用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002]辣椒斑驳病毒(/tefloerPepMoV)是辣椒上一种危害严重的病毒病，PepMoV是一种(+ )单链RNA病毒，是马铃薯Y病毒属QPotyvirus),马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的确定种。该病毒通过蚊虫以非持久性传播，主要侵染包括辣椒、西红柿等重要茄科作物。PepMoV的田间症状主要表现为植株矮缩，叶片花叶、斑点、萎缩，果实畸形，造成减产，以及更为严重的是造成果实的商品性降低，从而带来巨大的经济损失。该病毒最先在美国报道，随后在韩国、墨西哥、日本等地相继有危害的报道，对当地的茄科作物的生产造成严重影响。2011年在我国台湾省报道有该病毒病的发生，而我国内陆尚无P印MoV发生危害的报道。2015年湖南省植物保护研究所从湖南和福建等省采集的辣椒上检测到该病毒，为进一步了解该病毒的分布情况及其危害范围，建立一套快速检测辣椒斑驳病毒的方法刻不容缓。
[0003]目前针对P印MoV的检测方法主要有电镜观察法，RT-PCR和qRT_PCR法，但这些方法都需要繁琐的操作和昂贵的仪器，同时检测过程需要长时间的扩增过程，以及繁琐的电泳紫外观察过程。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可特异性检测检测辣椒斑驳病毒的检测试剂盒，还提供了该检测试剂盒的应用方法，该应用方法可应用于辣椒斑驳病毒的快速诊断和鉴别，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。
[0005]为解决上述技术问题，提供了一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物，包括外引物和内引物，所述外弓I物包括外引物F3和外引物B3，所述外引物F3的DNA序列为SEQ IDN0.1所述的DNA序列，所述外引物B3的DNA序列为SEQ ID N0.2所述的DNA序列；所述内引物包括内引物FIP和内引物BIP，所述内引物FIP的DNA序列为SEQ ID N0.3所述的DNA序列，所述内引物BIP的DNA序列为SEQ ID N0.4所述的DNA序列。
[0006]上述的引物组合物，优选的，所述外引物F3的浓度为5 μΜ?10 μM ;进一步优选为ΙΟμΜ。所述外引物Β3的浓度为5μΜ?ΙΟμΜ ;进一步优选为10 μ Μ。
[0007]上述的引物组合物，优选的，所述内引物FIP的浓度为20 μ M?40 μ M ;进一步有选为40 μ Μ。所述内引物BIP的浓度为20 μΜ?40 μΜ;进一步有选为40 μ Μ。
[0008]作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述引物组合物作为LAMP检测的引物检测辣椒斑驳病毒中的应用。
[0009]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，优选的，所述试剂盒包括上述引物组合物，还包括DNA聚合酶。进一步优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
[0010]上述的试剂盒，优选的，所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、外引物BIP、DNA聚合酶、cDNA 的体积比为:0.5: 0.5:1:1:1: 2。
[0011]上述的试剂盒，优选的，所述检测试剂盒还包括RM反应缓冲液和DEPC水。
[0012]作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的检测试剂盒在检测辣椒斑驳病毒中应用。
[0013]上述的检测试剂盒，优选的，所述应用方法为:
(O提取待测样品的总RNA，并反转录为CDNA ;
(2)以步骤(I)中的cDNA为模板，采用所述的检测试剂盒进行LAMP反应得到扩增产物；
(3)将所述步骤(2)中得到的扩增产物按照以下A、B中的一种或两种方法进行检测: A JpASYBR Green I显色；如果变成绿色，则证明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果颜色为橙色，则证明待测样品中不含辣椒斑驳病毒；
B:取扩增产物于进行电泳检测，如果电泳结果显示梯状条带，表明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果不显示梯状条带，则待测样品中不含有辣椒斑驳病毒。
[0014]上述的应用，优选的，所述步骤(2)中所述LAMP反应的温度为60°C?64°C。
[0015]上述的应用，优选的，所述步骤(2)中所述LAMP反应的反应时间为45 min?120
mino
[0016]上述的应用，优选的，所述步骤(3)中所述电泳检测为0.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0017]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明提供了一种可用于检测辣椒斑驳病毒的引物，该引物根据辣椒斑驳病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域4180?4378bp，利用LN832375上的对应区域通过在线引物设计软件 primerExplorer V4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物。本发明的引物3’端或5’端稳定性高，及引物二聚体等参数优于其他引物。
[0018](2)本发明提供了一种可用于检测辣椒斑驳病毒的检测试剂盒，可快速检测辣椒斑驳病毒，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。
[0019](3)本发明提供了一种采用检测试剂盒检测辣椒斑驳病毒的应用方法，采用环介导等恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplicat1n, LAMP)进行检测，检测方法快速简便，灵敏度高。LAMP技术是近年来开发的一种新型的DNA扩增技术，该方法不需要如qRT-PCR的复杂操作和昂贵的实时定量PCR仪器，也不需要如RT-PCR长时间的扩增过程以及繁琐的电泳紫外观察过程。LAMP方法从采样到得出结果的全过程仅需lh，并且灵敏度远高于传统的检测方法；更重要的是，可用目测比色直接判断反应结果。LAMP技术在恒温下即可直接进行基因扩增反应，不需要长时间的温度循环；且扩增反应特异性高、效率尚O
【附图说明】
[0020]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0021]图1为采用荧光染料检测实施例2中的扩增产物中是否含有PepMoV的检测结果图。
[0022]图2为采用实施例2中RT-LAMP方法检测P印MoV的效果图，图中，I为0.147 μ g/μ I ；2 为 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 为 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 为 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 为 0.147X10 Vg/μ I ;6 为 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 为 0.147X10 Vg/ μ I ;8 为0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 为 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 为阴性对照。
[0023]图3为采用对比例I中RT-PCR方法检测P印MoV的效果图，图中，I为0.147 μ g/μ I ；2 为 0.147 X 10 1 μ g/ μ I ;3 为 0.147 X 10 2 μ g/ μ I ;4 为 0.147 X 10 3 μ g/ μ I ;5 为 0.147X10 Vg/μ I ;6 为 0.147 X 10 5 μ g/μ I ;7 为 0.147X10 Vg/ μ I ;8 为0.147X 10 7 μ g/μ I ;9 为 0.147X10 Vg/μ I cDNA ;10 为阴性对照。
[0024]图4为不同反应温度条件对RT-LAMP反应效果的电泳图，图中M为标准分子量；1为 60°C ；2 为 61 °C ；3 为 62°C ；4 为 63°C ；5 为 64°C ；6 为 65°C ；7 为 66°C ；8 为阴性对照。
[0025]图5为不同反应时间条件对RT-LAMP反应效果的电泳图，图中M为标准分子量；1为 30min ；2 为 45min ；3 为 60min ；4 为 75min ；5 为 90min ；6 为 120min。
【具体实施方式】
[0026]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
[0027]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0028]实施例1
根据辣椒斑驳病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域4180?4378bp，利用LN832375上的对应区域通过在线引物设计软件primerExplorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)设计引物，通过比对引物相应的3’端或5’端稳定性及引物二聚体等参数，最终选取一组最合适的引物，具体为外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP。
[0029]其中，外引物F3的DNA序列为SEQ ID N0.1所述的DNA序列，具体为:CTTCAATGGCATTTAGAAGCT。
[0030]外引物B3的DNA序列为SEQ ID N0.2所述的DNA序列，具体为:CCGTATTGGATCATGTCACAA。
[0031 ] 内引物FIP的DNA序列为SEQ ID N0.3所述的DNA序列，具体为:GTGAACTCCACCTCTCTGCC-ACACTAATTGTAAGGTTTTGAAGG。
[0032]内引物BIP的DNA序列为SEQ ID N0.4所述的DNA序列，具体为:ACACAATTCCCAGTGAAATTAGTGG-TTGCTACCTGTGCCTTGA。
[0033]实施例2:
一种检测试剂盒，包括:
外引物F3 (浓度ΙΟμΜ):0.5μ1 ;
外引物Β3 (浓度ΙΟμΜ):0.5μ1 ; 内引物FIP (浓度40μΜ):1 μ I ;
内引物BIP (浓度40μΜ):1 μ I ;
2 X RM反应缓冲液:12.5 μι ；
Bst DNA 聚合酶:1 μ I。
[0034]补充DEPC 水至:25 μ I。
[0035]一种本实施例中检测试剂盒的应用方法，具体包括以下步骤:
Cl)提取植株总RNA:从福建、湖南等地采集病株，运用RT-PCR筛选出的辣椒斑驳病毒样品，参照TRIzo1-A+ Reagents (TIANGEN)使用说明，提取辣椒斑驳病毒样品中的总RNA，参照 Hiscript?II 1st strand cDNA synthesis Kit (Vazyme)使用说明，使用 Randomhexamers将总RNA反转录成cDNA。
[0036]