猪细小病毒的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪细小病毒的培养方法，利用猪睾丸传代细胞（ST）细胞作为猪细小病毒培养的细胞源，在细胞传代的同时接种病毒，从而进行病毒的增殖培养。工艺简便、生长量大、得率高、成本低廉的特点，并且利用本发明培养的猪细小病毒制备的疫苗对猪细小病毒病具有完全的防治作用，具有很好的社会效益和应用前景。
【专利说明】猪细小病毒的培养方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于猪细小病毒疫苗生产【技术领域】，具体涉及猪细小病毒的培养方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)属于细小病毒科,是引起母猪繁殖障碍疾病的主要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。猪是本病唯一的易感动物，不同年龄、性别的家猪和野猪都可感染。带毒猪是PPV的主要传染源，带毒猪的分泌物和排泄物中的病毒可保持感染数月。实验证明，虽然带毒猪的排毒时间只有I周~2周，但被其污染的圈舍至少在4个月内仍具感染性，这主要是因为PPV对热稳定，对许多常用的消毒剂具有抵抗力，因此，污染的圈舍是PPV的主要储藏所。
[0005]该病最早是在1967年发现于英国，Carteright报道了本病，并从猪的流产胎儿中分离到PPV。目前世界各个国家均有流行和报道。我国自20世纪80年代从各地相继分离到PPV，血清学调查证实猪群中该病的阳性率达85%以上，给养猪业带来巨大的经济损失。目前世界上多采用疫苗免疫来控制本病的流行，在疫苗的生产过程中多使用细胞来增殖病毒，最常用的细胞大多都采用该病毒的本动物细胞(包括猪肾细胞、睾丸细胞和传代系PK-15细胞)和人的某些传代细胞(如Hela、KB等)，但由于该病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差另O，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，将难以生产出优质的疫苗。
[0006]
【发明内容】
[0007]为了克服现有【技术领域】存在的上述缺陷，本发明的目的在于，提供一种猪细小病毒的培养方法，解决现有技术因猪细小病毒在不同的细胞上增殖效果不尽相同，出现病变的时间、病变特征、病变观察的难易程度、病毒含量和血凝价均有所差别，如不能掌握其规律选择最佳的细胞系进行病毒的培养及培养技术，难以生产出优质疫苗的问题。
[0008]本发明提供的猪细小病毒的培养方法，包括以下步骤:
(1)细胞传代，将长满细胞瓶的生长状态良好的ST细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入MEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；
(2)病毒增殖，将PPV毒种2%同步接种ST细胞，并同时设未接毒的正常对照细胞，置37 °C、5 % CO2培养箱培养，接毒后16h换用不含血清的MEM细胞培养液，每天观察细胞病变CPE并记录病变情况，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，I 500 r.mirT1离心15min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3次，-70 °C冰柜保存备用；
它还包括以下步骤=TCID5tl的测定，将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10_4~10_7 4个稀释度同步接种每孔100 μ L ST细胞悬液的96孔微量培养板各8孔，每孔100 μ L，接毒后16 h换成不含血清的MEM培养液，同时设细胞对照孔，置37 °C、5 % CO2培养箱培养，观察6 d，按Reed-Muench法计算TCID5tl ;它还包括以下步骤:血凝价的测定，(I)红细胞的制备，无菌采取豚鼠血液，按I:9的比例加入PH7.2的PBS，混匀，2 000 r.mirT1离心10 min，吸去上清和中层的白细胞，加入红细胞体积10倍的PBS，混匀离心10 min，然后重复以上操作3次，最后将红细胞转至另一无菌的离心管中，同时用PH7.2的PBS稀释成浓度为0.6 %的豚鼠红细胞，4 °〇保存备用；
(2)血凝试验将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作为待测病毒分别测定血凝价，采用标准U型板，首先加入25 μ L PBS，然后将待测病毒做1:2，1:4…1:4096做倍比稀释，在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀释好的病毒液，再加入25 μ L 0.6 %的红细胞，轻轻振荡混匀，室温感作2~3 h,判定结果。
[0009]本发明提供的猪细小病毒的培养方法，其有益效果在于，具有工艺简便、生长量大、得率高、成本低廉的特点，并且利用本发明培养的猪细小病毒制备的疫苗对猪细小病毒病具有完全的防治作用，具有很好的社会效益和应用前景；所培养的病毒液病毒含量需不低于106_° TCID5(i/0.lrnl，血凝价HA不低于1:21°,显著高于现行技术培养的猪细小病毒的毒价和血凝价；所用细胞是猪的睾丸细胞为普通的常用细胞，来源充足，获取成本低，培养技术成熟，易于生产。
[0010]
【具体实施方式】
[0011]下面结合一个实施例，对本发明提供的猪细小病毒的培养方法进行详细的说明。
[0012]
实施例
[0013]本实施例的猪细小病毒的培养方法，包括以下步骤:
(1)细胞传代，将长满细胞瓶的生长状态良好的ST细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入MEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍；
(2)病毒增殖，将PPV毒种2%同步接种ST细胞，并同时设未接毒的正常对照细胞，置37 °C、5 % CO2培养箱培养，接毒后16h换用不含血清的MEM细胞培养液，每天观察细胞病变CPE并记录病变情况，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，I 500 r.mirT1离心15min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3次，-70 °C冰柜保存备用；
(3)TCID50的测定，将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10%血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10_4~10_7 4个稀释度同步接种每孔100 μ L ST细胞悬液的96孔微量培养板各8孔，每孔100 μ L，接毒后16 h换成不含血清的MEM培养液，同时设细胞对照孔，置37 °C、5 % CO2培养箱培养，观察6 d，按Reed-Muench法计算TCID5tl，病毒含量不低于IO6.0 TCID50/0.Iml ；
(4)血凝价的测定:(1)红细胞的制备，无菌采取豚鼠血液，按1:9的比例加入PH7.2的PBS，混匀，2 000 r ^mirT1离心10 min，吸去上清和中层的白细胞，加入红细胞体积10倍的PBS，混匀离心10 min，然后重复以上操作3次，最后将红细胞转至另一无菌的离心管中，同时用PH7.2的PBS稀释成浓度为0.6 %的豚鼠红细胞，4 1:保存备用；血凝试验，将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作为待测病毒分别测定血凝价，采用标准U型板，首先加入25 μ L PBS，然后将待测病毒做1:2，1:4…1:4096做倍比稀释，在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀释好的病毒液，再加入25 μ L 0.6 %的红细胞，轻轻振荡混匀，室温感作2~
3h ，血凝价HA不低于1:2'
【权利要求】
1.一种猪细小病毒的培养方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)细胞传代，将长满细胞瓶的生长状态良好的ST细胞用胰酶-EDTA溶液进行消化，待细胞松动后，加入MEM细胞培养液，并用吸管将消化下来的细胞吹散均匀，倒出4/5的细胞悬液，再加入等量的细胞培养液，即将细胞密度稀释为原来的5倍； (2)病毒增殖，将PPV毒种2%同步接种ST细胞，并同时设未接毒的正常对照细胞，置37 °C、5 % C02培养箱培养，接毒后16h换用不含血清的MEM细胞培养液，每天观察细胞病变CPE并记录病变情况，当细胞出现80 % CPE时收毒，冻融3次，I 500 r*min-l离心15min，小瓶分装上清液备用，按此方法传代至第3次，-70 1:冰柜保存备用。
2.根据权利要求1所述的猪细小病毒的培养方法，其特征在于:它还包括以下步骤: TCID50的测定，将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液用含10 %血清的MEM细胞培养液进行10倍系列稀释，取10-4~10-7 4个稀释度同步接种每孔100 μ L ST细胞悬液的96孔微量培养板各8孔，每孔100 μ L，接毒后16 h换成不含血清的MEM培养液，同时设细胞对照孔，置37 °C、5 % C02培养箱培养，观察6 d，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.根据权利要求1所述的猪细小病毒的培养方法，其特征在于:它还包括以下步骤: 血凝价的测定:(I)红细胞的制备，无菌采取豚鼠血液，按1:9的比例加入PH7.2的PBS，混匀，2 000 Pmin-1离心10 min，吸去上清和中层的白细胞，加入红细胞体积10倍的PBS，混匀离心10 min，然后重复以上操作3次，最后将红细胞转至另一无菌的离心管中，同时用PH7.2的PBS稀释成浓度为0.6 %的豚鼠红细胞，4 1:保存备用； (2)血凝试验，将所述步骤(2)中增殖后的第3代PPV病毒液作为待测病毒分别测定血凝价，采用标准U型板，首先加入25 μ L PBS，然后将待测病毒做1:2，1:4…1:4096做倍比稀释，在96孔U型板中每孔加入25 μ L稀释好的病毒液，再加入25 μ L 0.6 %的红细胞，轻轻振荡混匀，室温感作2~3 h,判定结`果。
【文档编号】C12N7/00GK103865885SQ201210550709
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】张述智, 夏伟, 朱绍辉, 张 浩, 王晓丽, 徐权汗, 李之详, 许团辉 申请人:青岛中仁药业有限公司