一种改良的工业规模制造dna的方法
【专利摘要】本发明提供了一种改良的工业规模制造DNA的方法，包括如下步骤：将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，调节pH至碱性，静置1-2小时，离心收集清液，将清液调pH至7.0～7.5，再加入酒精沉淀，收集沉淀，洗涤干燥，即可获得所述的产品DNA。采用本发明的方法，可获得含量较高的DNA，而且本发明的方法，操作简单，适宜于工业化生产。
【专利说明】一种改良的工业规模制造DNA的方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种制造高纯度DNA的方法。
【背景技术】:
[0002]小牛胸腺、鱼类精子和植物种子的胚等含有丰富的DNA，是提取DNA的良好材料。从培养微生物着手，然后从微生物中提取DNA亦有报道,但尚未用于工业生产。故而，从小牛胸腺，或鱼类精子(鱼白)提取DNA的方法是目前工业规模制造DNA的主要方法。
[0003]—般制备方法是首先将新鲜(或冰冻)小牛胸腺或鱼白先去除血水和结缔组织，在冰浴上切成小块，加缓冲液洗涤后用组织捣碎机(8000转/分-12000转/分)捣碎，用含0.14mol/L氯化钠的柠檬酸缓冲液，洗涤多次，去除核糖核蛋白，然后获得脱氧核糖核蛋白(或细胞核)。在工业制备时至少投料100KG或更多原料，故将只有几十克小牛胸腺或鱼白的血水、结缔组织去除干净是很困难的，特别是原料从外地，外单位采购时，一般都是冰冻的，里面夹杂杂质是必然的。另外组织捣碎机只能在实验室使用，这些都是工业生产难关。本发明根据动物细胞特别是小牛胸腺、鱼类精子等动物细胞因为没有细胞壁，而且细胞较易破碎的特点。采用绞肉机破碎细胞，然后用缓冲液洗涤离心，很容易将脱氧核糖核蛋白或细胞核提取出来，血水可通过缓冲液洗涤时去除、结缔组织用10-80目尼龙网或钢丝网过滤便可留存在网上而去除。这样可克服原料处理不好而带来的影响。
[0004]在 去蛋白时，由于考虑到成本和安全，工业生产一般不采用苯酚法提取DNA。大都采用SDS等去污剂使蛋白变性的方法。但此办法，由于工业生产规模大，不可能非常严格地在低温操作或保证DNA绝对不降解，工业制备DNA分子量相对要小一些。故而按照以前方法，在加入乙醇后，往往DNA沉淀不下来，而且得率和纯度很低。
[0005]DNA制备方法很多，但大都是实验室技术。例如文献(I)《生化实验方法和技术》(第二版，高等教育出版社)介绍的方法。即利用动物组织的脱氧核糖核蛋白可溶于水或盐溶液(如lmol/L氯化钠),但在0.14mol/L盐溶液中溶解度很低,而核糖核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与核糖核蛋白以及其他杂质分开。分离得到脱氧核糖核蛋白后，再进一步将蛋白质等杂质除去。
[0006]经常采用的去除蛋白方法有三种:(1)用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离DNA。(2)用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。(3)苯酚法:用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相中，或存在于中间残留物中，蛋白质变性后停留在酚层内。由于苯酚能使蛋白质迅速变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品，所以实验室除去蛋白的方法一般都采用苯酚法。
[0007]在采集小牛胸腺和鱼类精子原料时，小牛胸腺往往会有较多结缔组织、血水等杂质，而鱼类精子较为干净，杂质较少。故而国内外大都采用鱼类精子提取DNA，一般国外产品可达85-90%含量，而国内一般只有70%左右。而用小牛胸腺制备因难度较高，故而未见产品供应。
【发明内容】
:
[0008]本发明的目的是提供一种改良的工业规模制造高纯度DNA的方法，以克服现有技术存在的缺陷。
[0009]本发明的方法，包括如下步骤:
[0010]将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，加入l-2mol/L NaOH,调节pH至碱性，优选的，PH为8.5~12.0，特别优选的为10.0、11.0，静置1_2小时，离心收集清液，加入
l-2mol/L HCL,将清液调pH至7.0~7.5，优选7.0,再加入等量95%酒精沉淀，收集沉淀，洗涤干燥，即可获得所述的产品DNA，含量(W/W)可达91%。
[0011]所述DNA溶液的制备方法为常规的，如文献:“生化实验方法和技术”，(第二版，高等教育出版社)介绍的方法；
[0012]所述DNA来源于小牛胸腺、鱼类精子(或鱼白)；
[0013]术语“加入等量95%酒精”，指的是pH7.0-7.5清液与95%酒精体积之比；
[0014]优选的，在制备 脱氧核糖核蛋白时，考虑到沉淀量较多，工业生产时，可采用碟片式离心机；
[0015]而第二次去蛋白时沉淀量较少，离心时可采用高速管式离心机，这样可以获得较好效果，缩短操作时间，并提高收率。
[0016]根据DNA260nm和280nm紫外吸收比值(A26Q/A28Q)在1.9左右，以及当样品中蛋白质含量较高时比值会下降的原理。设计了以下实验，即分别将解离后DNA溶液pH调节至
8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，沉淀蛋白，离心，回调pH，最终获得表1结果:
[0017]表1
[0018]
【权利要求】
1.一种改良的工业规模制造DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤:将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，调节pH至碱性，静置1-2小时，离心收集清液，将清液调pH至7.0~7.5，再加入酒精沉淀，收集沉淀，洗涤干燥，即可获得所述的产品DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将十二烷基硫酸钠SDS解离后的DNA溶液，加入NaOH，调节pH至8.5~12.0，静置1_2小时，离心收集清液，加入HCL，将清液调pH至 7.0 ~7.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，加入NaOH,调节pH至为8.5~12.0，特别优选的为10.0、11.0，静置1-2小时，离心收集清液，加入HCL，将清液调pH至7.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，加入NaOH，调节pH至10.0或11.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在制备脱氧核糖核蛋白时，采用碟片式离心机；第二次去蛋白时采用高速管式离心机。
6.根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA来源于小牛胸腺、鱼类精子或鱼白。`
【文档编号】C12N15/10GK103865919SQ201210549891
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】邱蔚然, 周洁, 邱志云, 祁妤琳 申请人:南通秋之友生物科技有限公司