粒转化到细菌中，在产氢培养基中培养此细菌生产氢气。pETD-SL能够应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。也能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。
【专利说明】高效产氢功能基因载体PETD-SL及其构建和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别涉及一种高效产氢功能基因载体PETD-SL及 其构建和应用。
【背景技术】
[0002] 随着石油等化石能源的消耗速度加快及其储备不断减少的情况下，急需发展新型 能源，而氢能源作为一种既高效又清洁的能源而备受关注。氢能源即可通过化学方法得到， 但因其成本高且可能导致的环境污染问题而备受争议，而生物产氢即能解决这个问题。生 物产氢的微生物有很多，其中大肠杆菌产氢无论从成本还是从效率来看都是最佳选择之 一。目前来看，野生的大肠杆菌不产氢或者产氢较少，无法满足人类对能源的需求，因此，基 因工程或者代谢工程就需要应用于改造大肠杆菌使其产氢性能大量增加。现有的产氢大肠 杆菌消耗底物多，但是产生的氢气比较少，效率还比较低，急需通过改造引入外源基因使其 产氢效率大幅度提高，而不同的外源基因的产氢效率也有所差别。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一个高效产氢功能基因载体PETD-SL，及其构建方法。其能够 应用于不同细菌中，既能使不产氢的细菌产氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种高效产氢功能基因载体PETD-SL，其为包含有沼泽红假单胞菌的 [NiFe]氢酶基因中大亚基基因片段和小亚基基因片段的pETDuet-Ι质粒。
[0006] 本发明还提供了高效产氢功能基因载体PETD-SL的构建方法，包括以下步骤：
[0007] (1)设计[NiFe]氢酶基因中大亚基hupL和小亚基hupS的引物，并扩增[NiFe]氢 酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因。
[0008] (2)回收[NiFe]氢酶的大亚基hupL和小亚基hupS的基因片段，进行测序验证扩 增基因的完整性。
[0009] (3)外源基因的克隆主要借助PCR技术，通过查找沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基 因的同源序列，利用DNAman或Primer设计DNA引物，克隆沼泽红假单胞菌[NiFe]氢酶基 因，且通过DNA测序验证了序列的完整性。
[0010] (4)根据pETDuet-Ι上的酶切点设计引物，PCR扩增大亚基hupL和小亚基hupS基 因片段，其中，作为优选，所述大亚基酶切位点为BamH I，AscI ;所述小亚基酶切位点为BgI II，Knp L·
[0011] (5)切割回收扩增好的带有限制性酶切点的大亚基和小亚基基因片段，并用克隆 载体PMD19-T质粒分别将大、小亚基基因片段连接起来，得到含大亚基和小亚基基因片段 的重组载体。
[0012] (5)将重组载体中小亚基和pETDuet-Ι质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应， 然后用DNA连接酶将酶切后的pETDuet-Ι片段与的酶切好的小亚基片段连接得到pETD-S 质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BgI II，Knp I。
[0013] (6)将重组载体中大亚基和（5)中pETD-S质粒分别用限制性内切酶作双酶切反 应，然后用DNA连接酶将酶切后的pETD-S片段与的酶切好的大亚基片段连接，得到含有大、 小亚基片段的PETD-SL质粒；其中，此步骤中所述限制性内切酶为酶BamH I，AscI。
[0014] 作为优选，上述步骤中还包括将基因扩增后测序，验证基因的完整性。
[0015] pETDuet-Ι质粒有2个多克隆位点，每个多克隆位点各有一个抗体标签和12个内 切酶位点。本发明通过BamH I和Sal I位点插入了大亚基基因，通过BgI II和Kpn I位 点插入了小亚基基因。
[0016] 本发明还提供高效产氢功能基因载体pETD-SL的应用：将pETD-SL质粒转化到大 肠杆菌中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
[0017] 本发明中沼泽红假单胞菌，来源于专利保藏菌株。菌种保藏单位为位于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研宄所的中国普通微生物菌种保藏管理 中心，菌种名称沼泽红假单胞菌，拉丁文为Rhodopeseudomonas palustris，菌种保藏号为 CGMCC NO. 9276,菌种保藏日期为 2014. 06. 06。
[0018] 本发明的有益效果是pETD-SL能够应用于大肠杆菌中，既能使不产氢的细菌产 氢，也能使产氢的细菌的产氢效率明显提高，消耗同样的底物浓度能产生更快更多的氢气。 能够改良现有工业产氢的大肠杆菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0020] 图1是载体PETD-SL的构建方案示意图；
[0021] 图2是pETD-SL质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中随时间的产氢曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 实施例1 :
[0024] (1)在NCBI上查找关于沼泽红假单胞菌NiFe氢酶的同源基因序列，利用DNAman 软件结合NCBI上查找的同源基因序列一同设计，分别设计大亚基hupL和小亚基hupS引 物。将设计好的引物交给基因测序公司进行引物合成，引物合成的方法是固相亚磷酰胺三 酯法。
[0025] 设计出来的引物为：
[0026] hupLu:AACGGCAAGTCGGCTTAA ;hupLd:TGATAGACATAGACCGTCTGCAAC ;
[0027] hupSu:GGCTTATCACCTCGTCGTCGTTT ;hupSd:AGTCGTGACGTTGGTCATG ;
[0028] (2)根据设计好的引物，利用PCR技术扩增NiFe氢酶基因片段，即大亚基hupL和 小亚基hupS。PCR条件设置：变性95°C 30s，复性55°C 30s，延伸72摄氏度1. 5分钟，35个 循环；20uL 体系：2uL 10*Taq buffer，2uL MgCl2，luL 10mmdNTP，12uL ddH20, IuLDAN模板， IuL上引物，IuL下引物，0. 2uLTaq DNA酶。
[0029] (3)将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并在凝胶成像仪下切割回收大小亚基片 段，最后将切割片段用胶回收试剂盒（Omega Bio-Tek，USA)回收，各35uL的大小亚基片段。
[0030] (4)将胶回收的片段送往基因测序公司测序，以验证扩增基因的完整性。
[0031] (5)经过验证后，根据pETDuet-Ι上的酶切位点设计引物，并再次使用PCR技术扩 增NiFe氢酶基因片段。PCR条件设置，变性95°C 30s，复性55°C 30s，延伸72°C 1.5分钟， 35个循环。此时得到的片段带有限制性酶切位点，用于与载体的连接；（大亚基酶切位点 BamH I, AscI ;小亚基酶切位点 BgI II，Knp I)弓丨物序列为：hupLu:cgggatcccgTAACGGCAAG TCGGCTTA ；
[0032] hupLd:aggcgcgcctTGATAGACATAGACCGTCTGCAAC ；
[0033] hupSu:gaagatcttcGGCTTATCACCTCGTCGTTT ；
[0034] hupSd:ggggtaccccAGTCGTGACGTTGGTCATG ；
[0035] (6)将（5)扩增好的带有限制性酶切位点的大亚基和小亚基用用琼脂糖凝胶电泳 分离，并凝胶成像仪下切割回收，最后用PMD19-T质粒分别将大小亚基连接起来，得到含有 大亚基和小亚基基因片段的pMD19_T质粒各30uL;①连接体系：luL pMD19_T Vector，3uL DNA模板，IuL dH20,5uL Solution I ;②16°C反应30分钟；③将连接好的质粒加入IOOuL的 DH5 α感受态中，冰中放置30分钟；④42°C加热45秒，再在冰中放置1分钟；⑤加入400uL LB培养基，37°C振荡培养40分钟；⑥将培养液倒入含有氨苄的固体LB培养基培养过夜；挑 选单菌落放入IOOmL含有氨苄的液体LB培养基扩大培养，最后用质粒提取试剂盒（Omega Bio-Tek, USA)提取质粒。
[0036] (7)将（6)中的小亚基用酶BgI II，Knp I作分步酶切反应，得到含有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段，酶切步骤为：①反应温度37°C，缓冲液5*NEBuffer 3. 15uL， 酶BgI II luL，小亚基基因20uL，无菌水24uL反应时间3h;②利用胶回收试剂盒（Omega Bi〇-Tek，USA)回收①的酶切片段；③反应温度37°C，缓冲液5*NEBuffer I. lluL，酶Knp I luL，①切片段20uL，无菌水24uL，反应时间3h ;最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回收后 含有Bglll，Knp I的粘性末端的小亚基片段10uL。
[0037] (8)分别将20uL pETDuet-1质粒用酶BgI II，Knp I作分步酶切反应，得到含 有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段，酶切步骤及体系为：①反应温度37°C，缓冲 液5*NEBuffer 3. 15uL，酶BgI II IuL,小亚基基因20uL，无菌水24uL反应时间3h ;② 利用胶回收试剂盒（Omega Bi〇-Tek，USA)回收①的酶切片段；③反应温度37°C，缓冲液 5*NEBuffer I. lluL，酶Knp I luL，①切片段20uL，无菌水24uL，反应时间3h;最后酶切片 段用胶回收试剂盒回收，回收后含有BgI II，Knp I的粘性末端的小亚基片段IOuL;最后得 到含有BgI II，Knp I粘性末端的pETDuet-Ι质粒10uL。
[0038] (9)将⑶中酶切好的pETDuet-Ι质粒与（7)的酶切好的小亚基片段作酶连反应， 得到含有小亚基片段的pETDuet-Ι质粒，即pETD-S质粒；酶连反应体系：T4DNA连接酶luL， 10*T4DNA连接酶反应缓冲液luL，（7)中的小亚基片段3uL，（8)中酶切好的pETDuet-Ι质 粒luL，无菌水4uL，反应温度16°C，反应时间15分钟。
[0039] (10)将（6)中的大亚基用酶BamH I，AscI作双酶切反应，得到含有BamH I，AscI 的粘性末端大亚基片段，酶切体系是：温度37°C，缓冲液5*Cutsmrat 5uL，酶BamH I，AscI 各luL，大亚基基因20uL，无菌水23uL，酶切时间3h ;最后酶切片段用胶回收试剂盒回收，回 收后含有BamH I，AscI的粘性末端的大亚基片段10uL。
[0040] (11)将分别将（9)中的PETD-S质粒用酶BamH I，AscI作双酶切反应，得到含有 BamH I，AscI的粘性末端大亚基片段，酶切体系是：温度37°C，缓冲液5*Cutsmrat 5uL，酶 BamH I，AscI各luL，大亚基基因20uL，无菌水23uL，酶切时间3h ;最后酶切片段用胶回收 试剂盒回收（Omega Bio-Tek，USA)，最后得到含有BamH I，AscI粘性末端的pETD-S质粒 IOuL ；
[0041] (12)将（11)中酶切好的pETD-S质粒与（7)的酶切好的大亚基片段作酶连反应， 得到含有大，小亚基片段的pETDuet-Ι质粒，S卩pETD-SL质粒IOuL ;酶连反应体系：T4DNA 连接酶luL，10*T4DNA连接酶反应缓冲液luL，（10)中的大亚基片段3uL，（11)中酶切好的 pETD-S质粒luL，无菌水4uL，反应温度16°C，反应时间15分钟。
[0042] (13)将（12)中的质粒在扩增后送往基因公司测序，以验证基因的完整性；
[0043] (14)将（13)中已验证后的质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，利用产氢培养基检 验其产氢特性。
[0044] 在含有100 μ g/mL氨苄的250mL的LB中培养，培养条件：37°C，200rpm，培养时间： 20小时，得到富集后的大肠杆菌；
[0045] 将LB培养基中的大肠杆菌按1% v/v的量接种到含有200mL产氢培养基的无菌 厌氧瓶中发酵，发酵条件：①37°C，200rpm培养到OD6tltlmi= 0. 6 ;②加入IPTG诱导剂至浓度 为lmM，37°C，静置培养。当加入IPTG后，每隔一小时从厌氧瓶抽取500uL的气体样品，使 用GC7900气相色谱仪进行样本分析。分析条件，80/100目的5A分子筛，T⑶检测器温度 120°C，进样口温度KKTC，柱温85°C，载气为氩气。产氢实验时间一共持续14小时。
[0046] 在产氢实验进行14小时后，总共产生122. 9mL的氢气，产氢曲线如图2所不，产氢 效率为每消耗Imol的葡萄糖能产生0. 32mol的氢气。实验效果显示，与不产氢的大肠杆菌 BL21(DE3)比较，pETD-SL能使不产氢的大肠杆菌产生氢气，且效果良好。实验也证明，本发 明所构建的产氢质粒PETD-SL能用于改良产氢细菌，使产氢效率大幅度提高。转化细菌种 类仅限于通过镍铁氢酶产氢的原核微生物。
[0047] 上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述 实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于 上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、 创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 高效产氢功能基因载体PETD-SL，其特征在于，所述基因载体为包含有沼泽红假单 胞菌的[NiFe]氢酶基因中大亚基基因片段和小亚基基因片段的pETDuet-1质粒。
2. 根据权利要求1所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL，其特征在于所述沼泽红假 单胞菌的菌种保藏号为CGMCC NO. 9276。
3. 如权利要求1或2所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 设计沼泽红假单胞菌中[NiFe]氢酶基因中大亚基hupL和小亚基hupS的引物，并 扩增[NiFe]氢酶基因片段的大亚基hupL和小亚基hupS基因； (2) 回收[NiFe]氢酶的大亚基hupL和小亚基hupS的基因片段，进行测序验证扩增基 因的完整性； (3) 根据pETDuet-1质粒上的酶切位点设计引物，PCR扩增大亚基hupL和小亚基hupS 基因片段； (4) 切割回收扩增好的带有限制性酶切点的大亚基和小亚基基因片段，并用克隆载体 PMD19-T分别将大、小亚基基因片段连接起来，得到含大亚基和小亚基基因片段的重组载 体； (5) 将重组载体中小亚基和pETDuet-1质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然后 用DNA连接酶将酶切后的pETDuet-1质粒片段与的酶切好的小亚基片段连接得到pETD-S 质粒； (6) 将重组载体中大亚基和（5)中pETD-S质粒分别用限制性内切酶作双酶切反应，然 后用DNA连接酶将酶切后的pETD-S片段与的酶切好的大亚基片段连接，得到含有大、小亚 基片段的pETD-SL质粒。
4. 根据权利要求3所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于，还 包括将pETD-SL基因扩增后测序，验证基因的完整性。
5. 根据权利要求3所述的高效产氢功能基因载体pETD-SL的构建方法，其特征在于，所 述大亚基酶切位点为BamH I，AscI;所述小亚基酶切位点为Bgl II，Knp I。
6. 高效产氢功能基因载体pETD-SL的应用，其特征在于，将权利要求1或2所述高效产 氢功能基因载体pETD-SL转化到大肠杆菌中，在产氢培养基中培养此大肠杆菌生产氢气。
【文档编号】C12P3/00GK104498516SQ201410647807
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】王以明, 高瑞, 周鹏 申请人:成都理工大学