酶转化子接种于含50yg/ml卡那霉素LB液体培养基，37°C，200rpm 摇床培养24小时，从培养后的菌液中吸取lmL菌液，加入到100mL新鲜LB液体培养基（含 50ug/mL卡纳霉素）的250mL三角瓶中；37°C，200rpm摇床中剧烈振荡培养2~3h，检测 0D值，当0D600达到0. 6时，加入IPTG至终浓度为0.lmmol/L，在28°C，180rpm摇床中继 续振荡培养约12h。将诱导好的菌液于4°C，6000rpm条件下离心10min，收集菌体；将收集 的菌体用50mMTris-HCl(pH7. 5)缓冲液重悬，用超声波进行细胞破碎。超声波工作条件 为：功率30%，工作5s暂停5s，破碎时间为30min;在4°C，12000rpm下离心10min，收集上 清溶液，即为粗酶液可用于镍柱纯化。纯化过程：5mL蒸馏水冲洗镍柱一5mLBinding缓冲 液（5mmol/L咪唑，50mMpH8. 5的Tris-HCl缓冲液）平衡一加入过滤好的粗酶液一20mL Bindingbuffer(5mmol/L咪唑，50mMpH8. 5 的Tris-HCl缓冲液）冲洗层析柱一100 ~ 200mLWashingbuffer(20mmol/L咪唑，50mMpH8. 5 的Tris-HCl缓冲液）冲洗层析柱 -lOmLElutionbuffer(500mmol/L咪唑，50mMpH8. 5Tris_HCl缓冲液）洗脱，收集洗脱 液进行SDS-PAGE检测纯化效果，由此得到纯化的突变酶液。
[0053] 1. 2. 2半失活温度T5。15的测定
[0054] 将稀释的突变酶液（以依照相同方法得到的纯化的野生型淀粉酶AMY121酶液为 对照）100yL放置于1. 5mL的EP管中，置于水浴锅中，精确控温加热15min，然后在4°C冷 却20min，室温平衡15min。经过热处理的酶液通过离心去除沉淀，吸取上清液用DNS法测 定残余活性，未经过热处理的酶液活性定义为100%。利用残余活性对温度作图，如图1所 示；并利用GraphPadPrism5软件中的Sigmoidalboltzmannfit进行拟合，拟合拐点即 为T5。15,如图2所示。
[0055] 结果表明，将209位Lys突变成其他19个氨基酸后，发现19个突变体的热稳定性 都较野生酶差。确定Lys209参与AMY121蛋白质结构的稳定，与淀粉酶的热稳定性相关。
[0056] 2 a-淀粉酶AMY121突变体库的建立、筛选及鉴定
[0057] 2. 1饱和突变体文库的构建
[0058] 以实验室前期构建的淀粉酶AMY121大肠杆菌重组表达质粒pET28a-AMY121作为 模板，选择AMY121的209位周边半径4A范围内的第187位酪氨酸（Tyrl87)、第205位赖 氨酸（Lys205)、第206位苯丙氨酸（Phe206)和第231位天冬氨酸（Asp231)相对应的核苷 酸出利用NNN代替原有密码子，设计简并引物，构建对应4个位点的随机饱和突变文库，弓丨 物设计如下：
[0059]Y187-F 5' -TTCAAATGGCATTGGNNNCATTTTGACGGAACC-3，，
[0060]Y187-R5' -CCAATGCCATTTGAAATCGCTGTATGTG-3r ；
[0061] K205-F 5' -CTGAACCGCATCTATNNNTTTCAAGGAAAGGCA-3，，
[0062] K205-R5' -TAGATGCGGTTCAGCTTTCGGGACTC-3r ；
[0063]F206-F 5， -AACCGCATCTATAAGNNNCAAGGAAAGGCATGG-3'，
[0064]F206-R 5' -CTTATAGATGCGGTTCAGCTTTCGGGA-3';
[0065]D231-F5' -ATGTATGCCGACATCNNNTATGATCATCCTGAT-3r ,
[0066]D231-R 5' -GATGTCGGCATACATCAAGTAATCATAGTT-3'。
[0067] 以AMY121表达载体pET28a_AMY121为模板，分别利用上述正反向引物对进行反向 PCR扩增，构建4个定点饱和突变扩增产物；PCR扩增使用的DNA聚合酶为北京全式金生物 技术有限公司的FastPfumix，反应程序为：95°C5min;95°C30sec，55°C30sec，72°C3min， 共30个循环；72°ClOmin。反应结束后，用DpnI消化甲基化模板，纯化PCR产物后与大肠 杆菌表达载体pET28a连接，然后转化至大肠杆菌XLl-Blue中，将转化后的大肠杆菌涂布于 50yg/ml卡那霉素的LB抗性平板上，37°C培养12小时。用灭菌PBS缓冲液将不少于1000 个克隆的转化子重悬并收集菌体，提取质粒后转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，于50yg/ml 卡那霉素的LB抗性平板上，37°C培养12小时，平板上生长的菌落即为针对Lys209相邻四 个氨基酸的饱和突变体文库。
[0068] 2. 2从突变体文库中筛选热稳定性突变体
[0069] 将本实施例2. 1中产生的菌落接种于含0.ImMIPTG和50yg/ml卡那霉素LB液 体培养基的96孔板中，28°C，100r/min摇床培养24小时。加入细胞裂解液，37°C温浴10分 钟即得粗酶液。粗酶液于90°C温浴10分钟后测定每孔的残余活力。从四个突变体库中筛 选比野生酶残余活力高的突变体，扩大体系发酵，纯化突变酶，并测定其T5。15, 75°C下的半 衰期，最适作用温度；突变酶的分离纯化方法和半失活温度T5。15的测定方法参照本实施例 1. 2. 1和1. 2. 2。确认热稳定性改善后对突变子进行测序，经测序确认得到两个热稳定性 提高的突变体，分别为淀粉酶突变体Y187E和K205L;其中，淀粉酶突变体Y187E的氨基酸 序列如SEQIDNO. 2所示（其是a-淀粉酶AMY121的第187位由络氨酸Tyr突变为谷氨 酸Glu)，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示；淀粉酶突变体K205L的氨基酸序 列如SEQIDNO. 3所示（其是a-淀粉酶AMY121的第205位由赖氨酸Lys突变为亮氨酸 Leu)，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.6所示。采用同上所述方法，构建联合突变体 Y187E/K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示（其是a-淀粉酶AMY121的第187位由 络氨酸Tyr突变为谷氨酸Glu，第205位由赖氨酸Lys突变为亮氨酸Leu)，其编码基因的核 苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。
[0070] 与野生型淀粉酶AMY121相比，本发明的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/ K205L具有更优良的热稳定性（图3、图4)，主要体现在其最适作用温度下的 半衰期（t1/2at75°C)、半失活温度（T5。15)都获得提高，如表1所示。
[0071] 表1淀粉酶突变体热稳定性检测结果
[0072]
[0073] 表中结果说明，与野生型淀粉酶AMY121相比，淀粉酶突变体Y187E、K205L和 Y187E/K205L的最适作用温度提高到了 80°C，提高了 5°C;淀粉酶突变体K205L和Y187E/ K205L的75°C下的半衰期由野生型淀粉酶AMY121的7. 04分钟分别延长到了 31. 08和26. 16 分钟，半失活温度提高到了 79°C以上。由此表明，本发明的淀粉酶突变体Y187E、K205L和 Y187E/K205L的热稳定性大大提高，扩展了深海热泉细菌淀粉酶AMY121的应用范围，经改 良后的淀粉酶突变体可用于工业应用，如生物能源、食品、日化添加剂、饲料工业生产和生 活垃圾处理等领域。
【主权项】
1. 一类淀粉酶突变体，其特征在于，其为淀粉酶突变体Y187E、K205L或Y187E/K205L ; 所述的淀粉酶突变体Y187E，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述的淀粉酶突变体K205L，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 所述的淀粉酶突变体￥187￡/1(2051，其氨基酸序列如3￡〇10勵.4所示。2. -种权利要求1所述的淀粉酶突变体的编码基因。3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，当为淀粉酶突变体Y187E时，其编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。4. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，当为淀粉酶突变体K205L时，其编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。5. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，当为淀粉酶突变体Y187E/K205L时， 其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。6. -种含有权利要求2所述的淀粉酶突变体的编码基因的表达载体。7. -种含有权利要求6所述的表达载体的重组菌。8. 权利要求1所述的淀粉酶突变体在水解淀粉中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一类热稳定性提高的淀粉酶突变体及其编码基因和应用。本发明从一种深海热泉来源的细菌α-淀粉酶AMY121出发，运用定点饱和突变技术获得热稳定性提高的淀粉酶突变体；所述的深海热泉细菌α-淀粉酶AMY121具有SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸残基序列，筛选得到的淀粉酶突变体Y187E、K205L和Y187E/K205L的氨基酸序列分别如SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3和SEQ？ID？NO.4所示。以各自的最适作用温度，T5015及75℃下的半衰期t1/2为衡量标准，相较于野生型淀粉酶，淀粉酶突变体的热稳定性得到提高；扩展了深海热泉细菌淀粉酶AMY121的应用范围。
【IPC分类】C12N9/28, C12N15/56
【公开号】CN105062991
【申请号】CN201510446883
【发明人】龙丽娟, 杨键, 李丽珍, 李洁, 肖运柱, 齐振雄, 尹团, 张偲
【申请人】中国科学院南海海洋研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月27日