r>[0048] 发明效果
[0049] 根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢 盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
【附图说明】
[0050] 图1为100ng起始量的传统的RRBS建库流程文库RRCS140069-1-52检测结果。
[0051] 图2为100ng起始量的本发明的RRBS建库流程文库RRCS140071-1-55检测结果。
[0052] 发明的【具体实施方式】
[0053] 首先，在一个方面中，本发明提供一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构 建方法（本发明的方法），该方法包括：
[0054] 步骤A:用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；
[0055] 步骤B:将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其 中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中 dCTP:dGTP:dATP的摩尔比为1:1:5~1:1:20，且该混合物中不包含dTTP;
[0056] 步骤C:将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片 段；
[0057]步骤D :将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢 盐处理产物；
[0058] 步骤E:所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0059] 步骤F:将所述PCR扩增产物进行片段筛选。
[0060] 在本发明的方法中，所述步骤A中的基因组DNA(gDNA)的量可以为50-500ng。而 且，基因组DNA可以来自于低质量样本，这里低质量样本是指其中的基因组DNA已经发生了 相当程度的降解的样本，例如石蜡包埋样本（FFPE)。
[0061] 本发明人经过深入研究发现，传统的RRBS建库方法不适用于低质量样本的原因 主要有以下两点：
[0062] 1.传统的RRBS建库中，末端修复采用dNTPs(dCTP、dGTP、dTTP与dATP的混合物） 提供单核苷酸，而降解后的样本gDNA中存在许多降解本身产生的片段，这些片段能够像酶 切片段一样被修复补平，从而作为待测序片段进入到最终的文库中。在非CG岛区域，降解 后的片段通常不含CG位点，因而这降低了测序数据的利用率，造成数据浪费；
[0063] 2.传统的RRBS建库中，纯化环节较多，而每次纯化均有损失；同时传统的RRBS建 库中片段筛选得到的产物量极低，约在l〇ng左右，在胶回收过程中极其容易丢失，导致建 库失败的风险。
[0064] 针对上述问题点，本发明人对传统的RRBS建库方法进行了如下改进：
[0065] 1.对于传统的RRBS建库中dNTP容易引物降解片段末端补平，采用dCTP和dGTP 两种底物进行末端修复，因为MspI酶切后产生的粘性末端为CG两个碱基，dCTP和dGTP补 平酶切产生的末端不平，能够降低降解片段的补平比例。
[0066] 2.对于传统的RRBS建库中纯化步骤较多的问题，采用末端修复和加"A"反应合并 进行的策略。同时，为了避免加"A"反应中末端加入过多的C和G，使用dCTP:dGTP:dATP 为适当摩尔比的混合物（无dTTP)进行末端修复和加"A"合并反应，以此省去末端修复后 的纯化过程；同时也可对加"A"后的反应产物不做纯化处理，直接进行加"甲基化接头"的 连接反应。此外，采用先PCR扩增再片段筛选的策略，降低建库失败的风险。
[0067] 3.此外，由于本发明的方法中省略了多个纯化步骤，可能会导致甲基化接头连接 效率低。本发明的方法中采用适度延长连接反应时间的方法来提高连接效率。
[0068] 所述步骤B中的所述混合物中，dCTP:dGTP:dATP的摩尔比优选1:1:9~1:1:11， 更优选为1:1:10。该摩尔比对本发明的方法而言是至关重要的。所述步骤B中采用包含所 述前一步的酶切产物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应 体系，进行末端修复及3'端加A，这意味着步骤B的反应体系中不包含dTTP。除了使用所 述混合物代替dNTP之外，该反应体系可以包含传统RRBS建库方法中用于末端修复和3'端 加A的那些试剂。
[0069] 所述步骤B的反应条件可以为30~50°C，0. 5~12小时。
[0070] 所述步骤C中可以采用包含所述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化 接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化接头，该反应体系可以与传统RRBS建库 方法中用于加甲基化接头的反应体系相同。但，反应条件需适当优化，以使连接反应进行得 更加充分，例如可以为10~30°C(优选20°C)、0. 5~5小时。
[0071] 步骤D、步骤E和步骤F均可以采用传统RRBS建库中用于该步骤的方法或试剂来 进行。需要说明的是，传统的RRBS建库中依次进行片段筛选、重亚硫酸氢盐处理和PCR扩 增。
[0072] 优选地，本发明的方法中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、和/ 或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。所述纯化步骤可以采用传统RRBS建库 中用于该产物的纯化的方法、试剂或装置来进行。
[0073] 在另一个方面中，本发明还提供一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文 库的试剂盒（本发明的试剂盒），其可用于实施本发明的方法。
[0074] 本发明的试剂盒必须包含用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括 dCTP、dGTP与dATP的混合物，该混合物中dCTP:dGTP:dATP的摩尔比为1:1:10~1:1:20、 优选1:1:9~1:1:11、更优选1:1:10,且该混合物中不包含dTTP。
[0075] 优选地，本发明的试剂盒还可以包括选自下组中的至少一种或全部：
[0076] 用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂，例如MspI酶及相应 的酶切反应缓冲液等；
[0077] 用于所述3'端加A的试剂，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应的反应缓 冲液等，可以与所述的用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂相同；
[0078] 用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂，例如甲基化接头、T4DNA 连接酶及相应的连接反应缓冲液；
[0079] 用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂，例如EZDNA Methylation-GoldKit(Zymo公司产品）等；
[0080] 用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂，例如ΚΑΡΑHiFiHotStart Uracil+ReadyMix、Ann公共引物、Index引物等；
[0081] 用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂，例如QIA-quickGelExtraction Kit(Qiagen公司产品）等。
[0082] 除了采用所述混合物代替dNTPs以外，本发明的试剂盒中所包含的试剂、装置等 可以与用于传统的RRBS建库方法的试剂盒中包含的那些相同。 实施例
[0083] 以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是 用于解释本发明，而非用于限定本发明。
[0084] 以石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，分别采用传统的RRBS建库流程和 本发明的RRBS建库流程构建文库，文库构建、文库质控和信息分析结果如下。
[0085] 7. 1文库构建
[0086] 以同一份石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，构建的两个RRBS文库的相 关参数如下表：
[0087]
[0088] 7· 1. 1传统的RRBS建库流程
[0089] (l)MspI酶切：100ng起始量建库，按照下表反应体系进行酶切，37°C酶切6小时；
[0090]
[0091]酶切产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，75. 0μLEB洗脱。
[0092] (2)末端修复和加A:按照下表反应体系进行末端修复，条件20°C反应30分钟；
[0095] 产物过膜纯化，32. 0μLEB洗脱。
[0096] (3)加"甲基化接头"反应：按照下表反应体系进行加接头反应，条件20°C反应15 分钟；
[0097]
[0098]加接头反应产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，30. 0μLEB洗 脱。
[0099] (4)片段筛选：2 %琼脂糖凝胶电泳回收150~325bp文库，QIA-quickGel ExtractionKit进行胶纯化回收，20μLddH20洗脱。
[0100] (5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMeth