一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码 基因和应用。
【背景技术】
[0002] a-淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)可水解高分子淀粉为低分子寡糖，在生物能源、饲料、食 品等工业具有广泛的应用价值。天然淀粉的酶法利用工艺的第一步往往是在高温下将淀粉 糊化，在此过程中添加a-淀粉酶，因而市场对耐高温的a-淀粉酶需求旺盛。然而从自然 环境中筛选获得的野生型淀粉酶往往不能完全适应工业应用过程中苛刻的外部环境。发 明人从深海热泉耐热细菌Bacillussp.SCSIO15121中克隆到一条新的a-淀粉酶基因 amyl21 (KJ577547)，重组酶AMY121最适作用温度为75°C，但在不添加钙离子时75°C半衰期 仅为7min，有必要提尚其热稳定性。
[0003] 蛋白质工程技术（包括定向进化、理性设计、半理性设计）可改变生物催化剂的稳 定性、对映体选择性及底物特异性，使突变酶更能适应应用需求。半理性设计参考结构信 息，确定几个潜在热点氨基酸残基构建小而有效的突变体库，从中筛选到目标突变体。半理 性设计结合了理性设计和定向进化的优势，在蛋白质工程改造方面应用广泛。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中a-淀粉酶AMY121热稳定性差的不足，提供了一类热稳定 性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和应用。
[0005] 本发明的淀粉酶突变体，其特征在于，其为淀粉酶突变体Y187E、K205L或Y187E/ K205L；
[0006] 所述的淀粉酶突变体Y187E，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示；
[0007] 所述的淀粉酶突变体K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO. 3所示；
[0008] 所述的淀粉酶突变体Y187E/K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供上述淀粉酶突变体的编码基因。
[0010] 所述的编码基因，当为淀粉酶突变体Y187E时，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0011] 所述的编码基因，当为淀粉酶突变体K205L时，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO. 6所示。
[0012] 所述的编码基因，当为淀粉酶突变体Y187E/K205L时，其编码基因的核苷酸序列 如SEQIDN0. 7 所示。
[0013] 含有上述淀粉酶突变体的编码基因的表达载体。
[0014] 含有上述表达载体的重组菌。
[0015] 本发明的第三个目的是提供上述淀粉酶突变体在水解淀粉中的应用。尤其是在高 温条件下水解淀粉中的应用。
[0016] 本发明由深海热泉细菌Bacillussp.SCSIO15121a-淀粉酶amy121基因出发， 鉴定了一个与热稳定性相关的氨基酸残基，以其为中心，对周边残基的编码基因进行半理 性设计而引入突变，将突变的基因序列连接表达载体转化表达宿主菌，发酵培养并对表达 的淀粉酶突变体进行提取、筛选，从而得到热稳定性提高的淀粉酶突变体。
[0017] 本发明制备得到的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L与野生型淀粉酶 八1^121相比，最适作用温度〇'__)、75°(：下的半衰期匕/批75°(：)、半失活温度〇' 5。15)都 获得提高，具有更优良的热稳定性。热稳定性提高的淀粉酶突变体扩展了深海热泉细菌淀 粉酶AMY121的应用范围，使其可应用于生物能源、食品、日化添加剂、饲料工业生产和生活 垃圾处理等领域。
【附图说明】
[0018] 图1为温度对Lys209残基替换淀粉酶突变体活性的影响。
[0019]图2为Lys209残基替换淀粉酶突变体T5。15值的测定结果。
[0020] 图3为淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的最适作用温度。
[0021] 图4为淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的T5。15值的测定结果。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0023] 下述实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((MolecularCloning:ALaboratoryManual〉〉（Sambrook,J.RussellDsvidff.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual, 3rdedition, 2001，NY,ColdSpringHarbor)。所用引物均 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0024] 实施例1
[0025] 在深海热泉耐热细菌Bacillussp.SCSI0 15121中a-淀粉酶AMY121的第208 位和第209位氨基酸残基之间插入两个氨基酸后，其热稳定性显著下降。通过同源建模发 现两个氨基酸的插入使Lys209的构象发生明显变化。所述的a-淀粉酶AMY121的氨基 酸序列如SEQIDNO. 1所示，其编码基因一a-淀粉酶基因amy121的核苷酸序列已经存入 Genbank中，其登录号为KJ577547。
[0026] 1与热稳定性相关的氨基酸残基Lys209的鉴定
[0027] 1. 1反向PCR介导的a-淀粉酶AMY121的第209位Lys定点突变
[0028] 为了进一步研究与a-淀粉酶AMY121热稳定性相关的氨基酸残基Lys209,由深海 热泉细菌Bacillussp.SCSIO15121a-淀粉酶amyl21基因（KJ577547)出发，设计a-淀 粉酶AMY121的209位Lys定点饱和突变的引物，利用反向PCR介导定点突变，其引物设计 如下：
[0029]K209W-F 5' -TATAAGTTTCAAGGATGGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0030]K209P-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACCGGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0031] K209I-F5' -TATAAGTTTCAAGGAATTGCATGGGATTGGGAA-3r ,
[0032]K209V-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGTGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0033]K209F-F5' -TATAAGTTTCAAGGATTTGCATGGGATTGGGAA-3r ,
[0034]K209L-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACTGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0035]K209E-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGAAGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0036]K209S-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAAGCGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0037]K209M-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAATGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0038]K209Y-F 5' -TATAAGTTTCAAGGATATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0039]K209N-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAAATGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0040]K209D-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0041]K209Q-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACAGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0042]K209G-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGGCGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0043]K209H-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0044]K209A-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGCGGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0045] K209R-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACGTGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0046]K209T-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAACCGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0047]K209C-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACGCGCATGGGATTGGGAA-3';
[0048] 以上为正向引物。209位的Lys定点饱和突变的反向引物可以共用，引物如下：
[0049]K209-allR5' -TCCTTGAAACTTATAGATGCGGTTCAGCT-3'。
[0050] 以实验室前期构建的淀粉酶AMY121表达载体pET28a_amyl21(将a-淀粉酶 amyl21基因插入表达载体pET28a的酶切位点Ncol和Xhol之间）为模板，利用上述正反 向引物进行反向PCR反应，PCR扩增使用的DNA聚合酶为北京全式金生物技术有限公司的 FastPfumix;反应程序为：95°C5min;95°C30sec，55°C30sec，72°C3min，共 30 个循环； 72°C10min。反应结束后，用DpnI消化甲基化模板，纯化PCR产物后与大肠杆菌表达载 pET28a连接，然后转化至大肠杆菌XLl-Blue中，将转化后的大肠杆菌涂布于50yg/ml卡 那霉素的LB抗性平板上，37°C培养12小时。用灭菌PBS缓冲液将不少于1000个克隆的转 化子重悬并收集菌体，提取质粒后转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，于50yg/ml卡那霉素的 LB抗性平板上，37°C培养12小时，平板上生长的菌落即为a-淀粉酶AMY121的Lys209残 基替换的突变酶转化子。1. 2a-淀粉酶AMY121的Lys209残基替换突变酶的纯化和分析
[0051] 1. 2. 1突变酶的分离纯化
[0052] 将上述突变