方法将突变体MC135的第131位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，构建突变体 MC1345,所用的引物如下：
[0098]Y3Y4-F：5' -CGGGTGCAAATATGAGTTAAAACAAATGGGAAAAAACGGGG- 3r
[0099]Y3Y4-R：5' -CCCCGTTTTTTCCCATTTGTTTTAACTCATATTTGCACCCG- 3r
[0100]PCR条件以及操作同实施例4,得到新突变体MC1345。
[0101] 5. 6单点突变子、组合突变子与母本残余活力的比较
[0102] 与母本相比均，MC35、MC23、MC235、MC135和MC1345热稳定性有不同程度提高。 在70°C温度下处理3小时后，母本ChKRED20完全丧失活力，单点突变子A100T(即：36F7)、 D102E(即：123D9)、E128K(即：22E10)、E131G、S154R的残余活力分别为 5. 8%、11. 8%、 7. 4%、4. 7%、4. 5%，组合突变子MC35、MC23、MC235、MC135、MC1345 的残余活力分别为 11.5%、10. 3%、0%、99. 9%、73. 7%。其中，突变子MC135的热稳定性提高幅度最大。实验 结果见说明书附图1。
[0103] 需要说明的是，组合突变体MC235虽然在70°C处理3h后的残余活力与母本相同， 但是其t1/2却比母本高，见说明书附图3。因此MC235也是耐热性提高的组合突变体。
[0104] 实施例6母本和组合突变型MC135的蛋白纯化以及热稳定性
[0105] 6. 1母本和组合突变体MC135的纯化
[0106] 母本羰基还原酶ChKRED20和组合突变体MC135酶的纯化采用镍柱亲和层析 (Bio-Rad)。参照实例3. 1进行菌体培养，菌体诱导培养18h后的菌体以13000rpm，4°C离心 收集，重悬于BufferA(50mM磷酸盐缓冲液，pH8. 0,300mMNaCl，10mM咪唑），细胞均质机 破碎，之后以13000rpm，4°C离心20min，将上清液加入已用BufferA平衡的柱料中，轻微混 匀30min，用含有20mM咪唑的BufferA漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的BufferA的缓冲 液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用BCAProteinAssaykit测定蛋白浓度。
[0107] 6. 2母本和组合突变体MC135最适反应温度的测定
[0108] 在pH8条件下，测定羰基还原酶野生型和突变型在不同温度下的最大反应速率， 酶的浓度为 〇? 〇5mg/mL，反应温度分别为 30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C、 70°C、75°C、80°C、85°C。测定方法为：lmL的反应液包含0. 05mg/mL的纯酶液，0. 2g/L的 NAD+，0. 1M，pH8. 0的磷酸钾缓冲液和0. 3倍体积的含有300mM4-氯乙酰乙酸乙酯的异丙醇 溶液，在不同温度下反应20min。等体积乙酸乙酯萃取，测定产物的生成量。以最大反应速 率时的活性为100%，其他温度下测定的酶活与它的比值百分比为纵坐标，反应温度为横坐 标，绘制酶活随反应温度变化的曲线。结果见说明书附图2。突变体MC135在65°C具有最 大反应速率，比野生型提高15°C。
[0109] 6. 3母本和组合突变体的热稳定性测定
[0110] 将蛋白浓度lmg/mL的纯酶液100yL置于容量250yL的PCR管，每个样品3 个重复，用PCR仪在65°C及80°C处理不同的时间，然后将样品管放置于冰上冷却，4°C， 12000rpm，离心lOmin，取适量处理后的酶液测定酶活力，测定方法见6. 2。以未经过高温处 理的酶液为参比，得到相对活力。以处理时间为X轴，残余酶活百分比的自然对数为Y轴， 用origin75软件做散点图，添加趋势线，得到酶热处理时间与相对活力的线性方程，以相 对活力50%的自然对数为3. 912023来计算得到相应的时间，此时间即为突变体的热失活 半衰期t1/2。结果见说明书附图4。在65°C条件下，ChKRED20母本的t1/2为仅12min，突变 体MC235的t1/2为13. 4min，突变体MC1345的11/2为131. 6min，突变体MC135在热处理15 天后，残余活性仍大于95% ;在80°C条件下，母本瞬间失活，而MC135的t1/2长达91min。
[0111] 实施例7突变子在生物催化中的应用
[0112] 7. 1组合突变型MC135的表征以及应用实例分析
[0113] 组合突变型MC135是在母本羰基还原酶ChKRED20的基础上由3个氨基酸替换产 生的。野生型ChKRED20的最适反应温度是50°C，但在此温度下稳定性不理想，因此实际反 应温度一般采用40°C。而组合突变型MC135最适反应温度升高至65°C，而且在65°C非常稳 定，连续处理15天后残余活性大于95%。突变体在65°C条件下转化底物的时空产率比母 本有很大程度的提高，3g/L的粗酶液可在18min内完全转化100g/L4-氯乙酰乙酸乙酯生 成（S)-CHBE，ee值>99%，时空产率333gAL.h)，比母本的最大时空产率高出4倍多。而且 150g/L、200g/L、300g/L的可以分别在30min、40min、lh内被完全转化。结果见说明书附图 4。7. 2组合突变子MC23、MC35、MC1345的应用实例分析
[0114] 在30°C条件下，6g/L的母本羰基还原酶ChKRED20粗酶液可在12h内转化200g/L 的3, 5-双三氟甲基苯乙酮生成R型醇，转化率>99%，ee值>99%。该产物是合成阿瑞匹 坦的一个关键手性中间体。突变体在50°C条件下转化底物的时空产率比母本大大提高。在 50°C条件下，6g/L组合突变子MC23、MC35和MC1345完全还原3, 5-双三氟甲基苯乙酮生成 阿瑞匹坦关键手性中间体R型醇分别需要7h、6. 3h和5h，时空产率是野生型的1. 7-2. 4倍。
[0115]SEQIDNO. 1
[0116]ATGGGAATTTTAGACAACAAAGTAGCACTTGTTACAGGAGCAGGATCCGGAATCGGATTAGCTGTTGCT CATTCGTATGCAAAAGAAGGCGCCAAAGTTATTGTATCCGATATTAATGAAGATCACGGTAACAAAGCAGTCGAAGA CATTAAAGCACAAGGCGGGGAAGCGTCTTTTGTAAAAGCAGATACTTCAAACCCTGAAGAAGTGGAAGCTTTAGTAA AAAGAACAGTAGAAATCTACGGAAGACTTGATATTGCATGTAATAATGCGGGAATCGGTGGCGAACAGGCGCTGGCA GGCGATTACGGTCTCGACAGCTGGCGAAAAGTATTAAGCATAAATCTTGATGGCGTATTCTACGGGTGCAAATATGA GTTAGAACAAATGGAAAAAAACGGGGGCGGCGTTATTGTGAATATGGCCTCTATTCATGGTATTGTTGCTGCACCGC TTTCCTCAGCCTACACTTCTGCAAAGCACGCAGTGGTAGGGCTTACTAAAAATATAGGAGCAGAATACGGACAGAAA AATATCCGTTGCAATGCGGTGGGGCCTGCTTATATTGAAACCCCGCTGTTGGAAAGCCTGACAAAGGAAATGAAGGA AGCACTGATTTCAAAACATCCGATGGGAAGACTGGGAAAACCTGAAGAAGTAGCAGAACTGGTGTTGTTCCTGAGTT CAGAAAAATCATCTTTTATGACGGGAGGCTATTATCTTGTAGATGGTGGCTACACGGCAGTTTAA
[0117]SEQIDNO. 2
[0118]MGILDNKVALVTGAGSGIGLAVAHSYAKEGAKVIVSDINEDHGNKAVEDIKAQGGEASFVKADTSNPEE VEALVKRTVEIYGRLDIACNNAGIGGEQALAGDYGLDSWRKVLSINLDGVFYGCKYELEQMEKNGGGVIVNMASIHG IVAAPLSSAYTSAKHAVVGLTKNIGAEYGQKNIRCNAVGPAYIETPLLESLTKEMKEALISKHPMGRLGKPEEVAEL
【主权项】
1. 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO. 2所示的序列为 出发序列，将第100位的丙氨酸突变为苏氨酸、第102位的天冬氨酸突变为谷氨酸、第128 位的谷氨酸突变为赖氨酸、第131位的谷氨酸突变为甘氨酸、第154位的丝氨酸突变为脯氨 酸或其任意组合得到的突变体或在此基础上增加中性突变位点得到的突变体。2. 权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于将第100位的丙氨酸突变为苏氨 酸、第128位的谷氨酸突变为赖氨酸、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸。3. 权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于第131位的谷氨酸突变为甘氨酸、 第137位的缬氨酸突变为异亮氨酸。4. 权利要求1所述的羰基还原酶突变体，其特征在于将第71位的谷氨酸突变为天冬氨 酸、第110位的赖氨酸突变为精氨酸、第154位的丝氨酸突变为脯氨酸。5. 权利要求1所述的羰基还原酶突变体在催化羰基化合物中的应用。
【专利摘要】本发明以易错PCR技术对母本羰基还原酶ChKRED20基因随机突变，建立突变文库，通过高通量筛选体系筛选出5个热稳定性提高的突变位点。将这5个有益氨基酸突变位点的两个或两个以上进行整合，获得热稳定性提高的组合突变体。这些突变体与母本相比，在高温条件下，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，催化4-氯乙酰乙酸乙酯、3,5-双三氟甲基苯乙酮等底物的时空效率均有提高，最大提高4倍，具有良好的工业应用前景。
【IPC分类】C12N9/04
【公开号】CN105062985
【申请号】CN201510487573
【发明人】吴中柳, 赵凤佼, 任志强, 刘艳
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月11日