鸭短喙长舌综合征纳米pcr检测试剂盒及其检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸭短喙长舌综合征的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 2014年11月份以来，我国江苏、安徽、山东、江西、河南、河北等省份，商品肉鸭群 发生了不明原因的以雏鸭发育迟缓，上下喙萎缩，舌头外伸、肿胀、向下弯曲为特征的疾病。 根据其临床表现，该病暂定名为"鸭短喙长舌综合征"。该病的发病率为10-30%，严重时可 达50%以上，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。目前已证实，该病的病原为新型鸭源细 小病毒，也称为鸭短喙长舌综合征病毒。
[0003] 鸭短喙长舌综合征的检测方法主要包括病毒分离、聚合酶链式反应（PCR)等，这些 方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏性高、重复性好 等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复杂体系的扩增会 出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻找可以提高PCR 特异性和效率的添加剂显得极其重要。
[0004] 纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为lnm~100nm的固相纳 米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加 了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的 停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增 产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征的纳米PCR检测手 段。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米 PCR试剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征。
[0006] 本发明所采取的技术方案是：一种用于鸭短喙长舌综合征检测的纳米PCR试剂 盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚：氯仿：异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水，其特征在 于所述试剂盒还包括2XNan〇PCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQ IDNo. 1所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo. 2所示。
[0007] 引物是根据GenBank公布的鸭短喙长舌综合征病毒序列，在其Rep与VP1基因保 守序列区域设计的一对特异性引物。
[0008] 优选的，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture组 成。
[0009] 优选的，所述试剂盒还包括DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸钠，饱和酚：氯仿 :异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
[0010] 优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0011] 其中，阳性对照可为将鸭短喙长舌综合征病毒接种9-11日龄鸭胚后，收集96~ 144小时感染鸭胚的尿囊液。
[0012] 本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有鸭短喙长舌综合 征病毒的产品中的应用。
[0013] 应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有鸭短喙长舌综合征病毒的方法，包括如 下步骤： 1、病毒DNA的提取 取300yL经过预处理的待测样品置于1.5mL离心管中，加入10mg/ml蛋白酶K10μL，裂解液300μL，50°C孵育2h后加入610μLtris饱和酚，充分震荡5min，12000rpm 离心10min;将上清转移至新1. 5mL离心管中加等体积酸：氯仿：异戊醇（1 :24 :25)，充分 混勾12000rpm离心10min;取上清，加酸：氯仿：异戊醇重复抽提一次；抽提后将上清转移 至新1. 5mL离心管中，加入2倍体积冰浴后无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠，-20°C沉 淀45min后12000rpm离心10min，弃上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL无菌蒸馏水 溶解沉淀，-20 °C贮存备用。
[0014] 待测样品可为鸭脾脏、肝脏等组织。其中，待测样品预处理的方法为：将待测样品 剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000~5000rpm离心5~10 min后取上清，之后再进行DNA的提取。
[0015] 2、纳米PCR反应 在反应管中加入10yL2XNanoPCR Mix、lyL上述DNA溶液、0.5yL1〇μΜ的上游引 物（SEQIDNo.1)、0. 5yL1〇μΜ的下游引物（SEQIDNo.2)，最后加入无核酸酶水至总体 积为20μL。
[0016] 混匀后按如下反应程序进行：94°C3min，l个循环；94°C 10s，55°C 40 s，72°C 20 s，共30个循环；72°C 5min1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩 增产物，若出现659 bp大小的条带则待测样品含有鸭短喙长舌综合征病毒。
[0017] 本发明提供了一对检测鸭短喙长舌综合征病毒的特异性引物，利用其制成的纳米 PCR试剂盒，能够快速、特异的检测鸭短喙长舌综合征病毒。本发明可使PCR反应更快地达 到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时 间，大大提高了鸭短喙长舌综合征的检测效率，并有效提高了鸭短喙长舌综合征病毒的特 异性扩增产量，减少了非特异性扩增，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为鸭短喙长舌综合征纳米PCR检测结果； M:DL2000Marker ;1:阳性对照；2:阴性对照； 图2为鸭短喙长舌综合征纳米PCR敏感性检测结果； M: DL2000 Marker ;1~6依次为10°~105倍比稀释病毒核酸的扩增产物；7:阴性对 昭. ， 图3为鸭短喙长舌综合征纳米PCR特异性检测结果。
[0019] M:DL2000 Marker ;1:鸭短U彖长舌综合征病毒；2:鸭痕病毒；3:鸭肝炎病毒；4: 新城疫病毒；5 :禽流感病毒；6 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0020] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所 给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021] 实施例1一种检测鸭短喙长舌综合征的纳米PCR试剂盒最佳实施例 本实施例试剂盒包括：（1)鸭短喙长舌综合征DNA提取试剂：蛋白酶K，裂解液，醋酸 钠，饱和酚：氯仿：异戊醇，无水乙醇，无菌蒸馏水。
[0022](2)纳米PCR反应试剂：2XNanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4)其他：阳 性对照和无核酸酶水。其中，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNan