果便形成了金标单抗+拟穴青蟹呼肠孤病毒抗原+抗拟穴青 蟹呼肠孤病毒p29蛋白的多克隆抗体的夹心结构，最终是抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白 单克隆抗体上标记的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼可见的红色线，未反应的金标单 抗则仍继续层析前行，当到达点预先包被在质控线免抗鼠 IgG处时，抗体类型为IgG的金 标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色 线，结果是：检测线显示红色表示抗拟穴青蟹呼肠孤病毒阳性；检测线不显示红色，表示抗 拟穴青蟹呼肠孤病毒阴性，即检测样品中不含抗拟穴青蟹呼肠孤病毒或是抗拟穴青蟹呼肠 孤病毒含量极低，质控线显示红色，表示试纸有效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即 或是抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白单克隆抗体、或是免抗鼠 IgG失活，检测结果无效。
[0026] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0027] 1、本发明的拟穴青蟹呼肠孤病毒快速检测试纸，具有检测快速、简便、准确、灵敏 等特点，并具有$父尚的稳定性；
[0028] 2、本发明的拟穴青蟹呼肠孤病毒快速检测试纸使用方法中，无需加入特殊的裂解 液；只需将草青蟹腮组织捣碎即可，与传统病毒提取研磨、离心等方法相比，此方法方便简 单，可快速提取病毒检测；
[0029] 3、受外界因素影响较小，检测灵敏度和准确性高；
[0030] 4、能稳定保存，携带方便，不需仪器设备，综合成本较低，非常适合临床和基层单 位使用。
[0031] 5、本发明的试纸操作简单易掌控，无需专业人员操作。
[0032] 保藏说明
[0033] 1、杂交瘤细胞株Mab-1M9,分类命名为：抗青蟹呼长孤病毒p29蛋白单克隆抗体杂 交瘤细胞株，于2015年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 10888,保藏单位地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号。
【附图说明】
[0034] 图1为纯化的重组蛋白p29聚丙烯酰胺凝胶电泳结果（其中泳道1为蛋白分子质 量标准，泳道2为纯化的重组蛋白p29);
[0035] 图2为Westernblotting结果图（其中泳道1为蛋白分子质量标准，泳道2为重 组蛋白p29);
[0036] 图3为免疫胶体金试纸组装示意图。
【具体实施方式】
[0037] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0038] 生物材料来源：
[0039] 拟穴青蟹呼肠孤病毒SsRV :申请者实验室从患清水病青蟹中分离获得；
[0040] pET28a(+)，大肠杆菌表达载体，从美国Novogen公司引进；
[0041] 大肠杆菌（E. coli)BL21 (DE3):从美国Novogen公司引进；
[0042] PMD18-S12,由申请者所在实验室获得〔Molecular characterization of eight segments of Scylla serrata reovirus(SsRV)provides the complete genome sequence ； Jigang Chen,Juan Xiong, Bojing Cui,Jifang Yang, Wenchen Li, Zhijuan Mao ；Arch Virol.2012, 157(8):1551-1557.〕。
[0043] 实施例1
[0044] 如附图，本发明的能检测拟穴青蟹呼肠孤病毒的免疫胶体金试纸，该试纸条是由 样品垫1、结合垫2、硝酸纤维膜3、吸收垫4、硬质聚氯乙烯衬板5通过粘结组合成一体而构 成，其中，在硝酸纤维膜3的中部喷涂有检测线6和质控线7,胶体金结合垫2由玻璃纤维素 膜制成，该胶体金结合垫2上喷涂胶体金标记的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白单克隆抗 体1M9 (G-1M9)，单克隆抗体为用纯化His-p29蛋白免疫Balb/c小鼠，经细胞融合，筛选得 到的杂交瘤细胞株1M9分泌的；硝酸纤维素 NC膜为试纸条的检测膜，上面靠左侧的为检测 线6,质控线7位于右侧，检测线6喷涂兔抗拟穴青蟹呼肠孤病毒SsRV p29蛋白多克隆抗体 PcAbl，质控线7喷涂兔抗鼠 IgG抗体PcAb2。当被检样品中含有拟穴青蟹呼肠孤病毒时，免 疫胶体金标记物的抗拟穴青蟹呼肠孤病毒P29蛋白单克隆抗体G-1M9与拟穴青蟹呼肠孤病 毒SsRV表面蛋白p29结合，形成免疫复合物质G-lM9-SsRV随着层析移动，会被在喷涂检测 线6上的PcAbl捕获，形成G-lM9-SsRV-PcAbl复合物，富集形成肉眼可见的红色，未结合完 的G-lM9-SsRV复合物继续运动到质控线7上，被PcAb2捕获，形成G-lM9-PcAb2-SsRV复合 物，显示出肉眼可见的红色；如果只出现质控线7,则为阴性；两条线都出现则为阳性；若质 控线7和检测线6均不出现，则说明试纸条失效。
[0045] 实施例2抗拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白重组抗原的制备
[0046] 利用特异性引物，通过聚合酶链式反应方法对拟穴青蟹呼肠孤病毒p29蛋白对 应的病毒基因组第12节段（S12)进行扩增，成功扩增获得SsRV S12基因开放阅读框 (ORF)，将S12基因 ORF克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，构建原核重组表达载体 PET28-S12:
[0047] 正向引物：5' -CGGGATCCATGAACCTGGAAATTAACAAC-3'（SEQ ID NO. I)
[0048] 反向引物：5'-CCCAAGCTTAGTAATCGAGAACCCACTT-3'（SEQ ID NO. 2)
[0049] 以含有呼肠孤病毒S12节段全长的重组载体PMD18-S12为模板进行PCR扩增， 25yL 反应体系含：质粒 PMD18-S12(100ng/yL)l yL、上下游引物（20μΜ)各 I yL、dNTP mix (IOmM) 1 μ L、10 X PCR Buffer2. 5 μ L、Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L，去离子水补至 25 μ L。
[0050] 30次循环PCR程序为：95°C预变性3分钟，95°C变性1分钟，47°C退火45sec，72°C 延伸2分钟，共30个循环进行PCR，最后延伸10分钟。
[0051] 扩增产物用限制酶BamH I、Hind III消化后，与同酶线性化pET-28a(+)连接，获 得重组载体PET-S12 ;用重组载体转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，在含50 μ g/mL卡 那霉素琼脂平板上37°C培养过夜，获得pET-S12重组菌；挑取单菌落接种含50 μ g/mL卡 那霉素的LB培养基，37°C培养过夜作为种子液；按1:100比例接种1000 mL含50 μ g/mL卡 那霉素 LB培养基，37 °C震荡（200转/分钟）培养至0D_达到0. 8时，加入IPTG至终浓度 lmmol/L，37°C振荡（200转/分钟）诱导培养5h ;4°C、5000转/分钟离心2分钟收集菌体。 变性条件下纯化目的产物按QIAGEN公司的QIAexpressionist?蛋白纯化系统操作指南进 行，并略加改进。具体步骤为：菌体按5mL/g的比例悬浮于缓冲液B(K)OmM NaH2PO4, IOmM Tris，C1，8M urea, pH8. 0)，在室温下轻微振荡45~60分钟（避免气泡产生），用超声破碎 仪400W超声波击打30次，12000转/分钟，4°C离心15分钟，取上清加入2mL Ni-NTA，200转 /分钟，37°C振荡30分钟，使重组蛋白和Ni2+-NTA固相充分结合后，用4mL洗脱液C(K)OmM NaH 2PO4, IOmM Tris · C1，8M urea，20mM imidazol，ρΗ6· 3)洗脱 4 次后，再用 0· 5mL 洗脱液 D(K)OmM NaH2PO4, IOmM Tris · C1，8M urea，ρΗ5· 9)和 0· 5mL 洗脱液 E(K)OmM NaH2PO4, IOmM Tris ·α，8Μ urea，pH 4. 5)各洗脱4洗，收集洗脱液E既为纯化的蛋白His-p29。取0. 5yL 纯化产物与蛋白质分子量标准进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（5%的浓缩胶，12%的分离 胶），经考马斯蓝染色后，用凝胶成像系统观察重组蛋白纯化效