一种甲型流感病毒荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，更为具体地说，设及一种甲型流感病毒巧光定量 PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 流行性感冒病毒（influenzavirus),简称流感病毒，是一种造成人类及动物 患流行性感冒的RNA病毒。人流感病毒分为甲（A)、乙度)、丙似Ξ种类型，是流行性 感冒的病原体。禽流感（avianinfluenza,即AI)是禽流行性感冒的简称，它是一种由 甲型流感病毒的某种亚型引起的传染性疾病。在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科 的rthomyxoviridae)，流行性感冒病毒属（Influenzavirus)，流感病毒会造成急性上呼吸 道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。
[0003] 甲型流感病毒颗粒呈球形，自外而内可分为外膜、基质蛋白W及核屯、Ξ部分。外 膜主要成份是脂质，外表面有血凝素和神经氨酸酶两种糖蛋白突起，运些糖蛋白突起是流 感病毒抗原结构的主要成分，外膜内表面为一层作为基质的蛋白质，病毒的核屯、包含了存 胆病毒信息的遗传物质W及复制运些信息必须的酶，甲型流感病毒的遗传物质是单股负链 RNA。其RNA由8个节段组成，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编 码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；第7个节段编码 基质蛋白，第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。
[0004] 流行性感冒的临床症状易与普通感冒相混淆，特别是近年来出现急性、烈性的高 致病性禽流感病毒（HPAIV)感染人的事件，不但给养禽业带来巨大的经济损失，而且还是 引起人类死亡的主要原因之一，因此建立一种准确快速的诊断方法意义重大。在实验室诊 断流感病毒的手段中，一般采取接种鸡胚或狗肾传代细胞（MDCK)进行病毒分离和鉴定，但 分离时间较长，不利于对疫情快速采取应对措施。ELISA、胶体金检测方法虽然操作简单和 耗时短，但在特异性、灵敏度等性能上比较差，因而在实际应用中受到限制。PCR检测技术快 速灵敏，但由于流感病毒的亚型众多，再加上基因突变、重组和重排，使得其变异极快，造成 现有很多的PCR核酸检测方法存在一定的缺陷和误检，准确性不好。因此亟需一种准确性 高、亚型覆盖广、病毒变异对检测结果无影响的甲型流感病毒快速检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒，W解决背景技 术所述的现有甲型流感病毒检测方法准确度差的问题。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括 用于检测寡核巧酸的探针和用于扩增寡核巧酸的上下游引物；所述用于检测寡核巧酸的探 针具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的碱基对序列。
[000引优选地，所述用于扩增寡核巧酸的上下游引物具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、 沈QIDNO:3和/或沈QIDNO:4的碱基对序列。
[0009] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为含RNA序列的慢病毒颗粒，且所 述内标所对应的cDNA具有SEQIDNO:10的碱基对序列。
[0010] 优选地，所述检测试剂盒还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针具有 SEQIDNO:9的碱基对序列。
[0011] 优选地，所述检测试剂盒还包括用于扩增内标的上下游引物；所述上下游引物具 有沈QIDNO:5和沈QIDNO:6的碱基对序列。
[001引优选地，所述检测试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、金属阳离子。
[0013] 优选地，所述PCR缓冲液为5XPCR缓冲液，所述5XPCR缓冲液包括抑为8. 2且 浓度为0. 25mol/L的N，N-二径乙基甘氨酸/氨氧化钟；浓度为575mmol/L的乙酸钟和体积 比为40 %的甘油。
[0014] 优选地，所述DNA聚合酶包括TthDNA聚合酶和H-化qDNA聚合酶。
[001引优选地，所述金属阳离子为浓度为150mmol/L的Mn(0Ac)2。
[0016] 本发明所提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用 于检测寡核巧酸的探针和用于扩增寡核巧酸的上下游引物；所述用于检测寡核巧酸的探针 具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的碱基对序列。本发明所提供的甲型流感病毒巧光定量 PCR检测试剂盒在对其他病原体感染样本进行检测时无交叉反应，因而具有很好的特异性， 同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。本发明所提供的甲型流感病毒 巧光定量PCR检测试剂盒通过与其他试剂盒相比具有很好的一致性，且准确度高、操作快 速、方法简便。
【附图说明】
[0017]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可W根据运些附图获得其它的附图。
[0018]图1是本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒灵敏度检测的 扩增曲线图；
[0019]图2是本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒对其它病原体 进行检测的PCR扩增曲线图；
[0020] 图3是本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒抑制物/干扰 物效果测试的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒，解决了现有甲型流 感病毒检测方法准确度差的问题。
[0022] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实 施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术 方案作进一步详细的说明。
[0023] 本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒包括用于检测寡核 巧酸的探针和用于扩增寡核巧酸的上下游引物；所述用于检测寡核巧酸的探针具有SEQID NO:7或SEQIDNO:8的碱基对序列。
[0024]其中，SEQIDNO:7 的碱基对序列为CGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTATC;SEQIDNO:8的碱基对序列为〇：4押〇：了66了〇：7^了66〔〇：461'。寡核巧酸探针沈0 10側：7和沈010側： 8的两端分别具有巧光标记FAM和B册1，且寡核巧酸探针能够在寡核巧酸探针与甲型流感 病毒祀核酸序列互补性决定的特定位置或内标质控核酸序列互补性决定的特定位置上与 扩增产物杂交后，通过高强度光源激发，W启动能量转移，产生FRET信号。具有SEQIDNO: 7或SEQIDNO:8的碱基对序列的用于检测寡核巧酸的探针为两套独立的探针，在用于检 测甲型流感病毒时，上述两套寡核巧酸探针可单独使用。优选地，在本试剂盒中上述检测寡 核巧酸的探针同时使用。
[002引进一步，本试剂检测盒中的用于扩增寡核巧酸的上下游引物具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4的碱基对序列。用于扩增寡核巧酸的上下 游引物可组合使用，其中，SEQIDN0:1和沈QIDN0:2组合，SEQIDN0:3和沈QIDNO: 4组合；同时，SEQIDNO:1-SEQIDNO:4中的任意一种也可W与其他寡核巧酸引物组合使 用。上述上下游引物为能够用作甲型流感病毒核酸序列中核酸合成起始点的寡核巧酸，并 在DNA聚合酶的作用下对目的核酸模板片段进行扩增。用于扩增寡核巧酸的上下游引物 沈QIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和/或沈QIDNO:4的碱基对序列如下：
[0026]沈QIDNO:1:CTAAAGACAAGACCAATTCTGTCA;
[0027]沈QIDNO:2:GGTCCCCATTCCCATTTA;
[0028]沈QIDNO:3:GCGGATGCCTTTTGTTGATT;
[0029]沈QIDNO:4 :ATTGCTTCAAATGAGAATGTGG。
[0030] 本发明实施例提供的甲型流感病毒巧光定量PCR检测试剂盒包括内标，该内标为 含RNA序列的慢病毒颗粒，且所述内标所对应的cDNA具有SEQIDNO: 10的碱基对序列。 内标参与样品的处理和PCR检测过程，消除假阴性的产生，是整个实验过程更加准确。SEQ IDNO:10 的碱基对序列为：TAGATAGACCGACGAGCCGAACCACAGCGTCACAACATTTGTGTTGTAAGTGT AATAATCAACTTCAGCTAGTAGTAGAAACCTCGCAAGACGGATTGCGAGCCTTACAGCAGCTGTTTATGGACACACT ATCCTTTGTGTGTCCGTGGTGTGTTT〇
[0031] 进一步，本发明实施例提供的试剂检测盒中还包括用于检测内标的探针，所 述检测内标的探针具有SEQIDNO:9的碱基对序列。检测内标的探针SEQIDNO: 9两端分别标记为肥X和B册1，且检测内标探针SEQIDNO:9的碱基对序列为： CAAGACGGATTGCGAGCCTTACAGC〇
[0032] 更进一步，本发明实施例提供的试剂检测盒中还包括用于扩增内标的上下游引 物；所述上下游引物具有SEQIDN0:5和SEQIDN0:6的碱基对序列。该上下游引物SEQ IDNO:5和SEQIDNO:6的碱基对序列为：
[0033]沈QIDNO:5:CCGACGAGCCGAACCACA;
[0034]沈QIDNO:6:CACACCACGGACACACAAAGGA。
[003引本发明实施例提供的试剂检测盒中还包括PCR缓冲液、DM聚合酶、dNTPs、金属阳 离子。
[0036]其中，PCR缓冲液为5 X PCR缓冲液，所述5 X PCR缓冲液包括抑为8. 2且浓度为 0. 25mol/L的N，N-二径乙基甘氨酸/氨氧化钟；浓度为575mmol/L的乙酸钟和体积比为 40 %的甘油