一种羰基还原酶突变体及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶 突变体及其用途。
【背景技术】
[0002] 羰基还原酶（EC1. 1. 1. 184)，是氧化还原酶家族的一员，催化依赖于辅酶NADH或 NADPH，能够特异性催化酮（醛）、醇之间的转化。手性醇是合成手性药物的重要中间体，羰 基还原酶可以高效地催化潜手性酮的还原，是制备手性醇的重要方法之一。羰基还原酶在 制药工业、精细化工产业和信息工业中的应用十分广泛。为了进一步推动羰基还原酶在工 业中的应用范围对其现有性能提出了更高的要求，如长时间内保持活性稳定，在极端环境 中保持高的活性（极端温度或者pH值等）或者可以接受不同的底物（包括非天然底物）。 其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要，高温条件下，酶的反应速度更快，能缩短反 应周期，提高时空产率，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。
[0003] 随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性/半理性设计的 手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有 许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展（Zhao, 2007， BiotechnogyandBioengineering98 (2)，271-275)。其中易错PCR(error-pronePCR)、 DNA改组（DNAshuffling)、半理性设计等已成为酶分子改造中常用的手段，大大加速了蛋 白质的进化过程（LehmannandWyss, 2001，CurrentOpinioninBiotechnology12(4)， 371-375)〇
【发明内容】
[0004] 本发明利用易错PCR技术对来源于金黄杆菌CA49 (Chryseobacterium sp. CA49) 的羰基还原酶ChKRED20(SEQ ID NO. 2)进行分子改良，将一个或者多个氨基酸进行替换，从 而获得热稳定性提尚的突变体。
[0005] 所述羰基还原酶突变体是以SEQIDN0. 2为出发序列，将第100位的丙氨酸突变 为苏氨酸、第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸、第128位的谷氨酸突变为赖氨酸、第131位 的谷氨酸突变为甘氨酸、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸或其任意组合得到的突变体或在 此基础上增加中性突变位点得到的突变体。
[0006] 根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本 发明的保护范围。
[0007] 为了达到以上目的，本发明以易错PCR技术对母本羰基还原酶ChKRED20基因随机 突变，建立突变文库，通过高通量筛选体系筛选突变体。首轮筛选获得5个热稳定性提高的 突变体。以定点突变技术将其中2个多位点突变体进行单位点拆分，又获得2个耐热性提 高的突变体。因此，共获得5个有益突变位点，将此5个有益突变位点的两个或两个以上进 行整合，获得热稳定性提高的组合突变体。
[0008] 本发明的具体实施方法为：
[0009] (1)随机突变文库的构建和筛选：我们已经公开了从金黄杆菌CA49(Chryseobacterium sp.CA49,2012年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏，保 藏编号为NO :CCTCC M 2012484)中克隆的编码250个氨基酸残基的羰基还原酶ChKRED20 的基因序列（NCBI登录号：KC342020,基因序列见SEQ ID N0.1，氨基酸序列见SEQ ID NO. 2)。采用易错PCR方法对其进行随机突变，以pET 28a(+)载体连接PCR片段，电击转入 大肠杆菌DH10B，得到超过2 X 104个克隆的突变体库，将突变库克隆收集后提取质粒，转入 大肠杆菌表达菌株BL21-DE3,挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。而后将菌体离心，加入溶 菌酶破碎细胞，并离心，取部分上清液（粗酶液）以2-氯乙酰乙酸乙酯为底物，反应适当时 间测定酶活（对照组）。同时，另取相同体积的上清液热处理一定时间，以相同的方法测定 残余活性。将残余活性高于对照的菌株转接到新的96孔培养板中进行重复筛选。将筛选 得到的残余活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序 列信息。详细方案见实例1。
[0010] 经上述随机突变库构建和筛选，获得了 5个热稳定性提高的突变体，分别为36F7、 123D9、22E10、122F11、32B11，其特征如下：
[0011] 36F7:第100位的丙氨酸突变为苏氨酸（DNA序列由GCA变为ACA)。
[0012] 123D9:第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸（DNA序列由GAT变为GAG)。
[0013] 22E10:第128位的谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)。
[0014]122F11:第131位的谷氨酸突变为甘氨酸（DNA序列由GAA变为GGA)、第137位的 缬氨酸突变为异亮氨酸（DNA序列由GTT变为ATT)。
[0015] 32B11:第71位的谷氨酸突变为天冬氨酸（DNA序列由GAA变为GAT)、第110位的 赖氨酸突变为精氨酸（DNA序列由AAA变为AGA)、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸（DNA序 列由TCA变为CCA)。
[0016] (2)将上述2个多位点突变子拆分为单一位点突变子：
[0017] 通过定点突变将突变子122F1U32B11所包含的多位点氨基酸残基进行拆分，构 建得到单点突变子E131G、V137I、E71D、K110R、S154P，其特征如下：
[0018]E131G:第131位的谷氨酸突变为甘氨酸（DNA序列由GAA变为GGA)。
[0019]V137I:第137位的缬氨酸突变为异亮氨酸（DNA序列由GTT变为ATT)。
[0020] E71D:第71位的谷氨酸突变为天冬氨酸（DNA序列由GAA变为GAT)。
[0021 ]K110R:第110位的赖氨酸突变为精氨酸（DNA序列由AAA变为AGA)。
[0022] S154P:第154位的丝氨酸突变为脯氨酸（DNA序列由TCA变为CCA)。
[0023] 其中，E131G和S154P为耐热性提高的突变位点，V137I、E71D、K110R为中性突变 位点。
[0024] (3) 5个位点的整合：
[0025] 通过上述（1)和⑵突变筛选，获得5个有益突变位点，即36F7、123D9、22E10、 E131G和S154P，进一步通过定点突变构建位点组合突变体。优选构建以下组合突变体： MC35、MC23、MC235、MC135、MC134,其特征如下：
[0026]MC35:第128位的谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)、第154位的丝 氨酸突变为脯氨酸（DNA序列由TCA变为CCA)。
[0027]MC23:第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸（DNA序列由GAT变为GAG)、第128位的 谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)。
[0028]MC235:第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸（DNA序列由GAT变为GAG)、第128位 的谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸（DNA 序列由TCA变为CCA)。
[0029]MC135:第100位的丙氨酸突变为苏氨酸（DNA序列由GCA变为ACA)、第128位的 谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸（DNA序 列由TCA变为CCA)。
[0030]MC1345:第100位的丙氨酸突变为苏氨酸（DNA序列由GCA变为ACA)、第128位的 谷氨酸突变为赖氨酸（DNA序列由GAA变为AAA)、第131位的谷氨酸突变为甘氨酸（DNA序 列由GAA变为GGA)、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸（DNA序列由TCA变为CCA)。
[0031] 这些组合突变体MC35、MC23、MC235、MC135和MC1345热稳定性与母本相比均有 不同程度提高。MC135稳定性提升幅度最大，反应活性却未受影响，最适反应温度升高至 65°C，而且在65°C非常稳定，连续处理15天后残余活性大于95%，而野生型在此条件下的 热失活半衰期仅为12min。
[0032]以组合突变子M135为生物催化剂，转化底物4-氯乙酰乙酸乙酯，反应温度65°C， 时空产率比母本有很大程度的提高，3g/L的粗酶液可在lh内完全转化300g/L底物生成 (S)-CHBE，ee值 >99%。
[0033] 本发明有益效果：上述所有耐热性提高的突变子与母本相比，酶的反应速度更快， 能缩短反应周期，催化底物的时空效率均有提高，其中突变子M135转化底物4-氯乙酰乙酸 乙酯的时空效率高达333gAL.h)，具有良好的工业应用前景。
【附图说明】
[0034]图1为5个热稳定性提高的单点突变体与组合突变体残余活力与母本的比较，酶 的热稳定性于70°C温度下处理3小时。
[0035] 图2为母本ChKRED20与突变体MC135的最适反应温度测定图，母本ChKRED20的 最适反应温度测定曲线用〇表示，突变体MC135的最适反应温度测定曲线用鲁表示。
[0036] 图3为母本ChKRED20与组合突变体的t1/2测定图，在65°C所测的母本ChKRED20 热失活半衰期用?表示；在65°C所测的突变体MC235热失活半衰期用?表示；在65°C所测 的突变体MC1345热失活半衰期用▲表示；在65°C所测的突变体MC135热失活半衰期用鲁 表示；在80°C所测的突变体MC135热失活半衰期用〇表示。
[0037] 图4为母本ChKRED20与突变体MC135在65°C条件下转化底物4-氯乙酰乙酸乙酯 的时间曲线，母本ChKRED20和突变体MC135的反应时间曲线分别用虚线和实线表示，底物 浓度是l〇〇g/L(〇），150g/L( ? )，200g/L( ? )，and 300g/L( &□ )〇
[0038] 具体实施方法
[0039] 以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释 本发明，而非对本发明范围的限制。
[0040] 实施例1易错PCR(error-pronePCR)