一种培养戊型肝炎病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种戊型肝炎病毒毒株在体外成功培养并提高子代病毒复制效率的新方法。
【背景技术】
[0002]戊型肝炎病毒(!fepatitis E Virus，HEV)是一种经肠道传播的病毒性肝炎病原体，可以跨种间感染人和多种动物。HEV为无囊膜单股正链RNA病毒，球型病毒颗粒大小为27?34nm，表面有突起和缺刻，内部密度不均匀，基因组全长约为7.3 kb，由3个开放阅读框组成。全球HEV主要有4种基因型，在中国主要以IV型HEV毒株常见。HEV传播途径主要经粪-口途径，也可通过其他途径传播，包括血液传播，接触传播，垂直传播，以及器官移植进行传播。
[0003]HEV是导致许多发展中国家戊型肝炎暴发性流行的病原体，HEV感染后，一般患者在4-6周内自愈，免疫缺陷病人及老年人易发展成为慢性肝炎。据世界卫生组织估计，全球每年大约有2010万人感染HEV，造成70万人死亡和3000胎儿宫内死亡，感染HEV的非孕妇和孕妇患者死亡率分别为1.9%和19.8%孕妇感染HEV，发病率高，病情严重，尤其以妊娠晚期最为严重，病死率可高达25%，常发生胎儿早产，流产，死胎及孕妇产后急性肝坏死等症状。戊型肝炎的防控形势已经迫在眉睫，发展有效的戊型肝炎疫苗已成为关系公众健康的急为紧迫的问题，而在这一过程中病毒培养至关重要。
[0004]病毒培养是研究病毒生物学特性，致病机理及疫苗研制的基础。自1983年首次电镜下观察到HEV病毒颗粒，距今已经超过30年，一直以来，大量涉及HEV的研究，病毒的体外培养一直是研究的热点和难点之一，这也就严重阻碍了病毒在细胞中复制机制的研究，进而阻滞了 HEV疫苗的研发。直到2007年Tanaka等，尝试用21种细胞系培养HEV，HEV在A549和PLC/PRF/5细胞中增殖较快且易于被检测，2011年Okamoto和Tanaka等，进一步利用A549和PLC/PRF/5细胞系成功建立了 HEV细胞培养体系，通过接种高滴度的病毒(17)后获得了更高滴度的子代病毒(接种50天后达到10s)。HEV体外培养体系的建立为后续HEV复制机制、抗病毒药物研发等奠定坚实的基础。然而，HEV病毒复制仍然受限，因而必须优化。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)在体外培养的方法，该方法通过添加孕晚期血清对流行病学调查分离到的较高滴度的HEV毒株在体外进行培养，能够使病毒大量复制，为深入研究HEV生物学、免疫学特性及致病性提供必不可少的病原材料，为戊型肝炎的诊断、药物筛选与评价以及疫苗的研究提供有效的体外实验模型。
[0006]本发明戊型肝炎病毒体外培养方法，采用如下步骤进行:
(I)将HEV病毒溶液经0.22 μ m滤膜过滤除菌后，加入病毒溶液体积I?2%的双抗溶液，4°C处理lh，-80°C保存备用，经Real-time qPCR测定其病毒拷贝数为2X105?2X10 6拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素的溶液；
(2)将A549细胞按2X15/孔接种至6孔板中，用含质量百分比10%胎牛血清的DMEM培养基在37°C、5% 0)2培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；
(3)将步骤(2)的HEV病毒悬液按每孔100yL接种至单层细胞中，置37°C孵育I小时，每15min轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；弃上清，I XPBS洗涤细胞3次，加入含质量百分比2?5%孕晚期血清的DMEM培养基，同时添加0.0lmM MgCl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37°C、5% CO2培养箱中继续培养；
(4)接种HEV病毒6天后A549细胞出现病变现象，反复冻融，收集病变细胞及培养液，-80 °C保存待用。
[0007]所述孕晚期血清时至孕妇晚期血清或动物孕晚期血清，采用常规方法采集。
[0008]相比于现有技术，本发明采用戊型肝炎病毒在A549细胞中培养，添加孕妇晚期血清可使病毒复制效率增加至2X 18拷贝数/ml。
[0009]采用本发明方法对分离自中国云南昆明市HEV RNA阳性猪粪便样品的一株HEV病毒，基因型为4型，GenBank N0.JF747598 ;该毒株能在体外培养，培养上清中未经浓缩的病毒滴度达2X 18拷贝数/ml，病毒在-80°C冰箱保存3年生物活性不变，仍能感染人肺癌细胞(A549)株，在体外可连续传代到9代以上。
【附图说明】
[0010]图1是本发明中使用的A549细胞感染HEV的示意图；其中A图为正常A549细胞，B图为HEV感染6天后的A549细胞，C图为A549细胞感染HEV的电镜照片；
图2是本发明中RT-nPCR检测培养上清中HEV RNA示意图；其中I为孕妇血清培养A549细胞；2为小牛血清培养A549细胞；3为孕妇血清培养HEV感染的A549细胞；4为小牛血清培养HEV感染的A549细胞；
图3是本发明中RT-qPCR检测孕妇晚期血清促进HEV mRNA的复制示意图；
图4是本发明中Western blot检测HEV 0RF2蛋白示意图；其中I为A549细胞；2为小牛血清培养HEV感染的A549细胞；3为孕妇血清培养HEV感染的A549细胞。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
[0012]实施例1:A549细胞培养
自液氮中取出A549细胞(购买于美国ATCC，编号CCL - 185)迅速放入37°C的温水中，使细胞悬液快速融化；然后加入含有10%新生牛血清DMEM (购买于GIBCO InvitrogenCorporat1n公司)培养液，调pH至7.2于37°C培养4h左右，弃去全部培养液，加入新鲜的培养液继续培养，待长成致密单层后，用PBS(购买于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)洗细胞，胰酶-EDTA (购买于GIBCO Invitrogen Corporat1n公司)消化，加入上述培养液，置于37°C、5% CO2培养箱中继续培养，如图1A正常A549细胞所示。
[0013]实施例2:用添加孕妇晚期血清的DMEM培养基培养HEV
1、将收集到的用于HEV分离的HEV阳性粪便制备重量体积比10%的PBS(pH7.4)粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4°C，12000g离心lOmin，收集上清，0.22 μ m滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积2%的双抗溶液(400U/mL青霉素和1000U/mL链