具有染料降解活性的齿毛菌漆酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中具有染料降解活性的齿毛菌漆酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 漆酶（LaccaseEC1. 10. 3. 2)，对一二酚：（双）氧氧化还原酶，又名酚酶，多酚氧 化酶，漆酚氧化酶等，是一种含铜的糖蛋白氧化酶，单体的分子量从40kD到110kD大小不 等，含糖量大概占分子量的10% -45%，而且同一物种产生的漆酶的糖基化程度可能有很 大的差别。漆酶最早在日本紫胶漆树（Rhusvernicifera)的渗出液中发现，后在真菌中 发现，在白腐菌中普遍存在，少数低等真菌和植物中也产生，甚至在动物肾脏和血清中也发 现了漆酶。相比之下，漆酶在植物中的含量很高，但因为天然植物提取物包含大量的氧化 酶类，植物漆酶很难被检测和纯化，所以植物漆酶并未被广泛应用。目前研究和应用上最广 泛的是担子菌门（Basidiomycota)真菌所分泌的漆酶。赵爽等公开了来自担子菌亚门真菌 毛头鬼伞（Coprinuscomatus)的漆酶，该漆酶的最适温度是60°C，最适pH是2. 0,该漆酶 在37°C、pH2. 0对2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS)的K"值 是 1.59mM、酶比活力为 729. 04U/mg(ANovelLaccasewithPotentAntiproliferative andHIV-lReverseTranscriptaseInhibitoryActivitiesfromMyceliaofMushroom Coprinuscomatus.BioMedResearchInternationalVolume2014,ArticleID417461 ； 授权公告号CN102268414B、授权公告日2013. 01. 23)。
[0003] 漆酶的作用底物非常广泛，能催化多种酚类化合物和大量含羟基、酸基或氨基等 基团的化合物的氧化，包括单酚、邻-苯二酚、对-苯二酚、甲氧基酚、抗坏血酸、二胺化合物 等。所有反应都有一个共同的特点，即利用了漆酶的氧化还原特性氧化有毒物质。发生反 应时，漆酶能够以分子氧作为最终电子受体，催化底物发生氧化的同时将氧还原成水。因其 催化氧化反应只需氧气，副产物只有水，因此被称为"绿色催化剂"。基于漆酶独特的降解底 物的特点，使得其在造纸与纺织、食品、生物合成、环境保护和生物能源等方面都具有广阔 的应用前景。
[0004] 染料，是众多行业中需要的重要材料，如纺织、食品行业。全世界每年约产染料70 万吨，使用过程中会有10% -15%的染料排放到环境中。染料本身的结构导致其具有较高 的光稳定性及水洗稳定性，很难处理清除，普通的物理化学方法具有成本高、效率低、有二 次污染等特点，因此，生物方法在近年来得到广泛关注。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种最适温度为45°C、IU直较小和/或酶比活 力较高的担子菌门真菌漆酶。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供了一种齿毛菌漆酶及其制备方法。
[0007] 本发明所提供的齿毛菌漆酶的制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)用液体培养基培养齿毛菌得到发酵液，收集发酵液中的上清液得到粗酶液；
[0009] 2)从所述粗酶液中分离纯化漆酶，得到齿毛菌漆酶。
[0010] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述粗酶液具体可为所述发酵液中的上清液。
[0011] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述粗酶液的具体制备方法可以为将除去所述发 酵液中的菌体得到的液体进行离心，收集上清液，该上清液即为粗酶液。
[0012] 所述离心采用的离心力可为6000-15000g(如7200g)，离心时间可为10-20分钟 (如15分钟）。
[0013] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述齿毛菌可为一色齿毛菌。
[0014] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述一色齿毛菌具体可为株号为GSM-01的一色 齿毛菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7713〇
[0015] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，从所述粗酶液中分离纯化漆酶包括如下步骤：
[0016]a)将所述粗酶液进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离 子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所述具有漆酶活性的洗脱峰是如下分 步洗脱中第三步洗脱得到的洗脱峰：用pH值为6. 8-7. 5或7. 2的Tris-HCl缓冲液进行 第一步洗脱，用0. 05MTris-HCl-NaCl缓冲液进行第二步洗脱，用0. 3MTris-HCl-NaCl缓 冲液进行第三步洗脱，收集第三步洗脱得到的洗脱峰，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述 0. 05MTris-HCl-NaCl缓冲液和0. 3MTris-HCl-NaCl缓冲液的溶质均为NaCl，溶剂均为所 述Tris-HCl缓冲液；所述0. 05MTris-HCl-NaCl缓冲液中NaCl的含量为0. 05M;所述0. 3M Tris-HCl-NaCl缓冲液中NaCl的含量为0. 3M。
[0017] 所述Tris-HCl缓冲液的溶质为Tris碱和HC1，溶剂为水；所述Tris-HCl缓冲液 中，Tris碱的含量为0. 01M，所述HC1是以加浓盐酸调节pH值的形式加入的；
[0018] b)将从步骤a)获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗 脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所述具有漆酶活性的洗 脱峰是用乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱得到的洗脱峰，所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的pH值 为3. 5-4. 0或3. 8,所述乙酸-乙酸钠缓冲溶液的溶质是乙酸和乙酸钠，溶剂是水，所述乙 酸-乙酸钠缓冲溶液中，乙酸钠的含量为0. 01M，所述乙酸是以加冰醋酸调节pH值的形式加 入的；
[0019] c)将从步骤b)获得的洗脱峰进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱 峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是Q;所述具有漆酶活性的洗脱峰 是如下分步洗脱中第二步洗脱得到的洗脱峰：用所述Tris-HCl缓冲液进行第一步洗脱， 用0. 35M Tris-HCl-NaCl缓冲液进行第二步洗脱，收集所述第二步洗脱得到的洗脱峰，得 到具有漆酶活性的洗脱峰；所述〇.35M Tris-HCl-NaCl缓冲液的溶质为NaCl，溶剂为所述 Tris-HCl缓冲液，所述NaCl在所述0. 35M Tris-HCl-NaCl缓冲液中的含量为0. 35M ;
[0020] d)将从步骤c)获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所 述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括3-70KD。
[0021] 所述步骤1)和所述步骤2)均可在20-30°C进行。
[0022] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述步骤a)中的阴离子交换柱层析的载体可为 Cellulose，所述步骤b)中的阳离子交换柱层析的载体可为Sepharose，所述步骤c)中的阴 离子交换柱层析的载体可为Sepharose，所述步骤d)中凝胶过滤层析的介质可为Superdex 75〇
[0023] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述步骤d)中的具有漆酶活性的洗脱峰可用如 下溶液洗脱得到：pH值为8. 5的0. 15M的NH4HC(VK溶液。
[0024] 上述齿毛菌漆酶的制备方法中，所述步骤d)所用的层析柱的柱长度和柱内径比 可为30:1。
[0025] 由上述制备方法得到的齿毛菌漆酶也属于本发明的保护范围。
[0026] 本发明的齿毛菌漆酶具有下述至少一种特性：
[0027] 1)分子量为 63. 2kD;
[0028] 2)在37°CpH4. 5对2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS) 酶活性为 2. 05X104U/mg;
[0029] 3)在25°CpH3. 0对2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS) 的 直是 0. 303mM;
[0030] 4)最适温度为45°C;
[0031] 5)最适pH为2. 6。
[0032] 本发明的齿毛菌漆酶的下述1)或2)的应用也属于本发明的保护范围：
[0033] 1)所述齿毛菌漆酶在制备降解染料产品中的应用；
[0034]2)所述齿毛菌漆酶在降解染料中的应用；
[0035] 所述染料可为溴百里酚蓝、依文思蓝、甲基橙和孔雀石绿中的至少一种。
[0036] 本发明从齿毛菌分离的齿毛菌漆酶分子量为63. 2kD;在25°CpH3. 0对2, 2-联 氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS)的KJ直是0? 303mM;最适温度为 45°(：;最适口11为2.6;在371^114.5的齿毛菌漆酶的比活力为2.05\10 41]/1^。本发明 的齿毛菌漆酶对底物（ABTS)的IU直是毛头鬼伞（Coprinuscomatus)漆酶（在37°CpH 2. 0对2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS)的KJ直是1. 59mM)的 〇. 19倍，表明该漆酶与底物的亲和力更强。本发明的齿毛菌漆酶的漆酶酶活性是毛头鬼伞 (Coprinuscomatus)漆酶（在 37°C、pH4. 5 的漆酶比活力为 729. 04U/mg)的 28. 12 倍。本 发明的齿毛菌漆酶的漆酶对多种染料表现明显的降解作用。
【附图说明】
[0037] 图1为DEAE-Cellulose离子交换层析洗脱图谱。
[0038] 图2为SP-S印haro