用于通过核酸聚合酶对衬底多核苷酸进行大小受控的同聚物加尾的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底多核苷酸的方法和组合物。本发明还涵盖用于将所加尾的衬底固定至固体支持物的方法和组合物。本公开预期衰减子分子是与添加至衬底多核苷酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至所述衬底多核苷酸的3'末端的所述添加的任何生物分子。添加至所述衬底多核苷酸的序列本文称为尾部序列，或简称尾部，并且将核苷酸添加至衬底多核苷酸的过程本文称为加尾。
【专利说明】用于通过核酸聚合酶对衬底多核音酸进行大小受控的同聚 物加尾的方法和组合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[000引根据美国法典第35篇第119条（e)款，本申请要求2012年3月13日提交的美国 临时申请号61/610, 296和2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613, 784的优先权 权益，所述申请各自W引用的方式整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于将具有特定长度的尾部添加至衬底多核巧酸的方法和组合物。本 发明还涵盖用于将加尾衬底固定至固体支持物的方法和组合物。
[0004] 发明背景
[000引许多当前下一代测序（NG巧平台在测序之前都要求特殊的DNA和RNA制备。最常 用的制备涉及通过连接反应将衔接子序列添加至双链DNA片段的末端。所述反应通常涉及 平末端DNA或在3'末端处具有单个脱氧腺巧（dA)核巧酸的DNA W及高浓度的DNA连接 酶，并且所述反应导致形成大量的嵌合模板。模板依赖性聚合酶如DNA特异性末端脱氧核 巧酸转移酶（TdT) W及RNA特异性聚（A)和聚扣）聚合酶可能代表用于制备NGS分析所用 的DNA和RNA的一种有吸引力的替代方法，其中富有挑战性的问题是由该些酶产生的聚合 物尾部的长度在广泛范围（20个至500个核巧酸）内变化，该取决于许多因素并且不易控 巧||，因而降低了它们对NGS的效用。
[000引发明概述
[0007] 因此，本发明提供一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。本发明预期所述 衰减子分子是与添加至衬底多核巧酸的尾部序列缔合，并且控制尾部序列至所述衬底多核 巧酸的3'末端的添加的任何生物分子。添加至所述衬底多核巧酸的所述序列本文称为尾 部序列，或简称尾部，并且将核巧酸添加至衬底多核巧酸的过程本文称为加尾。如本文所 使用的衰减子分子是多核巧酸、多肤、多糖W及其组合。在所述衰减子分子为多核巧酸的 方面，进一步预期的是所述多核巧酸为环状分子，或所述多核巧酸包含肤核酸、裂權多糖 (Schizophyllan polysaccharide)、锁核酸W及其组合。
[0008] 如上所述，所述衰减子分子与添加至所述衬底多核巧酸的尾部序列缔合并且控制 核巧酸至所述衬底多核巧酸的添加。在一些实施方案中，所述衰减子分子是与添加至衬底 多核巧酸的序列杂交的多核巧酸，其中添加至所述衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本上等 于与所述尾部序列缔合的所述衰减子分子的部分中的核巧酸的数量。在一些方面，添加至 所述衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本上等于与所述尾部序列缔合的所述衰减子分子中 的核巧酸数量的倍数。如本文所使用，术语"基本上"和"基本上等于"应理解成指的是近 似或近似相等。
[0009] 在一些实施方案中，所述核酸聚合酶为模板依赖性聚合酶。在一方面，所述核酸聚 合酶为DNA聚合酶，并且在另一方面，所述DNA聚合酶为末端脱氧核巧酸转移酶（TdT)。在 相关实施方案中，所述核酸聚合酶为RNA聚合酶，所述RNA聚合酶在各个方面选自由聚（A) 聚合酶、RNA特异性核巧酸转移酶W及聚扣）聚合酶组成的组。
[0010] 本发明预期的是，在一些实施方案中，所述衰减子分子包含选自由W下组成的组 的核巧酸；2' -脱氧胸巧5' - 一磯酸（dTMP)、2' -脱氧鸟巧5' - 一磯酸（dGMP)、2' -脱氧腺 巧5' - 一磯酸（dAMP)、2' -脱氧胞巧5' - 一磯酸（dCMP)、2' -脱氧尿巧5'- -磯酸（加 MP)、 胸巧一磯酸（TMP)、鸟巧一磯酸佑MP)、腺巧一磯酸（AMP)、胞巧一磯酸（CMP)、尿巧一磯酸 扣MP)、碱基类似物W及其组合。因此，在某些实施方案中，所述衰减子分子包含为杂聚序列 或同聚序列的衰减子序列，其中所述序列为二核巧酸序列或同聚物序列。
[0011] 在各个方面，所述衰减子分子包含1个核巧酸、2个核巧酸、3个核巧酸、4个核巧 酸、5个核巧酸、10个核巧酸、20个核巧酸、30个核巧酸、50个核巧酸、100个核巧酸或更多。
[0012] 在一些实施方案中，所述衰减子分子包含封闭基团，并且在一方面，所述封闭基团 位于所述分子的3'末端。所述封闭基团阻止所述衰减子分子通过所述核酸聚合酶的延伸。 因此，在各个方面，所述封闭基团选自由W下组成的组：至少一个核糖核巧酸、至少一个脱 氧核巧酸、C3间隔区、磯酸、双脱氧核巧酸、氨基W及反向脱氧胸巧。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含位于所述衰减子序列 (同聚物序列或二核巧酸序列）5'的衔接子序列、鉴定标签序列，或两者。在一个实施方案 中，所述衰减子分子是固定的。在另外的实施方案中，所述组合物中存在连接酶。在另一个 实施方案中，所述组合物进一步包含连接酶。
[0014] 在另一个实施方案中，所述衰减子分子是衰减子-衔接子分子，所述衰减子-衔接 子分子包含衰减子序列并且进一步包含定位在所述衰减子序列附近并且与单独的多核巧 酸上的序列X互补的序列W ;所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与序 列V互补的序列Y，其中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相同的长度，所述衔接 子分子是与所述衰减子-衔接子分子分开的分子。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含下一代测序（NG巧衔接 子序列。NGS衔接子序列与衔接子序列的不同之处在于NGS衔接子序列可用于测序平台。在 本发明的一些实施方案中，所述衰减子分子进一步包含含有序列X和序列Y的下一代测序 (NGS)衔接子序列（对于本文论述的各个序列（例如，序列X、序列Y等）的进一步描述，参 见W下附图和论述）、鉴定标签序列或其组合，它们位于同聚物序列或二核巧酸序列的5'。 在其中所述衰减子分子进一步包含衔接子序列的实施方案中，所述衰减子分子本文称为衰 减子-衔接子分子。在一个实施方案中，所述衰减子分子和/或衰减子-衔接子分子是固定 的。在相关实施方案中，序列X和序列Y是与Illumina、Ion Torrent、Roche454或SOLiD 测序平台相容的NGS衔接子序列。
[0016] 在另外的实施方案中，序列X和序列Y处于单独的衰减子-衔接子分子上，而在其 它实施方案中，序列X和序列Y在同一衰减子-衔接子分子上彼此相邻。
[0017] 在一些实施方案中，本发明还提供其中衔接子序列进一步包含位于序列X与序列 Y之间的可裂解序列狂）的组合物。在一些方面，序列Z中的裂解位点是至少一个加碱基 或RNA碱基，或限制性核酸内切酶位点。
[0018] 本发明还提供其中所述衰减子分子是单链或至少部分是双链的组合物。"部分双 链"指的是所述衰减子分子包含单链部分和双链部分。在其中所述衰减子分子至少部分是 双链的一些方面，部分双链的衰减子分子通过使衰减子分子的部分退火到衔接子分子（其 包含衔接子序列，在一些实施方案中，所述衔接子序列是NGS衔接子序列）来产生，所述衰 减子分子的部分与所述衔接子分子是互补的。在一些方面，退火是（a)在衰减子分子与单 独的衔接子分子之间，或化）退火发生在形成发夹结构的单个衰减子分子内，因此所述衰 减子分子既包含同聚序列或二核巧酸序列，又包含衔接子序列。
[0019] 在另一个实施方案中，所述衰减子分子包含与衔接子序列X完全互补的序列W。在 一些方面，序列W还与衔接子序列Y完全或部分互补。
[0020] 在各个方面，所述衰减子分子包含选自由W下组成的组的同聚序列：聚（dA)、聚 (dT)、聚（dC)、聚（dG)、聚（加)、聚（rA)、聚扣)、聚（rC)、聚（rG) ; W及包含W下组合的杂聚 序列或二核巧酸序列；（i)dA与rA碱基、（ii)dT、加与U碱基、（iii)dC与rC碱基，或（iv) dG与rG碱基。
[0021] 在另外的方面，所述衰减子分子包含脱氧核糖核巧酸并且可用DM特异性核酸酶 降解。在该些方面的一些方面中，DNA特异性核酸酶为面ase I。在另外的实施方案中，本发 明提供的一种组合物包含单链环化连接酶，其包括但不限于CircLigase和/或CircLigase II。
[0022] 在一些方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含缺乏校正活性的DM聚 合酶W及具有校正活性的Kapa化Fi聚合酶。在另外的实施方案中，本发明的一种组合物 包含连接酶。
[0023] 本发明的另外的实施方案提供一种组合物，所述组合物包含能够裂解序列Z的限 制性核酸内切酶，所述序列Z位于序列X与序列Y之间并且当与互补的X' Z' Y'多核巧酸杂 交时，包含限制性核酸内切酶位点。
[0024] 在一些实施方案中，提供一种组合物，其中部分双链的衔接子序列包含序列V和 序列Y，其中V是Y的截短补体并且包含封闭的3'末端，该样使得部分双链的衔接子能够平 端连接至双链衬底分子。在另一个实施方案中，序列V与序列Y完全互补。
[00巧]本发明进一步涵盖其中所述衰减子分子可降解的组合物。在一些方面，所述衰减 子分子包含加碱基并且可通过用加糖基化酶赔育（该产生无碱基位点），之后在8(TC W 上的温度下赔育（在无碱基位点内引起断裂），或用加糖基化酶和脱嘿岭/脱嚼巧核酸内 切酶的混合物赔育来降解。因此，在各个方面，本发明提供组合物，其中所述衰减子分子包 含加碱基并且用加糖基化酶赔育来使所述衰减子分子不稳定，或用加糖基化酶赔育并且 在8(TC W上的温度下后续赔育使所述衰减子分子降解，或用加糖基化酶与脱嘿岭/脱嚼巧 核酸内切酶的混合物来赔育所述衰减子分子。在另外的方面，所述衰减子分子包含核糖核 巧酸并且在对于核糖核酸酶活性充足的条件下可用核糖核酸酶降解。在相关方面，核糖核 酸酶选自由W下组成的组；RNase H、RNase HII、RNase A W及RNase T1。
[0026] 在另外的方面，所述衰减子分子包含脱氧核糖核巧酸并且可用DM特异性核酸酶 降解。在该些方面的一些方面中，所述DNA特异性核酸酶为面ase I。
[0027] 本发明还提供一种使衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括在足W允许将尾部 序列添加至所述衬底多核巧酸的3'末端的条件下，用本文所描述的组合物来赔育所述衬 底多核巧酸，并且其中所述尾部序列的所述添加允许所述尾部序列与所述衰减子分子之间 缔合W形成复合物。在另一方面，所述方法进一步包括在所述衬底多核巧酸的延伸之后使 所述衰减子分子降解。在另外的方面，所述方法进一步包括分离所延伸的衬底多核巧酸。所 述方法的其它方面进一步包括将本文所描述的组合物与所述衬底多核巧酸w及与所述衰 减子分子的同聚部分互补的核巧酸混合。
[0028] 根据本发明的各个方面，所述衬底多核巧酸是单链多核巧酸或双链多核巧酸。在 一些方面，所述双链多核巧酸具有平末端、3'突出末端、3'凹陷末端或游离的3'轻基。本 发明提供方法，其中所述衬底多核巧酸是双链的，并且在某些方面，所述双链衬底多核巧酸 通过在足W允许第一衬底多核巧酸与第二衬底多核巧酸缔合的条件下，使所述第一衬底多 核巧酸退火到所述第二衬底多核巧酸而产生。根据本发明的另外的方面，所述衬底多核巧 酸包含游离的3'轻基。在各个实施方案中，所述单链多核巧酸通过片段化的双链DNA的变 性或由RNA的逆转录来制备。在一些方面，所述双链多核巧酸具有平末端或带有游离的3' 轻基的3'突出末端。
[0029] 在本发明的所述方法的各个方面，将多个核巧酸添加至所述衬底多核巧酸。在各 个方面，添加至所述衬底多核巧酸的核巧酸的数量包括；至少约1个核巧酸到至多约10、 20、50或100个核巧酸，至少约3个核巧酸到至多约10、20、50或100个核巧酸，至少约10 个核巧酸到至多约20、30、50或100个核巧酸，至少约5个核巧酸到至多约10、20、50或100 个核巧酸，至少约10个核巧酸到至多约20、30、50或100个核巧酸，至少约1个核巧酸到至 多约5、10或20个核巧酸，至少约3个核巧酸到至多约5、10或20个核巧酸，至少约5个核 巧酸到至多约20、40或50个核巧酸，至少1个核巧酸，至少2个核巧酸，至少3个核巧酸， 至少4个核巧酸，至少5个核巧酸，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至 少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个， 至少19个，至少20个，至少21个，至少22个，至少23个，至少24个，至少25个，至少26 个，至少27个，至少28个，至少29个，至少30个，至少31个，至少32个，至少33个，至少 34个，至少35个，至少36个，至少37个，至少38个，至少39个，至少40个，至少41个，至 少42个，至少43个，至少44个，至少45个，至少46个，至少47个，至少48个，至少49个， 至少50个，至少51个，至少52个，至少53个，至少54个，至少55个，至少56个，至少57 个，至少58个，至少59个，至少60个，至少61个，至少62个，至少63个，至少64个，至少 65个，至少66个，至少67个，至少68个，至少69个，至少70个，至少71个，至少72个，至 少73个，至少74个，至少75个，至少76个，至少77个，至少78个，至少79个，至少80个， 至少81个，至少82个，至少83个，至少84个，至少85个，至少86个，至少87个，至少88 个，至少89个，至少90个，至少91个，至少92个，至少93个，至少94个，至少95个，至少 96个，至少97个，至少98个，至少99个，至少100个核巧酸或更多。
[0030] 本发明提供的另外的实施方案包括其中所述衰减子分子在全部或部分的衰减子 分子长度上与所述尾部序列缔合的那些。在一些实施方案中，所述衰减子分子在添加所述 尾部序列的过程期间与所述尾部序列缔合。在另外的方面，所述衰减子分子与所述尾部序 列的缔合调节核巧酸至所述衬底多核巧酸的添加。在一些方面，所述衰减子分子另外包含 衔接子序列，并且在将所述尾部序列添加至所述衬底多核巧酸期间，通过连接酶将所述衔 接子序列连接至所述衬底多核巧酸，并且在各种实施方案中，所述连接酶为DNA连接酶或 RNA连接酶。
[0031] 本发明还预期的是，在一些方面，所述方法的条件调节所述尾部序列至所述衬底 多核巧酸的添加。就预期调节所述尾部序列至所述衬底多核巧酸的添加的条件来说，预期 的是，在一些方面，所述尾部序列至所述衬底多核巧酸的所述添加对温度敏感。预期了其 中温度介于约4C与约5(TC之间的条件。在其中使用热稳定聚合酶的方面，温度可W高于 5(TC。因此，在另外的方面，所述温度介于约5(TC与约9(TC之间。
[0032] 在另外的实施方案中，所述尾部序列至所述衬底多核巧酸的所述添加对时间敏 感，并且在各个方面，允许赔育步骤进行在约0. 5分钟至约120分钟的范围内的时间长度。 在另外的实施方案中，所述尾部序列至所述衬底多核巧酸的所述添加对抑敏感。在该些实 施方案的一些实施方案中，所述尾部序列至所述衬底多核巧酸的所述添加在其中抑处于 约抑5. 0至约抑9. 0的范围内的条件下进行。
[0033] 在各种实施方案中，所述衬底多核巧酸为DNA或RNA。
[0034] 本文提供的方法还包括其中所述衰减子-衔接子分子是固定的那些方法。在一 些方面，在将尾部序列添加至衬底多核巧酸期间，通过DNA或RNA连接酶将所固定的衰减 子-衔接子分子连接至所述衬底多核巧酸，从而使所述衬底多核巧酸固定。在另外的方面， 添加至反应物的连接酶的量为约0. 1个单位至约1000个单位扣)。
[00巧]在某些方面，本文所描述的方法进一步包括量为约ImM至约lOOmM的镇。在另外 的方面，所述方法进一步包括量为约ImM至约1M的钟或轴。
[0036] 在本发明的特定方面，提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括 将所述DNA衬底多核巧酸与TdT酶、包含3'磯酸的可降解的衰减子多核巧酸W及与所述 衰减子多核巧酸的同聚部分互补的核巧酸混合；将混合物在37C下赔育约30分钟，之后在 7(TC下另外赔育约10分钟；通过添加 DNA糖基化酶来使所述衰减子分子降解并且将所述混 合物在37C下赔育约5分钟；W及任选地分离所延伸的DNA衬底多核巧酸。
[0037] 在另一方面，本发明提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括将 衬底多核巧酸与TdT酶、包含3'末端处的两个核糖核巧酸的衰减子多核巧酸W及与所述衰 减子多核巧酸的同聚部分互补的核巧酸混合；将混合物在3(TC下赔育30分钟，之后在7(TC 下另外赔育约10分钟来使所述TdT酶失活；W及任选地分离所延伸的DM衬底多核巧酸。
[0038] 在一方面，本发明进一步提供一种使衬底RNA多核巧酸延伸的方法，所述方法包 括将所述衬底RNA多核巧酸与RNA聚合酶、可降解的衰减子多核巧酸W及与所述衰减子多 核巧酸的同聚部分互补的核糖核巧酸混合；将混合物在3(TC下赔育约30分钟，之后在95C 下另外赔育约10分钟；通过添加 DNA糖基化酶来使所述衰减子分子降解并且将所述混合物 在37C下赔育约10分钟；W及任选地分离所延伸的衬底多核巧酸。
[0039] 在另一方面，本发明提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括通 过将衰减子分子和衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约l〇(TC并且然后冷却至 约25C来使彼此部分互补的所述衰减子分子和所述衔接子分子退火，其中所述退火产生了 部分双链的衰减子-衔接子分子；将所述DNA衬底多核巧酸与TdT酶、连接酶、所述部分双 链的衰减子-衔接子分子W及与所述衰减子-衔接子分子的同聚部分互补的核巧酸混合； 在约37C下赔育约15至约30分钟；W及任选地分离连接至所述衰减子-衔接子分子的所 延伸的DNA衬底多核巧酸。
[0040] 在一方面，本发明进一步提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包 括通过将一个衰减子-衔接子分子和第二生物素化的衔接子分子的混合物在合适的缓冲 液中加热至约l〇(TC并且然后冷却至约25C来使彼此至少部分互补的所述衰减子-衔接 子分子退火到所述第二生物素化的衔接子分子，其中所述退火产生了双链的生物素化的衰 减子-衔接子分子；通过在约25C下，将所述双链的生物素化的衰减子-衔接子分子与包 含链霉亲和素涂布的磁珠的溶液混合约30至约60分钟，来使所述双链的生物素化的衰减 子-衔接子分子固定，从而使所述双链的生物素化的衰减子-衔接子分子固定至所述链霉 亲和素涂布的磁珠；用所述DNA衬底多核巧酸、TdT酶、连接酶W及与所述双链衰减子分子 的同聚部分互补的核巧酸来将连接至所述链霉亲和素涂布的磁珠的所固定的双链生物素 化的衰减子-衔接子分子在约37C下赔育15至约30分钟；用化OH洗涂所述溶液来将非生 物素化的单链DNA从珠粒中去除；W及任选地分离连接至所述双链生物素化的衰减子-衔 接子分子的所延伸的DNA衬底多核巧酸。
[0041] 在另一方面，提供一种使RNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括通过将 衰减子分子和衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约l〇(TC并且然后冷却至约 25C来使彼此至少部分互补的所述衰减子分子和所述衔接子分子退火，其中所述退火产生 了部分双链的衰减子-衔接子分子；将RNA衬底多核巧酸与聚（A)或聚扣）酶、连接酶、所 述部分双链的衰减子-衔接子分子W及与所述部分双链的衰减子分子的单链同聚部分互 补的核糖核巧酸混合；在约3(TC至约37C下赔育约15至30分钟；W及任选地分离连接至 所述衰减子-衔接子分子的所延伸的RNA衬底多核巧酸。
[0042] 在另一方面，本发明提供一种使RNA衬底多核巧酸延伸和固定的方法，所述方法 包括通过将衰减子-衔接子分子和生物素化的衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加 热至约lOCrC并且然后冷却至约25C来使彼此至少部分互补的所述衰减子-衔接子分子退 火到所述生物素化的衔接子分子，其中所述退火产生了部分双链的生物素化的衰减子-衔 接子分子；通过在约25C下将所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子与包含链 霉亲和素涂布的磁珠的溶液混合约两小时，来使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接 子分子固定，从而使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子固定至所述链霉亲和 素涂布的磁珠；用所述RNA衬底多核巧酸、聚（A)或聚扣）聚合酶、连接酶W及与所述部分 双链的衰减子-衔接子分子的单链同聚部分互补的核糖核巧酸来将连接至所述链霉亲和 素涂布的磁珠的所固定的部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子在约3(TC至约37C 下赔育约15至30分钟；用NaOH洗涂所述溶液来将非生物素化的单链多核巧酸从珠粒中 去除；W及任选地分离连接至所述双链生物素化的衰减子-衔接子分子的所延伸并固定的 RNA衬底多核巧酸。
[0043] 在各种实施方案中，本发明还提供其中将DNA聚合酶与dNTP混合来进行衬底多核 巧酸的聚合酶延伸的方法，所述聚合酶延伸在受控的同聚物加尾之后发生并且使得一个或 多个NGS衔接子序列（序列X、序列Y或序列X和Y) 3'引入至与位于所述衰减子分子的同 聚物5'的另外的序列X'和序列Y'互补的衬底同聚物。
[0044] 在另外的实施方案中，在将核巧酸添加至所述衬底多核巧酸期间，通过连接酶将 NGS衔接子序列X、序列Y或序列X和Y任选地连接至所述衬底多核巧酸。在其它实施方案 中，在将核巧酸添加至所述衬底多核巧酸之后，通过连接酶将NGS衔接子序列X、序列Y或 序列X和Y任选地连接至所述衬底多核巧酸。在相关实施方案中，连接酶为DNA连接酶或 RNA连接酶。
[0045] 在另外的实施方案中，衰减子分子序列W任选地相对于序列X'和Y'为截短的，W 允许全长X'Y'多核巧酸引物替代截短的衰减子并且使得聚合酶延伸，w产生双链衔接的 衬底分子。如本文所使用，"衔接分子"是已经经历了加尾和连接反应的衬底分子。
[0046] 本发明进一步提供其中在同聚物添加和聚合酶延伸之后，任选地用导致衔接的单 链DNA分子的环化的单链DNA环化连接酶来赔育所述衬底分子的实施方案。在一个实施方 案中，通过降解阻止包含序列X和序列Y的所述衰减子分子的环化。
[0047] 在另一个实施方案中，在同聚物添加和连接之后，任选地用导致衔接的单链DNA 分子的环化的单链DNA环化连接酶来赔育所述衬底分子。
[0048] 在本发明的另一个实施方案中，通过形成双链或部分双链的衰减子-衔接子分子 来阻止XZY衔接子分子的环化。
[0049] 本发明的实施方案涵盖环状DNA分子在序列Z处的裂解，所述裂解由用例如但不 限于加糖基化酶和脱嘿岭/脱嚼巧核酸内切酶赔育造成（在其中Z包含加碱基的实施方 案中）。
[0050] 本发明的另外的实施方案包括环状DNA分子在序列Z处的裂解，所述裂解由在与 XZY连接区互补的寡核巧酸的杂交之后用RNase H、RNase H 11(在其中Z包含RNA碱基的 实施方案中）或通过限制性酶赔育造成。
[0051] 在另外的方面，本发明提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括： 将所述DNA衬底多核巧酸与聚合酶和连接酶、包含NGS衔接子序列X和Y W及可裂解序列 Z的衔接子多核巧酸W及与所述衰减子多核巧酸的同聚部分互补的脱氧核巧酸混合，其中 所述衔接子任选地包含3'核糖核巧酸和5'磯酸，并且退火到具有截短的NGS衔接子序列 W和3'封闭部分的衰减子；进行加尾和连接同步反应，使所述聚合酶和连接酶热失活，之后 用单链特异性环化连接酶来赔育；任选地包括Z序列处的裂解反应或用反向X和Y引物进 行的扩增反应，进行所述反应中的任一个来将环状分子分解成完整的线性NGS文库分子。
[0052] 在另一方面，本发明提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括将 DNA衬底多核巧酸与聚合酶、具有NGS衔接子序列X'和Y'并且包含如本文所描述的3'延 伸封闭部分和裂解位点的衰减子，W及与所述衰减子多核巧酸的同聚部分互补的脱氧核巧 酸混合；进行加尾反应，使所述聚合酶热失活，之后添加 DNA聚合酶和dNTP混合物来对所加 尾的衬底多核巧酸进行聚合酶延伸，W将同聚物添加3'的NGS衔接子序列X和Y引入到所 述衬底上；然后将衰减子模板多核巧酸用RNase或加糖基化酶降解，之后用单链特异性环 化连接酶赔育；任选地包括Z序列处的裂解反应或用反向X和Y引物进行的扩增反应，进行 所述反应中的任一个，W将环状分子分解成完整的线性NGS文库分子。
[0053] 在另一方面，本发明提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括将 所述DNA衬底多核巧酸与聚合酶和连接酶、包含NGS衔接子序列X的衔接子多核巧酸，W及 与所述衰减子多核巧酸的同聚部分互补的脱氧核巧酸混合，其中所述衔接子任选地包含3' 延伸封闭部分和5'磯酸，并且退火到具有截短的NGS衔接子序列W和3'封闭部分的衰减 子；进行加尾和连接同步反应，使所述聚合酶和连接酶热失活，之后用与能够替代所述衰减 子分子的全长NGS衔接子序列X'互补的引物、DNA聚合酶W及任选地包括加 TP的dNTP来 赔育，W进行延伸反应，生成第二链和具有平末端的双链衬底分子；用T4DNA连接酶W及通 过使包含NGS衔接子序列Y和截短的补体（序列V) W及3'磯酸的两个多核巧酸退火而形 成的平末端衔接子进行连接，其中Y多核巧酸连接至所述衬底分子的5'磯酸来实现线性 NGS文库分子；任选地使用加糖基化酶并且加热至95°C来降解所合成的链。
[0054] 本发明的另一方面提供一种使DNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括：将 所述DNA衬底多核巧酸与聚合酶、具有NGS衔接子序列X'并且包含3'延伸封闭部分和裂 解位点的衰减子，W及与所述衰减子多核巧酸的同聚部分互补的脱氧核巧酸混合；进行加 尾反应，使所述聚合酶热失活，之后添加校正DNA聚合酶和dNTP混合物来进行聚合酶延伸， W将同聚物添加3'的NGS衔接子序列X引入到所述衬底上并且将非互补碱基从衰减子3' 末端去除来允许聚合酶延伸，W生成平末端的双链衬底；用T4DNA连接酶和通过使包含NGS 衔接子序列Y和截短的补体（序列V) W及3'磯酸的两个多核巧酸退火而形成的平末端衔 接子分子进行连接，其中Y多核巧酸连接至所述衬底分子的5'磯酸，W实现线性NGS文库 分子；任选地使用加糖基化酶并且加热至介于约9(Tc与locrc之间来降解所合成的链。在 各种实施方案中，将所述混合物加热至介于约9(TC与95C之间，或介于约95C与10(TC之 间，或约9(TC，或约9rC，或约92C，或约93C，或约94C，或约95C，或约96C，或约97C， 或约98C，或约99C，或约lOCrC。
[0055] 在另一方面，提供一种使RNA衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括；将所述 RNA衬底多核巧酸与聚（A)或聚扣）酶和T4DNA连接酶、包含NGS衔接子序列X的DNA衔接 子多核巧酸，W及与所述衰减子多核巧酸的同聚部分互补的核糖核巧酸混合，其中所述衔 接子任选地包含3'延伸封闭部分和5'磯酸，并且退火到具有截短的NGS衔接子序列W和 3'封闭部分的RNA衰减子进行加尾和连接同步反应，使所述聚（A)或聚做酶热失活，之 后用与能够替代针对序列X'截短的衰减子分子的全长NGS衔接子序列X'互补的引物、逆 转录酶W及dNTP赔育，W进行延伸反应，生成第二链和双链衬底分子；进行磁珠 DNA纯化步 骤，之后在95C下进行链变性；然后使用聚合酶和连接酶W及DM衰减子-衔接子分子来 进行第二同步加尾和连接，所述第二同步加尾和连接会将同聚物和Y NGS衔接子序列添加 至所述衬底分子的游离的3'末端，从而实现线性NGS文库分子，其中需要任选的DNA纯化 步骤。
[0056] 本发明还提供一种使用受控的同聚物加尾和连接，之后使衬底多核巧酸环化（图 25)来进行NGS文库合成的方法，其中片段化的单链DNA通过使片段化的双链DNA变性或 通过RNA的逆转录来制备，其中受控的加尾和连接在聚合酶、连接酶、核巧酸D(其中D = dATP、dTTP或dGTP) W及衰减子-衔接子分子的存在下进行，其中所述衰减子-衔接子分 子通过使W下两个多核巧酸退火而形成：多核巧酸XZY和多核巧酸W(H)。。
[0057] 多核巧酸XZY包含5'磯酸，W及位于3'末端处的阻止同聚物尾部的添加的核糖 核巧酸碱基或其它封闭基团。序列X和Y表示NGS文库的衔接子序列和任选的ID标签。任 选的序列Z用于裂解并且包含加碱基、RNA碱基或限制性核酸内切酶位点。多核巧酸W(H) n包含两个序列：与多核巧酸XZY的5'部分互补的5'序列WW及同聚衰减子序列（H)。，其 中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30。多核巧酸W(H)。包含3'封闭基团，其包括但不限 于3'磯酸、双脱氧核巧酸、C3间隔区、反向胸巧或通过聚合酶特异性地抑制碱基的添加的 一个或多个核糖核巧酸。在反应中，所述聚合酶会将有限数量的碱基添加至DNA衬底的3' 末端，之后通过连接酶来连接XZY衔接子分子。在某些实施方案中，通过所述聚合酶添加至 DNA衬底的3'末端的碱基的数量介于约1与50个dA或dT碱基之间或介于约1与50个 dG碱基之间。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数 量为约1个核巧酸到至多约5、10、20、30、40或50个dA、dT或dG核巧酸，或约5个到至多 约10、15、20、30、40或50个(14、(11'或(16核巧酸，或约10个到至多约15、20、30、40或50个 dA、dT或dG核巧酸，或约9个至约12个dA、dT或dG核巧酸，或约6个至约8个dA、dT或 dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DM衬底的3'末端的碱基的数 量为至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7 个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约 14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、 至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约 27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、 至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约 40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、 至少约47个、至少约48个、至少约49个或至少约50个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实 施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个或更多个 dA、dT 或 dG 核巧酸。
[0058] 在使所述聚合酶和所述连接酶任选热失活之后，用单链环化连接酶巧picentre/ Illumina)赔育导致所衔接的单链DM分子的环化。通过在XZY多核巧酸与W(H)。多核巧 酸之间形成双链衰减子-衔接子复合物来阻止XZY多核巧酸的环化。环化的NGS文库可W 直接用于簇形成（Ion Torrent、454 W及Solid平台情况下的乳化PCR，W及Illumina平台 情况下的过桥式扩增化ridge amplification))或直接用于测序（PacBio)。任选地，所述环 状DNA分子的裂解通过加糖基化酶和脱嘿岭/脱嚼巧核酸内切酶（在Z序列包含加碱基 的情况下），通过RNase H或RNase H II (在Z序列包含RNA碱基的情况下）或通过限制性 核酸内切酶来实现。在后两种情况下，与所述XZY连接区互补的多核巧酸的杂交是提供用 于RNase H或限制性核酸内切酶的模板所必需的。可替代地，进行扩增反应来将环状形式 分解成线性形式。
[0059] 本发明还提供一种用于使用受控的同聚物加尾，之后是聚合酶延伸和环化（图 26)进行NGS文库合成的替代方法，其中单链衬底多核巧酸的加尾在聚合酶、核巧酸D(其中 D = dATP、dTTP或dGTP) W及衰减子-模板多核巧酸的存在下进行，其中所述衰减子-模 板多核巧酸包含H个序列；与衔接子序列Y互补的5'序列Y'，与衔接子序列X互补的序列 X' W及同聚衰减子序列做。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30。所述衰减子-模板 多核巧酸另外包含位于3'末端处的磯酸基团、核糖核巧酸或其它封闭基团。序列X和Y表 示用于NGS文库的衔接子序列和任选的ID标签。所述衰减子序列和X'，Y'序列两者均具 有可降解碱基，如核糖核巧酸或加。在所述衰减子分子的存在下，聚合酶将有限数量的碱基 添加至DNA的3'末端。在某些实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的 碱基的数量介于约1与50个dA或dT碱基之间或介于约1与50个dG碱基之间。在另外 的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为约1个核巧酸到 至多约5、10、20、30、40或50个dA、dT或dG核巧酸，或约5个到至多约10、15、20、30、40或 50个(^、扣或(16核巧酸，或约10个到至多约12、15、20、30、40或50个(^、扣或(16核巧 酸，或约10个至约13个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加 至DM衬底的3'末端的碱基的数量为至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至 少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、 至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约 18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、 至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至少约 31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37个、 至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少 约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个或至少约50 个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端 的碱基的数量为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个或更多个dA、dT或dG核巧酸。
[0060] 在使所述聚合酶和所述连接酶任选热失活之后，添加 DNA聚合酶和dNTP混合物 来进行聚合酶延伸，该使得将X序列和Y序列添加至同聚序列值)。的3'末端。在通过添 加加糖基化酶或RNase进行衰减子-模板的降解之后，用单链环化连接酶巧picentre/ Illumina)赔育导致所衔接的单链DM分子的环化。如果有需要，进行任选的扩增来将环状 形式分解成线性形式。可替代地，X与Y之间的任选序列Z用于在与XZY结构域互补的多 核巧酸的杂交和裂解反应之后产生线性形式（如上文所述）。在某些实施方案中，进行来将 环状形式分解成线性形式的任选的扩增是一项技术，包括但不限于反向PCR。
[0061] 还涵盖一种NGS文库合成的方法，所述方法包括受控的同聚物加尾和连接，之后 是反向链合成和平端衔接子连接（图27)，其中加尾和连接在TdT酶、大肠杆菌DNA连接酶、 核巧酸D (其中D = dATP、dTTP或dGTP) W及衰减子-衔接子分子的存在下进行，所述衰减 子-衔接子分子通过使W下两个多核巧酸退火而形成：多核巧酸X和多核巧酸W(H)。。多核 巧酸X包含5'磯酸和3'封闭基团，其中序列X包含NGS文库衔接子序列W及任选的ID标 签。多核巧酸W(H)。由两个序列组成；与多核巧酸X的5'部分互补的5'序列WW及同聚 衰减子序列化)。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30,并且另外包含3'封闭基团。在 反应中，所述聚合酶会将有限数量的碱基添加至DNA衬底的3'末端，之后通过连接酶来连 接所述衰减子-衔接子分子。在某些实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末 端的碱基的数量介于约1与50个dA或dT碱基之间或介于约1与50个dG碱基之间。在 另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为约1个核巧 酸到至多约5、10、20、30、40或50个(14、扣或(16核巧酸，或约5个到至多约10、15、20、30、 40或50个dA、dT或dG核巧酸，或约10个到至多约15、20、30、40或50个dA、dT或dG核巧 酸，或约9个至约12个dA、dT或dG核巧酸，或约6个至约8个dA、dT或dG核巧酸。在另 外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为至少约1个、 至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、 至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约 15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、 至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约 28个、至少约29个、至少约30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、 至少约35个、至少约36个、至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约 41个、至少约42个、至少约43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、 至少约48个、至少约49个或至少约50个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过 所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个或更多个 dA、dT 或 dG 核巧酸。
[0062] 在使所述聚合酶和所述连接酶任选热失活之后，添加 DNA聚合酶W及含有5'序 列X'、位于3'末端处的1至10个H碱基（或者，在另外的实施方案中，约1个至约5、7或 10个H碱基，或约5个至约6、8或10个H碱基，或约6个至约8个H碱基）W及任选的加 碱基的引物引起反向链复制，从而形成双链平末端（在校正DNA聚合酶的存在下）或具有 3' dA碱基的双链末端（在DNA聚合酶缺乏校正活性的情况下），并且其中聚合混合物任选 地包括加 TP。平末端或dT衔接子的连接通过连接酶来实现，其中有待连接的衔接子通过W 下两个多核巧酸形成：多核巧酸Y，其中Y为第二NGS衔接子；W及与多核巧酸Y的3'部分 互补的多核巧酸V。多核巧酸V的3'末端具有磯酸封闭基团。连接导致多核巧酸Y的3' 末端共价连接至原始DNA片段的5'磯酸，而多核巧酸V的5'末端与引物延伸产物的3'末 端之间未形成连接。任选地，所复制的DNA链和引物X'通过用加糖基化酶赔育W及95C 赔育来降解。在一些实施方案中，所述赔育在约9(Tc与locrc之间发生。在另外的实施方案 中，将所述混合物加热至介于约9(TC与95C之间，或介于约95C与lOCrC之间，或约9(TC， 或约9TC，或约92°C，或约93°C，或约94°C，或约95°C，或约96°C，或约97°C，或约98°C，或 约 99°C，或约 100°C。
[0063] 本发明还提供一种用于NGS文库构建的替代方法，所述方法包括受控的加尾和聚 合，之后是反向链合成和平端连接（图28)，其中加尾在聚合酶、核巧酸D (其中D = dATP、 dTTP或dGTP) W及衰减子-模板多核巧酸的存在下进行，所述衰减子-模板多核巧酸包含 两个序列：与NGS衔接子X互补的5'序列X'，W及同聚衰减子序列（H)。，其中H为A、T或 C碱基，并且n = 10-30,并且另外包含3'核糖核巧酸和内部可降解碱基（如核糖核巧酸或 加）。在所述衰减子分子的存在下，所述聚合酶将有限数量的碱基添加至DNA衬底的3'末 端并且在任选的热失活之后，包括了具有校正活性的DNA聚合酶和dNTP混合物将使所述 DNA衬底延伸W包括序列X，并且还将过量的非互补碱基从衰减子多核巧酸3'末端去除， 并且然后引起产生双链平末端的反向链复制。聚合混合物可W任选地包含加 TP。平末端 衔接子的连接通过T4DNA连接酶来实现，其中所述平末端衔接子通过W下两个多核巧酸形 成：多核巧酸Y，其中Y为第二NGS衔接子的序列；W及与多核巧酸Y的3'部分互补的多核 巧酸V，并且其中多核巧酸V的3'末端包含磯酸或其它封闭基团。平端连接导致多核巧酸 Y的3'末端共价连接至原始DNA片段的5'磯酸，而多核巧酸V的5'末端与引物延伸产物 的3'末端之间不存在连接。任选地，通过用加糖基化酶赔育W及95C赔育来降解所复制 的DNA链和引物X'。在一些实施方案中，所述赔育在约9(TC与lOCrC之间发生。在另外的 实施方案中，将所述混合物加热至介于约9(TC与95C之间，或介于约95C与lOCrC之间，或 约9(TC，或约9rC，或约92°C，或约93°C，或约94°C，或约95°C，或约96°C，或约97°C，或约 98°C，或约 99°C，或约 100°C。
[0064] 本发明用于NGS文库制备的另一种方法包括两个顺序的加尾和连接反应（图29)， 其中第一加尾和连接反应在聚合酶、连接酶、核巧酸D (其中D = dATP、dTTP或dGTP) W及 衰减子-衔接子分子的存在下进行，所述衰减子-衔接子分子通过使W下两个多核巧酸退 火而形成：多核巧酸X和多核巧酸W做。，其中多核巧酸X包含5'磯酸、3'封闭基团和NGS 衔接子序列W及任选的ID标签；并且多核巧酸W(H)。包含两个序列：与多核巧酸X的5'部 分互补的5'序列WW及同聚衰减子序列化)。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30,并 且另外包含3'封闭基团。
[0065] 在反应中，聚合酶会将有限数量的碱基（1至50个dA或dT碱基W及1至50个dG 碱基）添加至DM衬底的3'末端，之后通过连接酶来连接第一衰减子-衔接子分子。在使 所述聚合酶和所述连接酶任选热失活之后，添加含有与序列X互补的5'序列X'和位于3' 末端处的1至10个H碱基的引物导致引物退火到衔接子序列X并且替代衰减子多核巧酸。 此外，引物X'可W包含位于3'末端处的ril封闭碱基W防止利用第二加尾和连接反应进行 聚合酶介导的引物加尾。添加 DNA聚合酶将使所述引物延伸并且复制衬底的反向链，其中 任选地通过邸TA停止反应并且通过基于磁珠的DNA纯化来纯化，之后在退火到第二NGS衔 接子Y的第二衰减子的存在下，第二次添加聚合酶来将有限数量的碱基（1至50个dA或dT 碱基W及1至50个dG碱基）添加至DM延伸产物的3'末端，然后通过连接酶来连接包含 所述第二NGS衔接子Y的第二衰减子-衔接子分子。任选地，使所述聚合酶和所述连接酶 热失活，之后进行基于磁珠的DNA纯化。如上所述并且在另外的实施方案中，通过所述聚合 酶添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为约1个核巧酸到至多约5、10、20、30、40或50 个dA、dT或dG核巧酸，或约5个到至多约10、15、20、30、40或50个dA、dT或dG核巧酸，或 约10个到至多约15、20、30、40或50个dA、dT或dG核巧酸，或约9个至约12个dA、dT或 dG核巧酸，或约6个至约8个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶 添加至DNA衬底的3'末端的碱基的数量为至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4 个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11 个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至 少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24 个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约30个、至 少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、至少约37 个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约43个、至少 约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个或至少约50 个dA、dT或dG核巧酸。在另外的实施方案中，通过所述聚合酶添加至DNA衬底的3'末端 的碱基的数量为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 个或更多个dA、dT或dG核巧酸。
[0066] 本发明还提供用于在衬底多核巧酸上使用5'加尾随机引物延伸的组合，之后是 受控的加尾和连接（图30)进行NGS文库合成的方法，其中在允许与包含W下两个结构域 的随机引物杂交的条件下接触完整的或片段化的单链核酸：5'结构域X，其中序列X在各种 实施方案中包含NGS衔接子序列和任选的鉴别标签；W及3'结构域，其包含随机序列n，从 而允许引物与核酸样品内的任何区域杂交，并且在适当的反应条件下，在聚合酶和核巧酸 的存在下，实现引物延伸W及衔接子X在延伸产物的5'末端的引入。引物在各个方面包含 5'标记，包括但不限于生物素。在任选的纯化或核巧酸降解步骤之后，在聚合酶、连接酶、 核巧酸D (其中D = A、T或G) W及衰减子-衔接子分子的存在下在所述延伸产物上进行加 尾和连接反应，所述衰减子-衔接子分子通过使W下两个多核巧酸退火而形成：多核巧酸Y 和多核巧酸V(H)。。多核巧酸Y包含5'磯酸和3'封闭基团，其中序列Y包含第二NGS文库 衔接子序列W及任选的鉴别标签。多核巧酸V(H)。由两个序列组成；与多核巧酸Y的5'部 分互补的5'序列VW及同聚衰减子序列化)。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30,并 且另外包含3'封闭基团。在反应中，所述聚合酶将有限数量的碱基（即，约1个至约50个 核巧酸）添加至引物延伸产物的3'末端，之后通过连接酶来连接Y/V(H)。衰减子-衔接子 分子，从而完成第一 NGS衔接子和第二NGS衔接子的添加。
[0067] 本发明还涵盖一种祀向NGS文库合成的方法：在衬底多核巧酸上使用5'加尾祀 特异性引物延伸的组合，之后是受控的加尾和连接（图31)，其中完整的或片段化的单链核 酸通过包含W下两个结构域的多个祀特异性引物来进行杂交：多个引物中的所有引物共有 的5'结构域X，其中序列X包含NGS衔接子序列和任选的鉴别标签；W及对多个引物中的 每一个来说独特的3'结构域，各自包含祀特异性序列，从而允许引物与核酸样品内的所需 的任意多个祀标杂交，并且在适当的反应条件下，在聚合酶和核巧酸的存在下，实现引物延 伸W及衔接子X在延伸产物的5'末端的引入。所述多个引物可W另外包含5'标记，包括 但不限于生物素。在任选的纯化或核巧酸降解步骤之后，在聚合酶、连接酶、核巧酸D (其中 D = A、T或G) W及衰减子-衔接子分子的存在下进行加尾和连接反应，所述衰减子-衔接 子分子通过使W下两个多核巧酸退火而形成：多核巧酸Y和多核巧酸V(H)。。多核巧酸Y包 含5'磯酸和3'封闭基团，其中序列Y包含第二NGS文库衔接子序列W及任选的鉴别标签。 多核巧酸V化)。由两个序列组成；与多核巧酸Y的5'部分互补的5'序列VW及同聚衰减 子序列化)。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30,并且另外包含3'封闭基团。在反应 中，所述聚合酶将有限数量的碱基（即，约1个至约50个核巧酸）添加至引物延伸产物的 3'末端，之后通过连接酶来连接Y/V (H)。衰减子-衔接子分子，从而完成两个NGS衔接子在 多个祀标中的每个祀标上的添加。
[0068] 还涵盖一种祀向NGS文库合成的方法，所述方法包括受控的同聚物加尾和连接， 之后是祀特异性引物延伸和祀特异性平端衔接子连接（图32)，其中在聚合酶、连接酶、核 巧酸D (其中D = A、T或G) W及衰减子-衔接子分子的存在下进行加尾和连接，所述衰减 子-衔接子分子通过使W下两个多核巧酸退火而形成：多核巧酸X和多核巧酸W(H)。。多核 巧酸X包含5'磯酸和3'封闭基团，其中序列X包含NGS文库衔接子序列W及任选的鉴别标 签。多核巧酸W化)。包含两个序列：与多核巧酸X的5'部分互补的5'序列W，W及同聚衰 减子序列化)。，其中H为A、T或C碱基，并且n = 10-30,并且另外包含3'封闭基团。在反 应中，所述聚合酶将有限数量的碱基（即，约1个至约50个核巧酸）添加至核酸衬底的3' 末端，之后通过连接酶来连接所述衰减子-衔接子分子。在使聚合酶和连接酶任选热失活 之后，在适当的反应条件下添加聚合酶、核巧酸W及多个祀特异性引物导致形成包含多个 祀特异性引物的互补序列的片段的双链平末端（在校正DNA聚合酶的存在下）或具有3'dA 碱基的双链末端（在DM聚合酶缺乏校正活性的情况下）。所述多个引物可W另外包含5' 标记，包括但不限于生物素。平末端或dT衔接子与所述多个祀特异性产物的连接通过连接 酶来实现，其中有待连接的衔接子通过W下两个多核巧酸形成：多核巧酸Y，其中Y为第二 NGS衔接子；W及与多核巧酸Y的3'部分互补的多核巧酸V。多核巧酸V的3'末端具有磯 酸封闭基团。连接导致多核巧酸Y的3'末端共价连接至多个祀特异性片段的5'磯酸，而 多核巧酸V的5'末端与祀特异性引物-延伸产物的3'末端之间未形成连接。任选地，使 用NGS衔接子特异性引物通过PCR扩增所实现的多个祀特异性文库产物。
[0069] 在图33中，描绘了涉及受控的加尾和连接步骤的祀特异性NGS文库制备方法的简 要内容。方法1总结了图32中描述的方法，并且方法2中具有任选的祀向文库珠粒捕获。 方法3总结了一种方法，其中构建了全基因组NGS文库并且之后接着是祀特异性引物延伸 和祀向文库珠粒捕获W及扩增。方法4和方法5描绘了图31中所呈现的方法的替代工作 流程。在方法4中，多个生物素化的祀特异性引物延伸来自片段化的核酸样品的选择性区 域，之后是第一 NGS衔接子的平端连接或TA连接，珠粒捕获，然后是用W添加第二NGS衔接 子的受控的加尾和连接。方法5与方法4相似，只是在第一步骤中，祀特异性引物包含具有 NGS衔接子序列的5'尾部。在方法6中，在进行受控的加尾和连接，W引入第一 NGS衔接子 和衔接子特异性引物延伸之后，进行变性，之后进行第二NGS衔接子5'加尾的祀特异性引 物延伸来实现NGS文库，其可W进一步进行扩增。在用于祀特异性NGS文库制备的任何方 法中，预期的是允许一次至多次使用本文所描述的衰减子分子。在另外的实施方案中，允许 使用一次本文所描述的衰减子分子来将文库产物固定至表面。
[0070] 对于使用受控的加尾和连接来引入NGS衔接子序列的所公开方法进行全基因组 或祀向文库构建的各种实施方案中的任何一个来说，第二衔接子序列通过第二受控的加尾 和连接来引入或通过在引物延伸反应之后平端连接或TA连接至双链衬底来引入。如图37 中所示，设想了用于选择性地连接一个链或连接两个链的平端和TA衔接子连接的各种方 法。因此，在各种实施方案中，衔接子序列包括平末端或T-突出末端（因此允许发生TA连 接）。在另外的实施方案中，所述衔接子序列可W是平末端的，具有T碱基的3'突出、5'磯 酸或3'基团封闭连接（例如但不限于双脱氧核巧酸）或其组合。
[0071] 本发明进一步提供一种使衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括；（1)在允许 所述衬底多核巧酸延伸来为所述衬底加尾的条件下，用W下各项赔育包含所述衬底多核巧 酸的混合物；（i)聚合酶；（ii)组合物，其包含衰减子分子，所述衰减子分子包含衰减子序 列并且进一步包含定位在所述衰减子序列附近并且与单独的多核巧酸上的衔接子序列X 互补的序列W ;所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与序列V互补的 序列Y，其中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相同的长度，所述衔接子分子是与 所述衰减子-衔接子分子分开的分子；W及（iii)脱氧核巧酸，其与所述衰减子分子的所 述衰减子序列互补；（2)将所述衔接子序列X连接至所述衬底多核巧酸并且使所述衰减子 分子与所述单独多核巧酸解离；（3)在其中引物与所述衬底多核巧酸杂交的条件下，添加 与所述衬底多核巧酸中的序列互补的引物；(4)添加聚合酶和脱氧核巧酸，W由所述引物 进行聚合酶延伸，W产生与所述衬底多核巧酸互补的第二链多核巧酸并且产生双链衬底分 子；（5)将所述衔接子分子连接至所述双链衬底分子；(6)任选地使所述第二链多核巧酸降 解。在一些实施方案中，所述引物与所述衬底多核巧酸中的序列充分互补，W在适当的条件 下与序列X杂交。在另外的实施方案中，所述引物是祀特异性引物，其与所述衬底分子中序 列X之外的序列充分互补W在适当的条件下与所述序列杂交。在另外的实施方案中，所述 衬底多核巧酸为单链DNA多核巧酸，并且在另外的实施方案中，所述衬底多核巧酸为核糖 核酸巧NA)。
[0072] 还提供了一种包括本文所公开的任何组合物的试剂盒。
[0073] 附图简述
[0074] 图1描绘了在长的（〉20b)互补的聚（dT)多核巧酸的存在下进行的衰减的聚合酶 介导的聚（dA)DNA加尾。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反应。
[0075] 图2描绘了使用短的（12-14b)互补的聚（dT)多核巧酸进行的衰减的聚合酶介导 的聚（dA)加尾。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反应。
[0076] 图3描绘了在短的聚（dT)衰减子分子的存在下进行的聚（dA)加尾的期望动力 学。
[0077] 图4描绘了一种方法，其中衰减的聚合酶介导的聚（dA)加尾是用含有加碱基的 可降解的衰减子多核巧酸来进行的。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反应。
[0078] 图5描绘了使用长的（〉20b)互补的衰减子多核巧酸进行的衰减的聚合酶介导的 聚（dT)、聚（dG) W及聚（dC)加尾。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反应。
[0079] 图6描绘了使用可降解的衰减子核糖多核巧酸进行的衰减的聚合酶介导的聚 (dA)、聚（dT)、聚（dG) W及聚（dC)加尾。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反 应。
[0080] 图7描绘了使用互补的DNA聚（dT)30多核巧酸对RNA衬底进行的衰减的聚 (A)-聚合酶介导的聚（rA)加尾。
[0081] 图8描绘了使用互补的DNA聚（dA)3。多核巧酸对RNA衬底进行的衰减的聚扣)-聚 合酶介导的聚（rU)加尾。
[0082] 图9描绘了使用有限加尾反应将3'末端衔接子连接至单链DNA或RNA分子。
[0083] 图10描绘了使用偶联的有限的加尾-连接反应或有限的加尾-聚合酶延伸反应 将单链DNA和RNA共价固定至固体支持物。
[0084] 图11描绘了通过平末端或dA/dT连接进行的第二衔接子连接。
[00财图12描绘了通过偶联的有限的加尾-连接反应进行的第二衔接子连接。曲NA表 不基因组DNA。
[0086] 图13描绘了通过有限的加尾-聚合酶-延伸反应进行的第二衔接子连接。
[0087] 图14描绘了在长的聚（dT)衰减子分子的存在下通过聚合酶引入的聚（dA)序列 的预测长度随着反应温度的变化而变化。所述图例示了（不限于）使用TdT酶进行加尾反 应。
[0088] 图15示出了在缺乏和存在长的可降解的DNA衰减子分子（TTTTTU)eTTT(SEQ ID N0:43)的情况下通过TdT酶对单链DNA模板进行聚（dA)加尾的实验测定的时间过程。
[0089] 图16示出了在短的衰减子分子的存在下通过TdT对单链DNA模板进行的受控的 聚（dA)加尾；a.衰减子长度和反应温度的影响；b.使用短的衰减子的长的赔育时间的影 响。
[0090] 图17示出了双链DNA模板的受控和不受控的聚（dA) TdT加尾。
[0091] 图18示出了具有随机化末端的单链DM模板的受控的聚（dA) TdT加尾。
[0092] 图19示出了使用聚（dT)、聚（dC) W及聚（dG)尾部的单链DM模板的受控的TdT 加尾。
[0093] 图20示出了通过大肠杆菌聚（A)聚合酶对单链RNA模板进行的受控的聚（rA)加 尾。
[0094] 图21示出了通过酵母（粟酒裂殖酵母化pombe))聚扣）聚合酶对单链RNA模板 进行的受控的聚（rU)加尾；a.在短的DNA衰减子存在下的时间过程；b.长的DNA和RNA衰 减子的影响；C.长的RNA寡核巧酸衰减子的影响。
[0095] 图22示出了同步的受控的DNA TdT加尾W及与衰减子-衔接子复合物在溶液和 固相中的连接。
[0096] 图23示出实验数据，所述实验数据示出了同步的受控的聚（A)聚合酶加尾W及单 链RNA模板与衰减子-衔接子复合物在溶液中的连接。
[0097] 图24描绘了示出单链DNA和RNA的同步的受控的加尾、连接W及固定的过程的 图；a.使用在溶液中的衰减子-衔接子复合物值NA) ;b.使用固定至磁珠的衰减子-衔接 子复合物值NA) ;c.使用在溶液中的衰减子-衔接子复合物（RNA)。所述图例示了（不限 于）使用TdT酶进行加尾反应。
[0098] 图25描绘了一种NGS文库合成的方法：使用受控的同聚物加尾和连接，之后是衬 底多核巧酸的环化。
[0099] 图26示出了一种用于NGS文库合成的替代方法：使用受控的同聚物加尾，之后是 聚合酶延伸和环化。
[0100] 图27描绘了一种NGS文库合成方法：使用受控的同聚物加尾和连接，之后是反向 链合成和平端衔接子连接。
[0101] 图28示出了一种用于NGS文库构建的替代方法，所述替代方法包括受控的加尾和 聚合，之后是反向链合成和平端连接。
[0102] 图29描绘了另一种NGS文库制备方法，所述方法包括两个顺序的加尾和连接反 应。
[0103] 图30是通过随机引物延伸W及延伸产物的受控的加尾和连接来制备片段NGS文 库的示意图。
[0104] 图31是通过祀特异性引物延伸W及延伸产物的受控的加尾和连接来制备祀向 NGS文库的示意图。
[0105] 图32为使用受控的加尾和连接反应，之后是复制和衔接子连接来制备祀向NGS文 库的示意图。
[0106] 图33为用于使用如本发明所设想的受控的加尾-衔接子连接反应来制备祀向NGS 文库的各种方法的示意图。
[0107] 图34示出了与实施例12凝胶1有关的实验数据，所述实施例是使用包含另外的 具有随机碱基组成的3'结构域的衰减子-衔接子分子进行的受控的加尾和连接反应。
[010引图35示出了与实施例12凝胶2有关的实验数据，所述实施例是使用包含另外的 具有随机碱基组成的3'结构域的衰减子-衔接子分子进行的受控的加尾和连接反应。
[0109] 图36示出了与使用二核巧酸衰减子-衔接子的受控的加尾和连接反应有关的实 验数据。
[0110] 图37描绘了作为全基因组或祀向文库制备的部分的平端或TA衔接子连接的各种 方法。
[0111] 发明详述
[0112] 本文提供一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。所述组合物用于一种方 法，所述方法用于W受控方式将一个或多个核巧酸添加至衬底多核巧酸，从而将所需数量 的核巧酸添加至衬底多核巧酸。通过举例并且非限制性地，通过添加衰减子分子的延长反 应混合物来调节使用核酸聚合酶进行的多核巧酸链的延长，所述衰减子分子结合至由聚合 酶产生的新添加的尾部序列，从而形成双链体结构并且因此降低聚合过程的速率。因此，控 制了反应速率并且将具有所需有限大小的尾部序列添加至反应混合物中的衬底多核巧酸， 并且添加至反应混合物中的衬底多核巧酸的尾部具有非常窄的大小分布。
[0113] 本发明提供允许对通过核酸聚合酶将尾部序列添加至衬底多核巧酸的末端进行 衰减和控制的方法和试剂。本发明还提供用于用作方法的基础的反应的组合物，W及设计 来执行方法的试剂盒，W用于使用核酸聚合酶来将如本文所描述的尾部序列添加至衬底多 核巧酸的大小受控的加尾。组合物和方法W及用于执行方法的试剂盒提供尾部序列至衬底 多核巧酸的有效并且受控的连接。
[0114] 如本文所使用的术语"加尾"可与术语"受控加尾"和"有限加尾"互换。
[0115] 本文中应注意，除非上下文另有明确指示，否则在本说明书和附加权利要求中使 用的单数形式"一个"、"一种"W及"所述"包括复数个指示物。
[0116] 还应当注意，本文所使用的术语"约"应理解为指的是近似。在提及本发明的分子 (例如但不限于衰减子分子）时的"使……不稳定"指的是使得容易断裂。通过例如但不限 于在高温（约8(TC或更高）下赔育分子，用脱嘿岭/脱嚼巧核酸内切酶赔育分子或其组合 而发生断裂。
[0117] 核酸聚合酶
[0118] 本发明涵盖一种包含衰减子分子和核酸聚合酶的组合物。本发明的方法还包括利 用另外的核酸聚合酶的那些方法。可W将特异性同聚序列添加至核酸的3'末端的任何聚 合酶均预期用于本文所描述的方法。
[0119] 在一些方面，核酸聚合酶为DNA聚合酶，并且在一个具体的方面，DNA聚合酶为末 端脱氧核巧酸转移酶（TdT)。还预期的是，核酸聚合酶为RNA聚合酶，并且在该些方面，RNA 聚合酶选自由聚（A)聚合酶和聚扣）聚合酶组成的组。在一个具体方面，RNA聚合酶为RNA 特异性核糖核巧酸转移酶。该些聚合酶全部表示模板依赖性聚合酶的家族。
[0120] 就酶可W将特异性同聚序列添加至核酸的3'末端来说，可用于实践本发明的酶 的非限制性实例包括但不限于：末端脱氧核巧酸转移酶（TdT)、大肠杆菌聚（A)聚合酶、粟 酒裂殖酵母聚扣）聚合酶W及酵母聚（A)聚合酶。将重复序列添加至衬底的3'末端可W 通过DNA端粒酶来进行。
[012。 可用于实践本文所公开的方法的其它聚合酶包括但不限于；Deep VentR? DNA聚 合酶、LongAmp? Taq DNA聚合酶、Phusion?高保真DNA聚合酶、化usion?热启动高保真 DNA聚合酶、Verrt民參DNA聚合酶、DyNAzyme? II热启动DNA聚合酶、Phire?热启动DNA聚 合酶、Crimson LongAmp? Taq DNA 聚合酶、DyNAzyme? EXT DNA 聚合酶、LongAmp? Taq DNA 聚合酶、具有标准化q (不含Mg)缓冲液的化q DNA聚合酶、具有标准Taq缓冲液的化q DNA 聚合酶、具有化ermo化1 II (不含Mg)缓冲液的化q DNA聚合酶、具有化ermoPol缓冲液的 Taq DNA聚合酶、化imson化q? DNA聚合酶、具有（不含Mg)缓冲液的化imson化q? DNA 聚合酶、VentR? (外切）DNA 聚合酶、Hemo Klenl'aq?、Dwp VentR?(外切）DNA 聚合酶、 Pro化Script彩AMV第一链cDNA合成试剂盒、ProtoScript? M-MuLV第一链cDNA合成试剂 盒、Bst DM聚合酶、全长Bst DM聚合酶、具有化ermoPol缓冲液的大片段化q DM聚合 酶、9。Nm DNA聚合酶、Crimson "Taq? DNA聚合酶、具有（不含Mg)缓冲液的Crimson "Taq? DM聚合酶、Deep VentR?(外切）DNA聚合酶、Deep VentR? DM聚合酶、DyNAzyme? EXT DM 聚合酶、DyNA巧me? II热启动DM聚合酶、Hemo KlenTaq?、Phusion?高保真DM聚合酶、 Phusion?热启动高保真DM聚合酶、Sulfolobus DM聚合酶IV、Therminator?yDNA聚合 酶、Therminator? dm聚合酶、Therminator? II dm聚合酶、Therminator? III DM聚合 酶、Veil化雷DM聚合酶、Ven化⑩（外切DM聚合酶、Bst DM聚合酶、大片段DM聚合酶 I (大肠杆菌）、DNA聚合酶I、大Odenow)片段、Klenow片段（3' - 5'外切）、地i29DNA 聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶（未修饰）、逆转录酶和RNA聚合酶、AMV逆转录酶、 M-MuLV逆转录酶、phi6RNA聚合酶巧dRP)、SP6RNA聚合酶W及T7RNA聚合酶。
[0122] 可用于实践本发明的方法的连接酶包括但不限于；T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、 大肠杆菌DNA连接酶W及大肠杆菌RNA连接酶。
[0123] 衰减子分子
[0124] 本发明提供包含衰减子分子（本文可与"衰减子多核巧酸"互换使用）的组合物 和方法。在各个方面，衰减子为多核巧酸、固定的分子、多肤、多糖、线性分子、环状分子、单 链分子、部分双链分子、肤核酸、裂權多糖、锁核酸和/或其组合。
[0125] 添加至衬底多核巧酸的核巧酸的数量取决于反应进行时所处的条件。在一些方 面，衰减子分子是与利用组合物中的聚合酶活性来添加至衬底多核巧酸的序列杂交的多核 巧酸，其中添加至衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本上等于尾部序列可W与之缔合的衰减 子分子中的核巧酸的数量。在一些方面，添加至衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本上等于 尾部序列可W与之缔合的衰减子分子中的核巧酸的数量的倍数。通过举例并且非限制性 地，如果衰减子分子的长度为13个核巧酸，那么添加至衬底多核巧酸的核巧酸的数量基本 上为13个核巧酸。然而，取决于反应进行时所处的条件，添加至衬底多核巧酸的核巧酸的 数量为13的倍数，或基本上为26 (衰减子分子长度的两倍），或基本上为39 (衰减子分子长 度的H倍），或基本上为52 (衰减子分子长度的四倍）或衰减子分子长度的更多倍。因此， 在一些方面，衬底多核巧酸的尾部序列与一个W上衰减子分子相互作用。在一些方面，添加 至衬底多核巧酸尾部的核巧酸的数量小于衰减子分子的长度。
[0126] 在一些方面，添加至衬底多核巧酸的核巧酸的数量不由衰减子的长度决定，而是 由反应进行时所处的温度和/或盐浓度决定。在一些方面，较高的温度和较低的盐浓度将 使更多的核巧酸添加至衬底多核巧酸的尾部。设想的是，添加至衬底多核巧酸尾部的核巧 酸的数量将一直增加直到达到某一数量，所述数量由衬底多核巧酸与衰减子分子之间形成 稳定双链体时所处的条件（即，温度和/或盐浓度）决定。用衰减子分子形成稳定的双链 体抑制了核巧酸进一步添加至衬底多核巧酸的尾部，并且因此稳定双链体的Tm规定了添加 至衬底多核巧酸尾部的核巧酸的数量。
[0127] 在另外的实施方案中，衰减子分子进一步包含如下文描述的衔接子序列。在其中 衰减子分子为多核巧酸的方面，预期的是多核巧酸的同聚部分是"衰减子"部分。在其中多 核巧酸包含除了同聚序列之外的核巧酸的方面，多核巧酸本文称为"衰减子-衔接子"分 子。另外的核巧酸可w是同一多核巧酸的部分，或可w存在于彼此杂交的两个单独的多核 巧酸中。因此，在另外的实施方案中，衰减子分子和衔接子分子（其包含衔接子序列）是至 少部分杂交在一起的两个单独的多核巧酸。在各种实施方案中，单个多核巧酸包含衰减子 部分和衔接子序列。在各个方面，多核巧酸形成发夹结构W产生部分双链的多核巧酸。在 该个发夹构型中，衰减子部分是单链的，并且衔接子序列是双链的。
[012引在另外的实施方案中，衰减子或衰减子-衔接子分子包含二核巧酸聚合物序列而 非同聚物序列。因此，在各种实施方案中，本发明预期衰减子的二核巧酸部分包含多个随 机序列，所述随机序列包含W下二核巧酸组合；（i) dG或dC ; (ii) dA或dT ; (iii) dG或dT ; (iv) dG或dA ; (V) dA或dC ;或（Vi) dC或dT。在各种实施方案中，二核巧酸序列包含核糖核 巧酸与脱氧核糖核巧酸的混合物。在该些实施方案中，进一步预期用于加尾反应的核巧酸 混合物包括与衰减子的同聚部分中所使用的那些互补的核巧酸。在加尾过程期间，生成了 包含与二核巧酸衰减子互补的二核巧酸的多个随机尾部序列。在本发明中，参考同聚物序 列或同聚物或二核巧酸序列描述了各种实施方案。然而，本领域工作人员或技术人员将认 识到，在仅描述了一种同聚物的情况下，可W使用如本文所描述的具有修饰的二核巧酸序 列来容易地执行所述方法。
[0129] 在另外的实施方案中，衰减子或衰减子-衔接子分子进一步包含位于其3'末端的 另外的序列，其中另外的序列不是同聚物或二核巧酸序列，但包含随机核巧酸序列，所述随 机核巧酸序列在各个方面包含核糖核巧酸、脱氧核糖核巧酸或其组合。另外的随机序列的 长度为约1个核巧酸至约50个核巧酸或更多，或约1个核巧酸至约5个核巧酸，或约1个 核巧酸至约10、20、30、40或50个核巧酸，或约5个核巧酸至约10个核巧酸，或约4个核 巧酸至约7个核巧酸，或约5个核巧酸至约15个核巧酸，或约10个核巧酸至约15个核巧 酸，或长度为约10个核巧酸至约20、30、40或50个核巧酸，或约5个核巧酸至约10、20、30、 40或50个核巧酸，或长度为约10个核巧酸至约20、30、40或50个核巧酸，或长度为约20 个核巧酸至约30、40或50个核巧酸。在另外的实施方案中，另外序列的长度为约1个、约 2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、 约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22 个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个、约30个、约31个、约 32个、约33个、约34个、约35个、约36个、约37个、约38个、约39个、约40个、约41个、 约42个、约43个、约44个、约45个、约46个、约47个、约48个、约49个、约50个或更多 个核巧酸。在另外的实施方案中，另外序列的长度为至少约1个、至少约2个、至少约3个、 至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、 至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约 17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、 至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个、至少约 30个、至少约31个、至少约32个、至少约33个、至少约34个、至少约35个、至少约36个、 至少约37个、至少约38个、至少约39个、至少约40个、至少约41个、至少约42个、至少约 43个、至少约44个、至少约45个、至少约46个、至少约47个、至少约48个、至少约49个、 至少约50个或更多个核巧酸。在另外的实施方案中，另外序列的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 或更多个核巧酸。
[0130] 将理解，并非给定反应中所使用的所有衰减子或衰减子-衔接子分子的大小都是 统一的。因此，在各种实施方案中，衰减子分子的同聚物部分和另外序列部分的长度各自为 约1个核巧酸至约500个核巧酸。在另外的实施方案中，本发明预期，为多核巧酸的衰减子 分子包含同聚物部分和另外序列部分，它们各自为至少1个核巧酸到至多约5、10、20、30、 50、100、200、300或500个核巧酸，至少2个核巧酸到至多约5、10、20、30、50、100、200、300 或500个核巧酸，至少5个核巧酸到至多约10、20、30、50、100、200、300或500个核巧酸，至 少5个核巧酸到至多约10、15、20、25、30、35、40、45或50个核巧酸，至少10个到至多约15、 20、25、30、35、40、45 或 50 个核巧酸，至少 10 个到至多约 20、30、40、50、100、200、300 或 500 个核巧酸，至少20个到至多约30、40、50、100、200、300或500个核巧酸，至少50个到至多 约70、100、200、300或500个核巧酸或至少50个到至多约100、300、400或500个核巧酸。
[0131] 预期的是，如本文所使用的"杂交"涵盖衰减子分子与衬底多核巧酸的尾部序列之 间的任何缔合。通过举例并且非限制性地，缔合可能起因于Watson-hick碱基配对，或衰 减子分子与衬底多核巧酸如DNA、RNA W及肤核酸（PNA)之间的其它类型的碱基配对。
[0132] 在一些实施方案中，衰减子分子为多核巧酸并且所述多核巧酸在严格的条件下与 衬底多核巧酸的尾部部分杂交。如本文所使用的"严格的条件"可W由本领域普通技术人 员实验测定，并且将基于（例如但不限于）衰减子分子和衬底多核巧酸尾部序列的长度、衰 减子分子和衬底多核巧酸的浓度、杂交缓冲液中的盐浓度（即，离子强度）、执行杂交时所 处的温度、执行杂交的时间长度，W及影响衰减子分子和衬底多核巧酸尾部序列的表面电 荷的因素的存在而发生变化。一般来说，严格条件是其中衬底多核巧酸的尾部序列相对于 衰减子分子的任何其它区域来说能够优先并W较高亲和力结合至其互补序列的那些条件。 用于与具有20个碱基的衬底多核巧酸序列的尾部序列的其补体杂交的示例性严格的条件 包括但不限于约50mM盐（Na+) W及约6(TC的退火温度。对于更长的序列来说，在更高的温 度下实现特异性杂交。一般来说，严格的条件为使得退火在低于衬底多核巧酸的解链温度 约5C下执行的条件。"解链温度"是与衬底多核巧酸互补的衰减子分子的50%在平衡时在 限定的离子强度、抑W及浓度下与衬底多核巧酸解离时所处的温度。如下文进一步描述， 在各个方面，进行杂交和延伸时所处的温度与核巧酸至衬底多核巧酸的添加相关。
[0133] 在某些实施方案中，在衰减子分子为多核巧酸的情况下，衰减子多核巧酸是单链 的或至少部分双链的，因为双链多核巧酸能够与添加至衬底多核巧酸的尾部序列缔合。在 另外的实施方案中，衰减子分子为环状分子，所述环状分子包含能够与添加至衬底多核巧 酸的尾部序列缔合的同聚核巧酸序列。
[0134] 在另外的实施方案中，为多核巧酸的衰减子分子包含选自由W下组成的组的核巧 酸；2' -脱氧胸巧5' - 一磯酸（dTMP)、2' -脱氧鸟巧5' - 一磯酸（dGMP)、2' -脱氧腺巧5' - 一 磯酸（dAMP)、2' -脱氧胞巧5' - 一磯酸（dCMP)、2' -脱氧尿巧5'- -磯酸（dUMP)、胸巧一磯 酸（TMP)、鸟巧一磯酸佑MP)、腺巧一磯酸（AMP)、胞巧一磯酸（CMP)、尿巧一磯酸扣MP)、碱基 类似物W及其组合。还预期的是，衰减子分子多核巧酸包含如本文所定义的修饰的核巧酸。
[0135] 在相关方面，衰减子分子包含同聚分子，如聚2'-脱氧腺巧5'-一磯酸（dAMP)(聚 dA)、聚2' -脱氧胸巧5' - 一磯酸（dTMP)(聚dT)、聚2' -脱氧胞巧5' - 一磯酸（聚dC)、聚 2' -脱氧鸟巧5' - 一磯酸（聚dG)、聚2' -脱氧尿巧5' - 一磯酸（聚加)、聚腺巧一磯酸（聚 rA)、聚尿巧一磯酸（聚U)、聚胞巧一磯酸（聚rC)、聚鸟巧一磯酸（聚rG)或包含dA与rA 碱基，或dT、加与U碱基，或dC与rC碱基，或dG与rG碱基的组合的杂聚分子。
[0136] 在各个方面，衰减子分子包含1、5、10、20、30、50、100或更多个核巧酸。事实上，本 发明预期为多核巧酸的衰减子分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、 240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、：340、350、360、370、380、390、400、410、420、 430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、 620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、 810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、 1000或更多个核巧酸。在另外的实施方案中，本发明预期为多核巧酸的衰减子分子包含至 少1个核巧酸到至多约5、10、20、50、100、200、500或1000个核巧酸，至少2个核巧酸到至 多约5、10、20、50、100、200、500或1000个核巧酸，至少5个核巧酸到至多约10、20、50、100、 200、500或1000个核巧酸，至少5个核巧酸到至多约10、15、20、25、30、35、40、45或50个核 巧酸，至少10个到至多约15、20、25、30、35、40、45或50个核巧酸，至少10个到至多约20、 30、40、50、100、200、500 或 1000 个核巧酸，至少 20 个到至多约 30、40、50、100、200、500 或 1000个核巧酸，至少50个到至多约70、100、200、500、700或1000个核巧酸或至少50个到 至多约100、500、750、800或1000个核巧酸。
[0137] 在各个方面，衰减子分子包含封闭基团。如本文所使用的封闭基团是阻止通过酶 进行的延伸的部分，所述酶能够通过添加核巧酸合成多核巧酸。封闭基团包括但不限于；磯 酸基团、双脱氧核巧酸、核糖核巧酸（在使用TdT酶的方面）、脱氧核巧酸（在使用聚（A)和 /或聚扣）聚合酶的方面）、氨基、H碳或六碳己二醇间隔区（并且在一方面，六碳己二醇间 隔区为己二醇）W及反向脱氧胸巧（dT)。
[013引在本发明的另一方面，衰减子分子是可降解的。在各个方面，可降解的衰减子分子 包含加碱基并且降解是通过与加糖基化酶接触，之后在高于8(TC的温度下赔育，或通过与 加糖基化酶与脱嘿岭/脱嚼巧核酸内切酶的混合物接触而引起的。
[0139] 还预期的是，在一些实施方案中，衰减子分子包含核糖核巧酸并且具有可用核糖 核酸酶降解的序列。在各个方面，在对于核糖核酸酶活性充足的条件下，核糖核酸酶选自由 W下组成的组；RNase H、RNase HII、RNase AW及RNase T1。在相关方面，衰减子分子包 含脱氧核糖核巧酸并且具有可用DNA特异性核酸酶降解的序列。在一些方面，DNA特异性 核酸酶为面ase I。
[0140] 在另外的实施方案中，衰减子分子进一步包含衔接子序列、鉴定标签序列或两者。 "衔接子序列"提供用于核酸片段的扩增和测序的引发序列并且在一些方面用于下一代测 序应用。在另外的方面，"衔接子序列"用作用于RNA分子的生成的启动子序列，其中启动子 序列为例如但不限于T7启动子序列或SP6启动子序列。本领域中已知的任何RNA启动子 设想为衔接子序列。
[0141] 在一些实施方案中，"鉴定标签序列（identifier tag sequence)"是独特地鉴定特 定衬底或衰减子分子的序列。在一方面，鉴定标签序列为条形码。
[0142] 在一些方面，衰减子分子为多肤。如本文所使用的，术语"多肤"是指肤、蛋白质、 氨基酸的聚合物W及天然衍生、合成产生或重组产生的抗体。多肤还包括脂蛋白和翻译后 修饰的蛋白质，例如像糖基化蛋白W及具有D-氨基酸、修饰的、衍生的或非天然存在的呈 D-或k构型的氨基酸和/或肤模拟单元作为其结构的部分的蛋白质或蛋白物质。
[0143] 对于蛋白质来说，所预期的衰减子分子包括全长蛋白质W及其片段，所述片段保 留了全长蛋白质的所需特性。还设想了融合蛋白，其包括其中一个融合补体为片段或模拟 物的融合蛋白。
[0144] 抗体衰减子分子包括全长抗体的片段和衍生物。具体涵盖的片段和衍生物包括但 不限于；F油'片段、F(油)2片段、Fv片段、化片段、一个或多个互补决定区（CDR)片段、单 独重链、单独轻链、二聚重链和轻链（与完整抗体中发现的异四聚重链和轻链相反）、单链 抗体（scAb)、人源化抗体（W及W人源化抗体的方式修饰但所得的抗体与非人物种中的抗 体更为相似的抗体）、馨合重组抗体（CRAB)、双特异性抗体和多特异性抗体，W及本领域中 已知的其它抗体衍生物或片段。
[0145] DNA和RNA结合蛋白预期用于本发明的方法和组合物中。DNA结合蛋 白是包含DNA结合结构域并且因此对单链DNA具有特定或一般亲和力的蛋白 质[Travers,DNA-protein Interactions.Springer, 1993 ；Pabo 等,Protein-DNA recognition. Annu Rev Biochem. . 53:293-321(1984)]。结合至同聚序列的多 肤是本领域中已知的[Lobanenkov 等，Eur J Biochem. 159(1):181-8 (1986); Travers, Annu Rev Biochem, 58:427-452(1989) ;0strowski 等，Proc.P'Jatl. Acad. Sci. 扣SA) 98 (16) : 9044-9049 (2001)]，并且预期用于本文。
[0146] RNA结合蛋白通常是通过RNA识别基序（RRM)与双链或单链RNA缔合的胞质蛋白 和核蛋白。RNA结合蛋白可W调节RNA的翻译W及翻译后事件，例如但不限于RNA剪接和 编辑。RNA结合蛋白的一些实例包括但不限于结合RNA的翻译起始因子、聚A-结合蛋白、 snRNP W及双链的RNA特异性腺巧脱氨酶（ADAR)。
[0147] 本发明预期的另一种类型的衰减子分子是裂權多糖，其可W与聚（C)、聚（A)、聚 (dA) W及聚（dT)同聚物形成非Watson-化ick型大分子复合物。裂權多糖（SPG)是分别 在水中作为H螺旋存在并且在二甲基亚讽值MS0)中作为单链存在的天然目-(1，3)-D-葡 聚糖[Matsumoto 等，Biochim Bio 地 ys Acta.l670(2):91-104(2004)]。裂權多糖通过 目-1,6-糖巧键而具有葡萄糖侧链。已显示，裂權多糖可W与单链多核巧酸形成复合物。 在多核巧酸的存在下，单链SPG在水溶液中形成由两个SPG链和一个多核巧酸链组成的 H链复合物。裂權多糖可W通过氨键合和疏水性相互作用来与单链多核巧酸形成H链 复合物。已显示，多核巧酸在与裂權多糖形成复合物的过程中受到保护而免受核酸酶攻 击，并且裂權多糖提高了反义效率[Sakurai等，Nucleic Acids Research Supplement No. 1:223-224(2001)]〇
[014引不管衰减子分子的类型如何，预期的是，在一些方面，如下文所描述将衰减子分子 固定在支持物上。
[0149] 衬底多核巧酸
[0150] 衬底多核巧酸是如下文所描述的多核巧酸、修饰的多核巧酸或其组合。在各种实 施方案中，衬底多核巧酸为DM、RNA或其组合。尾部添加至其上的衬底多核巧酸是单链或 双链的。在另外的方面，衬底多核巧酸可W是H螺旋、G-四联体或其它多链结构。在另一 个实施方案中，衬底多核巧酸是经过化学处理的核酸，包括但不限于其中衬底多核巧酸是 通过NGS检测甲基化状态的经过亚硫酸氨盐处理的DNA的实施方案。
[0151] 预期的是，衬底多核巧酸是从天然存在的来源获得的或它们可W是合成的。天然 存在的来源是来自原核生物或真核生物的RNA和/或基因组DNA。通过举例并且非限制性 地，来源可W是人、小鼠、病毒、植物或细菌。在各个方面，衬底多核巧酸被加尾，W用于涉及 微阵列的测定并且产生用于下一代核酸测序的文库。加尾的衬底多核巧酸还可W用于DNA 和RNA的有效克隆。
[0152] 如果衬底多核巧酸的来源是基因组DNA，预期的是，在一些实施方案中，在进行加 尾之前将基因组DNA片段化。基因组DNA的片段化是本领域技术人员已知的一般程序，并且 例如但不限于通过W下各项在体外进行；剪切DNA(使DNA雾化），用核酸内切酶裂解DNA， 超声处理DNA，加热DNA，使用a、目、y或其它放射源来福射DNA，光照，在金属离子的存在 下化学裂解DNA，放射裂解W及其组合。基因组DNA的片段化还可W例如但不限于由于调 亡、放射和/或暴露于石棉而在体内发生。根据本文所提供的方法，不要求衬底多核巧酸群 体具有统一大小。因此，本发明的方法有效用于不同大小的衬底多核巧酸片段的群体。
[0153] 如本文所公开，衬底多核巧酸是单链的或双链的并且包含3'突出。在一些方面， 衬底多核巧酸是双链的并且包含平末端。在其它方面，双链衬底多核巧酸包含3'凹陷末 端。在所有方面，衬底多核巧酸包含游离的3'轻基。衬底多核巧酸的突出末端或凹陷末端 的长度可W变化。在各个方面，衬底多核巧酸的突出末端或凹陷末端的长度为1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10或更多个核巧酸。在具体方面，长度为3个核巧酸的3'突出比长度为2个核巧 酸或长度为1个核巧酸的3'突出对衬底多核巧酸更有效。在各个方面，衬底多核巧酸群体 包括其中单个反应中存在一个W上上文提及的衬底多核巧酸类型的那些。
[0154] 在一些实施方案中，预期的是，衬底多核巧酸如下文所述固定在固体表面上。在一 方面，衬底多核巧酸的固定由如下文所描述的其与衰减子-衔接子分子的连接造成。
[0155] 衬底多核巧酸的长度预期介于约3个与约IxlO6个核巧酸之间。在一些方面，衬底 多核巧酸的长度介于约10个与约3000个核巧酸之间，或介于约40个与约2000个核巧酸之 间，或介于约50个与约1000个核巧酸之间，或介于约100个与约500个核巧酸之间，或介于 约1000个与约5000个核巧酸之间，或介于约10, 000个与50, 000个核巧酸之间，或介于约 100, 000个与lxl〇6个核巧酸之间。在另外的方面，衬底多核巧酸的长度为至少3个到至多 约50、100或1000个核巧酸；或至少10个到至多约50、100或1000个核巧酸；或至少100个 到至多约1000、5000或10000个核巧酸；或至少1000个到至多约10000、20000 W及50000 个核巧酸；或至少10000个到至多约20000、50000 W及100, 000个核巧酸；或至少20000 个到至多约100, 000、200, 000或500, 000个核巧酸；或至少200, 000个到至多约500, 000、 700, 000或1，000, 000个核巧酸。在各个方面，衬底多核巧酸的长度为约6、约7、约8、约9、 约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、 约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、 约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、 约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、 约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、 约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约 94、约 95、约 96、约 97、约 98、约 99、约 100、约 110、约 120、约 130、约 140、约 150、约 160、约 170、约 180、约 190、约 200、约 210、约 220、约 230、约 240、约 250、约 260、约 270、约 280、约 290、约 300、约 310、约 320、约 330、约 340、约 350、约 360、约 370、约 380、约 390、约 400、约 410、约 420、约 430、约 440、约 450、约 460、约 470、约 480、约 490、约 500、约 510、约 520、约 530、约 540、约 550、约 560、约 570、约 580、约 590、约 600、约 610、约 620、约 630、约 640、约 650、约 660、约 670、约 680、约 690、约 700、约 710、约 720、约 730、约 740、约 750、约 760、约 770、约 780、约 790、约 800、约 810、约 820、约 830、约 840、约 850、约 860、约 870、约 880、约 890、约 900、约 910、约 920、约 930、约 940、约 950、约 960、约 970、约 980、约 990、约 1000、 约 1100、约 1200、约 1300、约 1400、约 1500、约 1600、约 1700、约 1800、约 1900、约 2000、 约 2100、约 2200、约 2300、约 2400、约 2500、约 2600、约 2700、约 2800、约 2900、约 3000、 约 3100、约 3200、约 3300、约 3400、约 3500、约 3600、约 3700、约 3800、约 3900、约 4000、约 4100、约 4200、约 4300、约 4400、约 4500、约 4600、约 4700、约 4800、约 4900、约 5000、10, 000、 15, 000、20, 000、50, 000、100, 000、150, 000、200, 000、250, 000、300, 000、350, 000、400, 000、 450, 000、500, 000、550, 000、600, 000、650, 000、700, 000、750, 000、800, 000、850, 000、 900, 000、950, 000、1，000, 000 或更多个核巧酸。
[0156] 多核巧酸
[0157] 如本文所使用的术语"多核巧酸"和"核巧酸"或复数形式可与如本文所论述和本 领域中另外已知的修饰形式互换。如本文所描述的多核巧酸是指衰减子多核巧酸或衬底多 核巧酸，并且在各种实施方案中，包含脱氧核糖核巧酸、核糖核巧酸或其组合。在另外的实 施方案中，包含核糖核巧酸、脱氧核糖核巧酸或其组合的衰减子多核巧酸与为DNA或RNA的 衬底多核巧酸结合使用。
[0158] 在某些情况下，本领域使用术语"核碱基"，其包括天然存在的核巧酸W及可W 聚合的核巧酸的修饰物。因此，核巧酸或核碱基指的是天然存在的核碱基腺嘿岭（A)、鸟 嘿岭佑)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼巧（T)和尿嚼巧扣)，W及非天然存在的核碱基，如黄嘿岭、 二氨基嘿岭、8-氧代-N6-甲基腺嘿岭、7-脱氮黄嘿岭、7-脱氮鸟嘿岭、M，M-桥亚己基 胞嚼巧、矿，矿-桥亚己基-2,6-二氨基嘿岭、5-甲基胞嚼巧〇11〇、5-咕-〔6)-快基-胞 嚼巧、5-氣尿嚼巧、5-漠尿嚼巧、假异胞嚼巧、2-轻基-5-甲基-4- H哇并化巧、异胞嚼 巧、异鸟嘿岭、肌巧，W及Benner等，美国专利号5,432,272 W及Susan M.化eier和 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research,第 25 卷：第 4429-4443 页中所描 述的"非天然存在的"核碱基。术语"核碱基"还不仅包括已知的嘿岭和嚼巧杂环类，而 且包括其杂环类似物和互变异构体。另外的天然和非天然存在的核碱基包括美国专利号 3, 687, 808 (Merigan 等）；Sanghvi 的第 15 章 ，Antisense Research and Application, S. T. Crooke 和 B. Lebleu 编著，CRC Press, 1993 击nglisch 等，1991, Angewan化e Qiemie, 国际版本，30:613-722 (特别参见第622页和第623页，并且参见Concise Encyclopedia of 聚 mer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz 编著，John Wiley&Sons, 1990,第 858-859 页，Cook, Anti-Cancer Drug Desi即 1991，6, 585-607,所述文献各自 W引用的方 式整体并入本文）中公开的那些。在各个方面，多核巧酸还包括一种或多种"核巧碱基"或 "碱基单元"，其包括可w充当核碱基的化合物如杂环化合物，所述核碱基包括虽然在最传 统意义上不是核巧碱基但是却充当核巧碱基的某些"通用碱基"。通用碱基包括3-硝基化 咯、任选取代的剛巧（例如5-硝基剛巧）W及任选取代的次黄嘿岭。其它理想的通用碱基 包括化咯、二哇或H哇衍生物，包括本领域中已知的那些通用碱基。
[0159] 多核巧酸还可包括修饰的核碱基。"修饰的碱基"在本领域中应理解成可W与天 然碱基（例如，腺嘿岭、鸟嘿岭、胞嚼巧、尿嚼巧和/或胸腺嚼巧）配对和/或可W与非天 然存在的碱基配对的碱基。示例性的修饰的碱基在EP 1072679和W0 97/12896中有所 描述，所述专利的公开内容W引用的方式并入本文。修饰的核碱基包括但不限于：5-甲基 胞嚼巧巧-me-C)，5-轻甲基胞嚼巧，黄嘿岭，次黄嘿岭，2-氨基腺嘿岭，腺嘿岭和鸟嘿岭的 6-甲基W及其它焼基衍生物，腺嘿岭和鸟嘿岭的2-丙基W及其它焼基衍生物，2-硫代尿 嚼巧、2-硫代胸腺嚼巧和2-硫代胞嚼巧，5-团代尿嚼巧和5-团代胞嚼巧，5-丙快基尿嚼 巧和5-丙快基胞嚼巧W及嚼巧碱基的其它快基衍生物，6-偶氮尿嚼巧、6-偶氮胞嚼巧和 6-偶氮胸腺嚼政5-尿嚼巧（假尿嚼巧），4-硫代尿嚼政8-团代基、8-氨基、8-硫醇基、 8-硫代焼基、8-轻基和其它8-取代的腺嘿岭和鸟嘿岭，5-团代基尤其是5-漠基、5- H 氣甲基和其它5-取代的尿嚼巧和胞嚼巧，7-甲基鸟嘿岭和7-甲基腺嘿岭，2-F-腺嘿岭， 2-氨基腺嘿岭，8-氮鸟嘿岭和8-氮腺嘿岭，7-脱氮鸟嘿岭和7-脱氮腺嘿岭W及3-脱 氮鸟嘿岭和3-脱氮腺嘿岭。另外的修饰的碱基包括H环嚼巧类，如吩嗯嗦胞巧（1H-嚼 巧并5, 4-b] [1，4]苯并嗯嗦2(3H) -丽）、吩喔嗦胞巧（1H-嚼巧并[5, 4-b] [1，4]苯并喔 嗦-2 (3H)-丽）、G-形谢如取代的吩嗯嗦胞巧（例如9-(2-氨基己氧基）-H-嚼巧并[5, 4-b] [1，4]苯并嗯嗦-2 (3H)-丽）、巧哇胞巧（2H-嚼巧并[4, 5-b]剛巧-2-丽）、化巧并剛巧胞 巧（H-化巧并[3'，2' ：4, 5]化咯并[2, 3-d]嚼巧2-丽）。修饰的碱基还可包括其中嘿岭 或嚼巧碱基被其它杂环类替代的那些碱基，例如7-脱氮腺嘿岭、7-脱氮鸟嘿岭、2-氨基化 巧W及2-化巧丽。另外的核碱基包括美国专利号3, 687, 808中公开的那些，The Concise Encyclopedia Of polymer Science And Engineering,第 858-859 页，Kroschwitz, J. I., 编著，John Wil巧&Sons, 1990 中公开的那些，Elnglisch 等，1991, Angewan化e Qiemie,国 际版本，30:613 中公开的那些，W 及 San 曲 vi,Y.S.,第15 章 ，Antisense Research and Applications,第 289-302 页，Crooke, S. T.和 Lebleu, B.,编著，CRC Press, 1993 中公开 的那些。该些碱基中的某些碱基适用于提高结合亲和力并且包括5-取代的嚼巧、6-氮杂 嚼巧W及N-2、N-6和0-6取代的嘿岭，包括2-氨丙基腺嘿岭、5-丙快基尿嚼巧W及5-丙 快基胞嚼巧。5-甲基胞嚼巧取代物已显示出将核酸双链体的稳定性提高0. 6°C至1. 2°C 并且在某些方面与2' -0-甲氧基己基糖修饰物结合。参见美国专利号3, 687, 808、美国 专利号 4, 845, 205、5, 130, 302、5, 134, 066、5, 175, 273、5, 367, 066、5, 432, 272、5, 457, 187、 5, 459, 255、5, 484, 908、5, 502, 177、5, 525, 711、5, 552, 540、5, 587, 469、5, 594, 121、 5, 596, 091、5, 614, 617、5, 645, 985、5, 830, 653、5, 763, 588、6, 005, 096、5, 750, 692 W 及 5, 681，941，所述专利的公开内容W引用的方式并入本文。
[0160] 制备具有预定序列的多核巧酸的方法是众所周知的。参见例如Sambrook 等，Molecular Cloning:A L油oratory Manual(第 2 版，1989) W 及 F. Eckstein(编 著)Oligonucleotides and Analogues,第 1 片反，（Oxford University Press, New York, 1991)。固相合成方法对于多聚核糖核巧酸和多聚脱氧核糖核巧酸来说均为优选的 (合成DM的众所周知的方法也适用于合成RNA)。多聚核糖核巧酸还可通过酶法进行制 备。也可W将非天然存在的核碱基引入多核巧酸中。参见例如美国专利号7, 223, 833; Katz, J. Am. Chem.Soc., 74:2238(1951) ;Yamane 等，J. Am. Chem.Soc., 83:2599(1961); Kosturko 等，Biochemistir, 13:3949(1974) ;Thomas,J. Am. Qiem.Soc. ,76:6032(1954); Zhang 等，J. Am. Chem. Soc. , 127: 74-75 (2005) ； W 及 Zimmermann 等，J. Am. Chem. Soc.， 124:13684-13685(2002)。
[0161] 修饰的多核巧酸
[0162] 修饰的多核巧酸预期用于衰减子分子或用于衬底多核巧酸，其中多核巧酸中的核 巧酸单元的一个或多个糖和/或一个或多个核巧酸间键被"非天然存在的"基团替代。在 一方面，本实施方案涵盖了肤核酸（PNA)。在PNA化合物中，用含醜胺的骨架替代多核巧酸 的糖骨架。参见，例如美国专利号5, 539, 082、5, 714, 331和5, 719, 262, W及Nielsen等， Science, 1991，254, 1497-1500,所述文献的公开内容W引用的方式并入本文。
[0163] 预期用于所公开的多核巧酸的核巧酸与非天然核巧酸之间的其它键包括美国专 利号 4, 981，957、5, 118, 800、5, 319, 080、5, 359, 044、5, 393, 878、5, 446, 137、5, 466, 786、 5, 514, 785、5, 519, 134、5, 567, 811、5, 576, 427、5, 591，722、5, 597, 909、5, 610, 300、 5, 627, 053、5, 639, 873、5, 646, 265、5, 658, 873、5, 670, 633、5, 792, 747 W 及 5, 700, 920 ;美 国专利公布号20040219565 ;国际专利公布号W0 98/39352和W0 99/14226 ;Mesmaeker 等，Current Opinion in Structural Biology 5:343-355 (1995) W 及 Susan M. Freier 和 Karl-Heinz Altmann, Nucleic Acids Research, 25:4429-4443(1997)中描述的那些，所述 文献的公开内容W引用的方式并入本文。
[0164] 多核巧酸的特定实例包括含有修饰的骨架或非天然核巧酸间键的那些多核巧酸。 具有修饰骨架的多核巧酸包括在骨架中保留了磯原子的那些多核巧酸W及在骨架中不具 有磯原子的那些多核巧酸。在其核巧酸间骨架中不具有磯原子的修饰多核巧酸视为处于 "多核巧酸"的含义之内。
[0165] 含有磯原子的修饰的多核巧酸骨架包括，例如，具有通常的3' -5'键的硫代磯酸 醋、手性硫代磯酸醋、二硫代磯酸醋、磯酸H醋、氨焼基磯酸H醋、甲基和其它焼基磯酸醋 (包括3'-帰基磯酸醋、5'-帰基磯酸醋和手性磯酸醋、次磯酸醋）、磯醜胺醋（包括3'-氨 基磯醜胺醋和氨焼基磯醜胺醋、硫撰磯醜胺醋（thionophosphoramidates))、硫撰焼基磯酸 醋（thionoa&5fbhos地onates)、硫撰焼基磯酸H醋（thionoa&5fbhos地otriesters)、砸 代磯酸醋和测代磯酸醋化oranophosphates)、该些修饰的多核巧酸骨架的2' -5'连接的类 似物，W及具有反向极性的那些修饰的多核巧酸骨架，其中一个或多个核巧酸间键为3'至 5'、5'至5'或2'至2'的键。还设想到的是具有反向极性的多核巧酸，其在3' -最末端的 核巧酸间键处包含一个3'至3'的键，即，单个反向核巧酸残基，其可为无碱基的（核巧酸 丢失或被轻基代替）。所设想的还有盐类、混合盐类W及游离酸形式。
[0166] 可教导制备上述含磯的键的代表性美国专利包括：美国专利号3, 687,808、 4, 469, 863、4, 476, 301、5, 023, 243、5, 177, 196、5, 188, 897、5, 264, 423、5, 276, 019、 5, 278, 302、5, 286, 717、5, 321，131、5, 399, 676、5, 405, 939、5, 453, 496、5, 455, 233、 5, 466, 677、5, 476, 925、5, 519, 126、5, 536, 821、5, 541，306、5, 550, 111、5, 563, 253、 5, 571，799、5, 587, 361、5, 194, 599、5, 565, 555、5, 527, 899、5, 721，218、5, 672, 697 和 5, 625, 050,所述专利的公开内容W引用的方式并入本文。
[0167] 不包括磯原子的经过修饰的多核巧酸骨架具有由短链焼基或环焼基核巧间键、混 合的杂原子和焼基或环焼基核巧间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核巧间键形成的骨 架。该些骨架包括；具有吗晰键的骨架；娃氧焼骨架；硫化物、亚讽和讽骨架；甲醜己醜基 和硫代甲醜己醜基骨架；亚甲基甲醜己醜基和硫代甲醜己醜基骨架；核糖己醜基骨架；含 帰姪的骨架；氨基賴酸醋骨架；亚甲基亚胺基和亚甲基脱基骨架；賴酸醋和賴醜胺骨架；醜 胺骨架；W及其它具有混合的N、0、S和CH2组成部分的骨架。在其它实施方案中，多核巧 酸具有硫代磯酸醋骨架，并且寡核巧具有杂原子骨架，并且包括在美国专利号5, 489, 677 和 5, 602, 240 中所描述的-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N(CH3)-0-CH2-、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2-N (CH3)-N(CH3)-CH2- W及-0-N(CH3)-CH2-CH2-。参见例如美国专利号 5, 034, 506、5, 166, 315、 5, 185, 444、5, 214, 134、5, 216, 141、5, 235, 033、5, 264, 562、5, 264, 564、5, 405, 938、 5, 434, 257、5, 466, 677、5, 470, 967、5, 489, 677、5, 541，307、5, 561，225、5, 596, 086、 5, 602, 240、5, 610, 289、5, 602, 240、5, 608, 046、5, 610, 289、5, 618, 704、5, 623, 070、 5, 663, 312、5, 633, 360、5, 677, 437、5, 792, 608、5, 646, 269 W及 5, 677, 439,所述专利的公 开内容W引用的方式整体并入本文。
[016引在各种形式中，多核巧酸中两个相连的单体之间的键由2至4个（理想情况下是 3个）基团/原子组成，所述基团/原子选自-CH2-、-0-、-S-、-NRH-、〉C = 0、乂 = NRH、〉C =S、-SUR")厂、-SO-、-S (0) 2_、-P (0) 2_、-P0 炬&) -、-P 化巧-、-P 做 2_、-P0 (R") -、-P0 (OCH3 )-W及-P0 (NHRH)-，其中RH选自氨和C1-4焼基，并且R"选自C1-6焼基和苯基。所述键的 说明性实例为-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-邸2-邸0护邸2-、-0-邸2-0-、-0-邸2-邸2-、-0-邸2 -CH =(当用作至相连单体的键时包括贴）、-CH2-CH2-0-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-C H2-NRH-CH2-、-O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-C0-0-、-NRH-C0-NRH-、-NRH-CS-NRH-、-NRH-C ( = NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-0-C0-NRH-、-N RH-C0-CH2-、-0-CH2-C0-NRH-、-0-CH2-CH2-NRH-、-CH = N-0-、-CH2-NRH-0-、-CH2_0-N =(当 用作至相连单体的键时包括贴）、-CH2-O-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、 -0-NRH-CH2-、-0-NRH、-0-CH2-S-、-S-CH2-0-、-CH2-CH2-S-、-0-CH2-CH2-S-、-S-CH2_CH =(当 用作至相连单体的键时包括贴）、-S-CH2-CH2-、-S-CH2-CH2-0-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、 -CH2-S0-CH2-、-CH2-S02-CH2-、-0-S0-0-、-0-S (0) 2-0-、-0-S (0)厂甜2-、-0-5 (0) 2-NRH-、-NRH-S ( 0)厂 cHg-; -0-s (0) g-cHg-、-0-p (0) 2_0-、-0-p 化巧-0-、-0-p (S) 2_0-、-S_P (0) 2_0-、-S_P (0, S )-0-、-S_P (S) 2-0-、-0-P (0) 2-S-、-0-P 化巧-S-、-0-P (S) 2-S-、-S_P (0) 2-S-、-S_P (0, S) -S_、 -s-p (S) 2-S-、-0-P0 (R") -0-、-0-P0 (OCH3) -0-、-0-P0 (OCH2CH3) -0-、-0-P0 (OC&C&S-R) PO 炬H3) -0-、-O-PO (NHRN) -0-、-0-P (0) 2-NRHH-、-NRH-P (0) 2-0-、-0-P 化 NRH) -0-、-CH2-P (0) 2-0-、-0-P(0)厂CHg- W及-0_Si (R")2-0-;其中预期了 -CHg-CO-NRH-'-CHg-NRH-O-'-S-CHg-O-、-0-P (0) 2-0-0-P (-0,巧-0-、-0-P (S) 2-0-、-NRHP (0) 2-0-、-0-P (0, NRH) -0-、-0-P(KR") PO (CH3) -0- W及-O-PO (NHRN) -0-，其中RH选自氨和Cl-4焼基，并且R"选自Cl-6焼基和苯 基。Mesmaeker 等，1995, Current Opinion in Structural Biology, 5:343-355 W及 Susan M.Rreier 和 Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research,第 25 卷：第 4429-4443 页中给出了另外的说明性实例。
[0169] 多核巧酸的另外其它修饰形式在美国专利申请号20040219565中有详细描述，所 述专利申请的公开内容w引用的方式整体并入本文。
[0170] 修饰的多核巧酸还可含有一个或多个取代的糖部分。在某些方面，多核巧酸在 2'位置上包含W下中的一个；〇H;F ;0-、S-或N-焼基；0-、S-或N-帰基；0-、S-或N-快 基；或〇-焼基-〇-焼基，其中焼基、帰基W及快基可W是取代或未取代的。至〔1。焼基或 C2至Cl。帰基和快基。其它实施方案包括0[畑2)。0]。邸3、0畑2)。0邸3、0畑2)。畑2、0畑2) 。邸3、0畑2)。0畑2 W及〇畑2)卿[畑2)。0礼，其中0和111为1至约10。其它多核巧酸在2' 位置上包含W下中的一个；C1至CIO低级焼基、取代的低级焼基、帰基、快基、焼芳基、芳焼 基、0-焼芳基或 0-芳焼基、SH、SCHs、0CN、C1、化、CN、CFs、OCF3、SOCH3、SO2CH3、0N02、N02、Ng、 N&、杂环焼基、杂环焼芳基、氨基焼基氨基、多焼基氨基、取代的甲娃焼基、RNA裂解基团、报 告基因基团、嵌入剂、用于改善多核巧酸的药代动力学特性的基团或用于改善多核巧酸的 药效学特性的基团，W及具有类似特性的其它取代基。在一方面，修饰包括2' -甲氧基己 氧基（2' -0-邸2邸20邸3,也称为2'-0-(2-甲氧己基）或2'-M犯）（Martin等，1995，Helv. 化im. Acta, 78:486-504)，即焼氧基焼氧基。其它修饰包括2' -二甲氨基氧基己氧基，即 0(CH2)20N(CH3)2基团，也称为2'-DMA0E，W及2'-二甲氨基己氧基己氧基（在本领域中也 称为 2' -0-二甲基-氨基-己氧基-己基或 2' -DMAE0E)，即 2' -0-CH2-0-CH2-N(CH3)2。 [017。 另外的其它修饰包括2' -甲氧基（2' -O-CH3)、2' -氨丙氧基（2' -OCH2CH2CH2NH2)、 2' -帰丙基（2, -CHg-CH =邸2)、2' -0-帰丙基（2, -Q-CHg-CH =邸2) W及 2'-氣基（2, -F)。 2'-修饰可处于阿拉伯糖（上）位或核糖（下）位。在一方面，2'-阿拉伯糖修饰为2'-F。 还可在多核巧酸的其它位置上进行类似的修饰，例如，在位于3'末端核巧酸上或2' -5'连 接的多核巧酸中的糖的3'位置上W及5'末端核巧酸的5'位置上。多核巧酸还可具有糖 模拟物（如环下基部分）代替戊巧喃糖基糖。参见例如美国专利号4, 981，957、5, 118,800、 5, 319, 080、5, 359, 044、5, 393, 878、5, 446, 137、5, 466, 786、5, 514, 785、5, 519, 134、 5, 567, 811、5, 576, 427、5, 591，722、5, 597, 909、5, 610, 300、5, 627, 053、5, 639, 873、 5, 646, 265、5, 658, 873、5, 670, 633、5, 792, 747 W及 5, 700, 920,所述专利的公开内容 W引 用的方式整体并入本文。
[0172] 另外的修饰包括使遗传密码例如但不限于Iso-dC和Iso-dG延伸的那些修饰。 Iso-dC和Iso-dG分别为胞嚼巧和鸟嘿岭的化学变体。Iso-dC将与Iso-dG而不是与dG氨键 键合。类似地，Iso-dG将与Is〇-dC而不是与dC进行碱基配对[Switzer等，Biochemistry 32:10489-96(1993)]。在该些方面，通过使用聚（iso-dG)衰减子分子来实现通过添加 Iso-dC碱基进行的受控加尾，并且反之亦然。
[0173] 在一方面，糖的修饰包括锁核酸（LNA)，其中2' -轻基连接至糖环的3'或4'碳 原子，从而形成双环糖部分。在某些方面，所述键为桥联2'氧原子和4'碳原子的亚甲基 (-CH2-)n基团，其中n为1或2。LNAW及其制备在W0 98/39352和W0 99/14226中有所描 述，所述专利的公开内容W引用的方式并入本文。
[0174] 标记
[01巧]在本发明的一些方面，所述方法中使用的任何多核巧酸或本文所描述的组合物包 含标记。在该些方面的一些方面，标记是英光的。用英光分子标记多核巧酸和测量英光的 方法在本领域中是已知的。适用于本发明的实践的英光标记包括但不限于；1，8-ANS(1-苯 胺基蔡-8-賴酸）、1-苯胺基蔡-8-賴酸（1，8-AN巧、抑为9. 0的5-駿基-2'，7' -二氯英 光素（和6-駿基-2'，7' -二氯英光素）、抑为9. 0的5-FAM、5-R0X(5-駿基-X-罗丹明H 己胺盐）、pH 为 7. 0 的 5-R0X、5-TAMRA、pH 为 7. 0 的 5-TAMRA、5-TAMRA-MeOH、6JOE、pH 为 9. 0的6, 8-二氣-7-轻基-4-甲基香豆素、抑为7. 0的6-駿基罗丹明6G、6-駿基罗丹明 6G盐酸盐、抑为9. 0的6-肥X，沈、抑为9. 0的6-TET，SE、抑为7. 0的7-氨基-4-甲基 香豆素、7-轻基-4-甲基香豆素、抑为9. 0的7-轻基-4-甲基香豆素 、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、 Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、Alexa 700、抑为 7. 2 的 Alexa Fluor 430 抗体缀合 物、抑为8. 0的Alexa Fluor 488抗体缀合物、Alexa Fluor 488醜脱-水、抑为7. 2的 Alexa Fluoi'SSS抗体缀合物、抑为7. 2的Alexa Fluor 555抗体缀合物、抑为7. 2的Alexa Fluor 568抗体缀合物、抑为7. 2的Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉亲和素、抑为7. 2的 Alexa Fluor 647抗体缀合物、抑为7. 2的Alexa Fluor 647R-藻红蛋白链霉亲和素、抑 为7. 2的Alexa Fluor 660抗体缀合物、抑为7. 2的Alexa Fluor 680抗体缀合物、抑为 7. 2的Alexa Fluor 700抗体缀合物、抑为7. 5的别藻蓝蛋白、AMCA缀合物、氨基香豆素、 APC (别藻蓝蛋白）、Atto 647、pH为5. 5的BCECF、抑为9. 0的BCECF、BFP (蓝色英光蛋白）、 B0-PR0-1-DNA、B0-PR0-3-DNA、B0B0-1-DNA、B0B0-3-DNA、B孤IPY 650/665-X, MeOH、B孤IPY 化缀合物、B0DIPY 化，MeOH、Bodipy R6G SE、B0DIPY R6G，MeOH、抑为 7. 2 的 B0DIPY TMR-X 抗体缀合物、Bodipy TMR-X 缀合物、B0DIPY TMR-X, MeOH、B0DIPY TMR-X, SE、pH 为 7. 0 的 B0DIPY TR-X 类鬼笔（毒）环肤、B0DIPY TR-X，MeOH、BODIPY TR-X，SE、B0PR0-l、B0PR0-3、 巧黄绿素（Calcein)、抑为9. 0的巧黄绿素、巧深红色（Calcium化imson)、巧深红色化化、 巧绿色（Calcium Green)、巧绿色-lCa2+、巧澄色（Calcium Orange)、巧澄色化2+、抑为 10. 0的駿基蔡并英光素、级联蓝（Cascade Blue)、抑为7. 0的级联蓝BSA、Cascade Yellow、 抑为8. 0的级联黄抗体缀合物、C抑A、CFP(蓝绿色英光蛋白）、抑为2. 5的Cl-肥RF、pH 为6. 0的CI-NERF、巧樣黄（Citrine)、香豆素、切2、切3、切3. 5、切5、切5. 5、切QUANT GR-DNA、丹賴醜尸胺、丹賴醜尸胺，MeOH、DAPI、DAPI-DNA、Dapox}d (2-氨己基）賴醜胺、pH 为 9. 0 的孤AO、Di-8A肥PPS、Di-8-A肥PPS-脂质、Dil、DiO、抑为 4. 0 的 DM-肥RF、抑为 7. 0的DM-NERF、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增强蓝绿色英光蛋白）、eGFP(增强绿色英 光蛋白）、曙红巧osin)、抑为8. 0的曙红抗体缀合物、抑为9. 0的赤薛红-5-异硫氯酸 盐、漠化己巧、己巧同型二聚体、己巧同型二聚体-1-DNA、eYFP(增强黄色英光蛋白）、抑A、 FITC、抑为 8. 0 的 FITC 抗体缀合物、FlAsH、Fluo-3、Flu〇-3Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、 英光素、0. IM化OH英光素、抑为8. 0的英光素抗体缀合物、抑为8. 0的英光素右旋糖 酢、抑为 9. 0 的英光素、Fluoro-翠绿色脑lerald)、FM 1-43、FM 1-43 脂质、FM 4-64、 FM 4-64, 2% CHAPS、化脚Red Ca2+、高化的化脚Red、低化的化脚Red、化脚-2化化、 商化的化脚-2、无化的化脚-2、GFP(S65T)、HcRed、Hoechs1:33258、Hoechst 33258-DNA、 Hoechst 33342、Ind〇-lCa2+、不含 Ca 的 Ind〇-l、Ca 饱和的 Ind〇-l、JC-l、抑为 8. 2 的 JC-1、 咖丝胺罗丹明、LOLO-l-DNA、英光黄、CH、LysoSensor Blue、抑为 5. 0 的 LysoSensor Blue、 LysoSensor Green、pH 为 5. 0 的 LysoSensor Green、pH 为 3. 0 的 LysoSensor Yellow、pH 为 9. 0 的 LysoSensor Yellow、LysoTracker Blue、LysoTracker GreeruLysoTracker Red、 Magnesium Green、Magnesium Green Mg2+、Magnesium Orange、Marina Blue、mBanana、 mCherry、mHoneydew、MitoTracker Green、MitoTracker Green FM, MeOH、MitoTracker Orange、MitoTracker Orange, MeOH、MitoTracker Red、MitoTracker Red, MeOH、mOrange、 mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X, MeOH、NeuroTrace 500/525、绿色 英光 Nissl 染色-RNA、Nile Blue,化OH、Nile Red、Nile Red-脂质、Nissl、Oregon Green 488、抑为 8. 0 的 Oregon Green 488 抗体缀合物、Oregon Green 514、抑为 8. 0 的 Oregon Green 514抗体缀合物、Pacific Blue、抑为8. 0的化cific Blue抗体缀合物、藻红蛋白、 PO-PRO-1、PO-PRO-l-DNA、PO-PRO-3、P0-PR0-3-DNA、POPO-1、POPO-l-DNA、POPO-3、楓化丙 巧、楓化丙巧-DM、pH为7. 5的R-藻红蛋白、ReAsH、试团灵、pH为9. 0的试团灵、化od-2、 化od-2化化、罗丹明、罗丹明110、抑为7.0的罗丹明110、罗丹明123, MeOH、罗丹明绿、抑 为7. 0的罗丹明鬼笔环肤、pH为8. 0的罗丹明Red-X抗体缀合物、pH为7. 0的罗丹明绿、pH 为8.0的化〇(1〇16'66]1抗体缀合物、53口地^6、58。1-化+、5〇(1；[111116'66]1化+、賴基罗丹明 10USYBR Green I、SYPR0 Ruby、SYT0 13-DNA、SYT0 45-DNA、SYT0X Blue-DNA、抑为 8. 0 的 四甲基罗丹明抗体缀合物、pH为7. 0的四甲基罗丹明右旋糖巧、抑为7. 2的Texas Red-X抗 体缀合物、T0-PR0-1-DNA、T0-PR0-3-DNA、T0T0-1-DNA、T0T0-3-DNA、TRITC、X-Miod-lCa化、 Y0-PR0-1-DNA、Y0-PR0-3-DNA、Y0Y0-1-DNA U及 Y0Y0-3-DNA。
[0176] 可W使用英光分子之外的其它标记，如杂交时将给出可检测信号或可检测信号变 化的化学发光分子和放射性分子。此外，可W使用亲和标记，包括但不限于生物素、双标生 物素 W及地高辛。
[0177] 方法
[017引本发明提供用于使用包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物的方法。在一个实施 方案中，提供一种使衬底多核巧酸延伸的方法，所述方法包括在足W允许将尾部序列添加 至衬底多核巧酸的3'末端的条件下，用本文所描述的组合物来赔育衬底多核巧酸，其中尾 部序列的添加允许尾部序列与衰减子分子之间缔合W形成复合物。在一些方面，所述方法 进一步包括在衬底多核巧酸的延伸之后使衰减子分子降解。在另一方面，本发明的方法的 实践进一步包括分离所延伸的衬底多核巧酸。在一些方面，本文所描述的方法进一步包括 将如本文所描述的组合物与衬底多核巧酸W及与衰减子分子的同聚部分互补的核巧酸混 合。本发明的各个方面涵盖部分双链的衬底多核巧酸和/或衰减子分子。此外，所述方法 的一些方面进一步包括退火步骤，其中通过在足W允许第一多核巧酸与第二多核巧酸缔合 的条件下，使第一多核巧酸退火到第二多核巧酸来产生部分双链的多核巧酸。在本发明的 一些方面，衬底多核巧酸为单链RNA或DNA。在其中衬底多核巧酸是双链的各个方面，两个 游离的3'末端各自被延伸。在其它方面，双链衬底多核巧酸的游离的3'末端中仅一个被 延伸。在其中双链多核巧酸的游离的3'末端中仅一个被延伸的方面，预期的是另一个游离 的3'末端的延伸被阻止。本发明的另一方面涵盖一种包括固定步骤的方法，其中将衰减子 /衰减子-衔接子分子或衬底多核巧酸或两者固定至表面。本发明的另外方面涵盖连接步 骤，并且另外的方面涵盖包括酶的失活的步骤。在本文公开的任何方法中，预期的是不止一 个反应发生在同一反应容器中。通过举例，本发明涵盖其中加尾反应和连接发生在同一反 应容器中的方法。
[0179] 因此，在各个方面，本发明提供的方法包括赔育步骤、降解步骤、混合步骤、分离步 骤、退火步骤、失活步骤、连接步骤W及固定步骤。在一些方面，所述方法包括赔育步骤和混 合步骤。在另一方面，所述方法包括赔育步骤和分离步骤。在一些方面，所述方法包括赔育 步骤和失活步骤。本发明的另一方面提供一种包括赔育步骤、混合步骤w及连接步骤的方 法。本发明的另一方面提供一种包括赔育步骤、失活步骤W及降解步骤的方法。在另一方 面，所述方法包括赔育步骤、混合步骤W及退火步骤。本发明的另一方面提供一种包括赔育 步骤、混合步骤、退火步骤、连接步骤W及固定步骤的方法。在另一方面，所述方法包括赔育 步骤、混合步骤、退火步骤W及分离步骤。本发明的另一方面涵盖一种包括赔育步骤、混合 步骤、退火步骤、降解步骤W及分离步骤的方法。本发明的另一方面提供一种包括赔育步 骤、混合步骤、退火步骤、降解步骤、固定步骤W及分离步骤的方法。本发明的另一方面提供 一种包括赔育步骤、混合步骤、退火步骤、失活步骤、降解步骤、固定步骤W及分离步骤的方 法。本领域技术人员将理解的是，各种步骤能够W任何组合和顺序使用，其中仅混合步骤和 赔育步骤是所有方法的共同特征。
[0180] 还涵盖一种方法，借此将如本文所描述使用受控的加尾和连接的NGS文库制备与 用于祀向NGS测序的富集步骤结合。在一个实施方案中，用于受控的加尾和连接介导的NGS 文库制备的输入衬底多核巧酸是通过包括但不限于杂交捕获和祀特异性PCR的任何方法 获得的基因组的富集部分。在另一个实施方案中，如本发明中所描述的受控的加尾和连接 介导的NGS文库的产物随后通过包括但不限于杂交捕获的任何方法进行祀向富集。在一个 替代实施方案中，输入衬底多核巧酸首先进行受控的加尾和连接反应，W引入第一 NGS衔 接子，其中进行包括通过杂交捕获来祀向富集的第二步骤；并且在第H步骤中，通过第二受 控的加尾和连接反应或平端连接或TA连接来将第二NGS衔接子引入到富集的DNA部分上。
[0181] 本发明涉及受控的加尾和连接的方法在各种实施方案中应用于引物延伸产物或 扩增产物，包括但不限于来源于聚合酶链式反应、等温扩增W及RNA转录的那些扩增产物。 本发明的方法还可W应用于合成核酸。具体地说，所述方法适用于合成寡核巧酸、合成基 因、基因组片段W及基因组的序列分析。
[0182] 本发明中还涵盖一种将同步末端修复与受控的加尾和连接反应组合的方法。末端 修复包括但不限于W下酶；多核巧酸激酶、T4DNA聚合酶、尿嚼巧DNA糖基化酶、APE1核酸 内切酶、核酸内切酶III (Nth)、核酸内切酶IV、核酸内切酶V、核酸内切酶VIII、巧g、hAAG、 hOGGl W及hsMUGl。末端修复是并入现有NGS文库制备方法中来修复由在本发明中作为 DNA片段化的手段的DNA的物理剪切所诱导的损伤的单独反应。在该方面，受控的加尾和连 接反应条件与末端修复反应条件是相容的并且可W作为单个步骤同步进行。
[0183] 不受理论的束缚，本发明预期的是，在一些方面，在溶液中发生的反应比涉及固定 步骤的那些更有效。"更有效"指的是溶液中的反应的完成时间比遵循固定步骤的相同反应 更短。
[0184] 下文将更详细地论述上文所描述的每个方法步骤。
[0185] 赔育步骤
[0186] 本发明的方法涉及在足W允许将尾部序列添加至衬底多核巧酸的3'末端的条 件下，用如本文所描述的组合物来赔育衬底多核巧酸。在一些方面，使用选自由聚己二醇 (PEG)、聚胺、六氨合钻W及C0CI2组成的组的试剂来促进衰减子/衰减子-衔接子分子和 衬底多核巧酸的缔合，或控制核巧酸至衬底多核巧酸的添加。
[0187] 本发明提供的方法还包括其中将多个核巧酸添加至衬底多核巧酸来形成尾部序 列的那些。在一些方面，衰减子分子在全部或部分衰减子分子长度上与尾部序列缔合。在 另外的实施方案中，衰减子分子在添加尾部序列的过程期间与尾部序列缔合。
[018引一般来说，本文所描述的方法还包括其中衰减子分子与尾部序列的缔合调节核巧 酸至多核巧酸的添加的那些。
[0189] 对于核巧酸至衬底多核巧酸的添加来说，本发明提供其中条件调节尾部序列至 衬底多核巧酸的添加的方法。通过举例并且非限制性地，在一方面，尾部序列至衬底多核 巧酸的添加对温度敏感。在一个实施方案中，将尾部序列添加至衬底多核巧酸时所处的温 度为至少约4C。在另外的实施方案中，添加尾部序列时所处的温度条件为至少约4C至 约50°C、约4°C至约40°C、约4°C至约37°C、约4°C至约30°C、约4°C至约25°C、约4°C至约 2(TC、约 1(TC至约 5(TC、约 1(TC至约 4(TC、约 1(TC至约 37C、约 1(TC至约 3(TC、约 1(TC至 约 25°C、约 10°C至约 20°C、约 20°C至约 50°C、约 20°C至约 40°C、约 20°C至约 37°C、约 25°C 至约37°C、约25°C至约4(TC、约3(TC至约4(TC、至少约5°C、至少约6°C、至少约rC、至少 约8°C、至少约9°C、至少约10°C、至少约irC、至少约12°C、至少约13°C、至少约14°C、至少 约15C、至少约16C、至少约17C、至少约18C、至少约19C、至少约2(TC、至少约2rC、至 少约22°C、至少约23°C、至少约24°C、至少约25°C、至少约26°C、至少约27°C、至少约28°C、 至少约29°C、至少约3(TC、至少约3rC、至少约32°C、至少约33°C、至少约34°C、至少约 35°C、至少约36°C、至少约37°C、至少约38°C、至少约39°C、至少约40°C、至少约4rC、至少 约42°C、至少约43°C、至少约44C、至少约45°C、至少约46°C、至少约47 °C、至少约48°C、至 少约49C、至少约5(TC或更高。
[0190] 因此，在某些方面，进行赔育步骤时所处的温度决定了添加至衬底多核巧酸的核 巧酸的数量。举例来说，提供了其中添加至衬底多核巧酸的尾部的长度在25C下为约10个 核巧酸、在3(TC下为约11个核巧酸、在37C下为约13个核巧酸并且在45C下为约16个核 巧酸的方法。
[0191] 除了进行赔育步骤时所处的温度之外，调节尾部序列至衬底多核巧酸的添加的另 一个条件是允许赔育步骤进行的时间长度。一般来说，允许赔育步骤进行的时间长度为约 0. 5分钟至约120分钟。在一些方面，允许赔育步骤进行的时间长度为至少约0. 5分钟到至 多约1、2或3分钟；或至少约1分钟到至多约2、5或10分钟；或至少约2分钟到至多约5、 8或10分钟；或至少约5分钟到至多约10、15或20分钟；或至少约10分钟到至多约15、20 或30分钟；或至少约20分钟到至多约30、40或60分钟；或至少约30分钟到至多约40、60 或80分钟；或至少约60分钟到至多约80、90或100分钟；或至少约90分钟到至多约100、 110或120分钟。在各种实施方案中，允许赔育步骤进行的时间长度为约1、约2、约3、约4、 约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、 约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、 约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、 约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、 约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75、 约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、 约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、约99、约100、约101、约102、约 103、约 104、约 105、约 106、约 107、约 108、约 109、约 110、约 111、约 112、约 113、约 114、约 115、约116、约117、约118、约119、约120分钟或更多。
[0192] 进行赔育所处的抑为约5.0至约9.0。在一方面，抑为约7. 9。在一些方面，进 行赔育时所处的抑为至少约抑5. 0到至多约抑5. 1、5. 5或5. 8 ;或至少约抑5. 5到至 多约抑5. 8、6. 0或6. 2 ;或至少约抑6. 0到至多约抑6. 2、6. 5或6. 8 ;或至少约抑6. 5 到至多约抑7. 0、7. 2或7. 5 ;或至少约抑7. 5到并且至多约抑7. 8、8. 0或8. 2 ;或至少 约抑8.0到至多约抑8. 2、8. 5或9.0。在各个方面，进行赔育时所处的抑为约抑5.1、 约抑5. 2、约抑5. 3、约抑5. 4、约抑5. 5、约抑5. 6、约抑5. 7、约抑5. 8、约抑5. 9、约 pH 6. 0、约抑6. 1、约抑6. 2、约抑6. 3、约抑6. 4、约抑6. 5、约抑6. 6、约抑6. 7、约抑 6. 8、约抑6. 9、约抑7.0、约抑7.1、约抑7. 2、约抑7. 3、约抑7. 4、约抑7. 5、约抑7. 6、 约抑7. 7、约抑7. 8、约抑7. 9、约抑8. 0、约抑8. 1、约抑8. 2、约抑8. 3、约抑8. 4、约 pH 8. 5、约抑8. 6、约抑8. 7、约抑8. 8、约抑8. 9、抑9. 0或更高。
[0193] 降解步骤
[0194] 在其中衰减子分子是可降解的方法的方面，降解步骤任选地处于赔育步骤之后。 在一方面，将具有溶核活性的一定量的酶添加至反应容器中并且将混合物在酶的最优温度 下赔育另一个时间段。在其中衰减子分子为多核巧酸的各个方面，具有溶核活性的酶选自 由DNA糖基化酶、脱嘿岭/脱嚼巧核酸内切酶W及核糖核酸酶组成的组。在另外的方面，核 糖核酸酶选自由W下组成的组；RNase H、RNase HII、RNase AW及RNase T1。因此，举例来 说，在各个方面，可降解的衰减子分子包含尿嚼巧核巧酸并且因尿嚼巧DM糖基化酶的活 性而发生降解。在另一方面，可降解的衰减子分子包含核糖核巧酸并且因核糖核酸酶的活 性而发生降解。将理解，对溶核酶进行选择W使得衬底多核巧酸不被衰减子分子降解。因 此，在一方面，包含核糖核巧酸的衰减子分子将用于一种方法，其中衬底分子包含脱氧核糖 核巧酸，并且所使用的溶核酶是不会使衬底多核巧酸降解的核糖核酸酶。
[0195] 在所需温度下赔育反应容器来使衰减子分子降解的另一个时间段为至少约5分 钟，但涵盖约0. 5分钟至约60分钟或更多。
[0196] 混合步骤
[0197] 本文提供的方法通常包括将核酸聚合酶、衬底多核巧酸W及衰减子分子在合适的 反应容器中混合。混合物的另外组分包含合适的缓冲液（在所述缓冲液中，核酸聚合酶活 性最佳）、用于添加至衬底多核巧酸的核巧酸W及连接酶。任选地，根据下文描述的各种方 法，另外的组分包括钟、C0CI2、轴、裡、巧、猛、tris及其衍生物W及镇。
[0198] 合适的反应容器是本领域技术人员已知的并且包括但不限于微量离也管或微量 滴定板。
[0199] 在一些方面，将一种W上类型的衬底多核巧酸添加至单个反应容器。因此，在各个 方面，可将能够与一种W上类型的衬底多核巧酸缔合的一种W上类型的衰减子分子添加至 单个反应容器。在另外的方面，将至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少 7种、至少8种、至少9种、至少10或更多种类型的衬底多核巧酸和能够与一种W上类型的 衬底多核巧酸缔合的衰减子分子添加至单个反应容器。进一步预期的是，反应液包括一个 W上衰减子多核巧酸和/或一个W上衰减子-衔接子分子和/或衰减子多核巧酸与衰减 子-衔接子分子的混合物。一个W上衰减子多核巧酸和/或一个W上衰减子-衔接子分子 的使用允许是多次的并且允许通过模板依赖性聚合酶如脱氧核巧酸转移酶（TdT)、聚（A) 聚合酶或聚扣）聚合酶来进行受控的DNA和RNA加尾-连接反应。
[0200] 对于核酸聚合酶来说，每次反应有待添加的量为约1个单位（"U")至约lOOOU。 在一些方面，有待添加的核酸聚合酶的量为至少约1U到至多约2、3或4U ;或至少约2U到 至多约3、4或抓；或至少约抓到至多约20、50或100U ;或至少约抓到至多约6、7或8U ; 或至少约抓到至多约7、8或9U ;或至少约7U到至多约8、9或10U ;或至少约10U到至多 约50、100或500U ;或至少约10U到至多约12、15或18U ;或至少约15U到至多约18、20或 25U ;或至少约20U到至多约50、100或1000U ;或至少约20U到至多约25、30或35U ;或至少 约30U到至多约35、40或50U ;或至少约40U到至多约50、60或70U ;或至少约50U到至多 约100、500或1000U ;或至少约60U到至多约80、90或100U ;或至少约100U到至多约120、 150或200U ;或至少约200U到至多约250、275或300U ;或至少约300U到至多约325、350或 400U ;或至少约400U到至多约450、500或550U ;或至少约600U到至多约700、800或900U ; 或至少约700U到至多约800、900或1000U。在各个方面，每次反应有待添加的核酸聚合酶 的量为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约 16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约 30、约 40、约 50、约 60、约 70、约 80、约 90、约 100、约 110、约 120、约 130、约 140、约 150、约 160、约 170、约 180、约 190、约 200、约 210、约 220、约 230、约 240、约 250、约 260、约 270、约 280、约 290、约 300、约 310、约 320、约 330、约 340、约 350、约 360、约 370、约 380、约 390、约 400、约 410、约 420、约 430、约 440、约 450、约 460、约 470、约 480、约 490、约 500、约 510、约 520、约 530、约 540、约 550、约 560、约 570、约 580、约 590、约 600、约 610、约 620、约 630、约 640、约 650、约 660、约 670、约 680、约 690、约 700、约 710、约 720、约 730、约 740、约 750、约 760、约 770、约 780、约 790、约 800、约 810、约 820、约 830、约 840、约 850、约 860、约 870、约 880、约 890、约 900、约 910、约 920、约 930、约 940、约 950、约 960、约 970、约 980、约 990 个 或约1000个单位或更多。
[0201] 添加至反应容器的核巧酸将取决于给定的应用。举例来说，如果衰减子分子是同 聚多核巧酸，那么添加至反应容器的核巧酸是与构成衰减子分子的同聚部分的核巧酸互补 的核巧酸。还预期的是，在各种实施方案中，将核巧酸的混合物添加至反应容器。因此，在一 些实施方案中，将脱氧核糖核巧酸与核糖核巧酸的混合物添加至反应容器（例如，dA/rA、 dT/加/州、dC/rC或dG/rG)。在一些实施方案中，在反应容器中包括核糖核巧酸减少了在 如TdT的聚合酶存在下的另外的加尾，而在反应容器中包括脱氧核糖核巧酸减少了在如聚 (A)聚合酶或聚扣）聚合酶的聚合酶存在下的另外的加尾。反应容器内的核巧酸浓度通常 为约0. ImM，但是在各个方面，其介于约0. OlmM与约5mM之间。
[0202] 如上所述，所述方法的一些实施方案包括连接酶。对于连接酶来说，每次反应有待 添加的量介于约0. 1U与约1000U之间。
[0203] 对于镇来说，预期的是，每次反应有待添加的量为约ImM至约lOOmM。在各个方面， 有待添加的钟的量为约ImM至约lOmM，或约2mM至约20mM，或约lOmM至约lOOmM。
[0204] 分离步骤
[0205] 在一些实施方案中，将衬底多核巧酸分离。衬底多核巧酸的分离通过本领域技术 人员已知和理解的任何方法来进行。在一方面，衬底多核巧酸的分离通过如本文所描述的 衬底多核巧酸的固定来进行。在另一方面，使用配体偶联的珠粒或微球来与衬底多核巧酸 特异性地缔合并且促进其分离。举例来说，可W使用聚-dT偶联的珠粒来分离用同聚腺嘿 岭序列加尾的衬底多核巧酸。在其它方面，通过衬底多核巧酸的沉淀、凝胶过滤或自旋柱微 量离也来进行衬底多核巧酸的分离。
[0206] 固定步骤
[0207] 在一些方面，衰减子分子和/或衬底多核巧酸共价地或非共价地偶联至支持物。 设想了本领域中熟知的偶联化学和支持材料的选择。例如，支持物包括全部或部分由玻璃、 二氧化娃、金属、塑料、纤维、树脂W及聚合物制成的那些。示例性聚合物包括例如但不限于 纤维素、硝酸纤维素、聚己酸醋、聚碳酸醋、聚苯己帰、聚醋、聚己帰二氣苯、尼龙、碳纤维或 任何其它合适的聚合物材料。在某些相关实施方案中，本文所描述的一个或多个衰减子分 子和/或衬底多核巧酸可W提供为固定在固体支持物上的阵列，所述阵列包括用于W可识 另IJ (例如但不限于，可寻址）的方式空间布置所述分子的许多熟知构型中的任何构型。在 各个方面，固定涉及生物素化的衰减子-衔接子分子W及链霉亲和素（抗生物素蛋白）涂 布的表面（例如但不限于，管、珠粒或磁珠）。技术人员将熟悉用于制作和使用所述固相固 定的衰减子分子和/或衬底多核巧酸阵列的各种组合物和方法。
[020引 失活步骤
[0209] 在一些方面，在包含反应液组分的反应容器的赔育之后，将反应容器在更高温度 下进一步赔育，W使核酸聚合酶失活。在一些方面，进一步赔育进行至少约1分钟到至多约 2、5或10分钟；或至少约5分钟到至多约10、20或30分钟；或至少约10分钟到至多约15、 20或30分钟；或至少约15分钟到至多约20、25或30分钟。在一些实施方案中，进一步赔 育进行约1分钟至约30分钟。在各个方面，进一步赔育进行约2、约3、约4、约5、约6、约 7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、 约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟或更多。
[0210] 进行进一步赔育时所处的更高温度为约6(TC至约10(TC。在一些方面，进行进 一步赔育时所处的温度为至少约6(TC到至多约62C、65C或68C ;或至少约6(TC到至多 约65°C、70°C或75°C ;或至少约60°C到至多约70°C、75°C或80°C ;或至少约70°C到至多约 75°C、8(TC或85C ;或至少约7(TC到至多8(rC、9(TC或10(TC。在各个方面，进行进一步赔 育时所处的温度为约ere、约62C、约63C、约64C、约65C、约66C、约67C、约68C、 约 69C、约 7(TC、约 7rC、约 72C、约 73C、约 74C、约 75C、约 76C、约 77C、约 78C、 约 79°C、约 80°C、约 8TC、约 82°C、约 83°C、约 84°C、约 85°C、约 86°C、约 87°C、约 88°C、 约 89°C、约 9(TC、约 9rC、约 92°C、约 93°C、约 94°C、约 95°C、约 96°C、约 97°C、约 98°C、约 99°C、约100°C或更高。
[0211] 连接步骤
[0212] 在所提供的方法的一些方面，反应是该样的；使得衬底多核巧酸的加尾与衬底多 核巧酸与衔接子分子的连接同步发生。在该些方面，包括核酸聚合酶、衬底多核巧酸、衰减 子-衔接子分子、缓冲液W及连接酶的混合物全存在于单个反应容器中（参见，例如但不限 于实施例9)。为实现衬底多核巧酸的加尾W及其与衰减子-衔接子分子的连接而对混合 物进行的赔育与上文针对单独加尾所描述的方法相同。在各个方面，连接酶为DNA连接酶 或RNA连接酶。本文已描述了所固定的衰减子分子。在所述方法的一些方面，在将尾部序 列添加至多核巧酸分子期间，通过DNA或RNA连接酶将固定的衰减子分子连接至多核巧酸。
[0213] 对于连接酶来说，每次反应有待添加的量为约0. 1个单位（"U")至约1000U。在 一些方面，有待添加的连接酶的量为至少约0. lu到至多约0. 5、1、2、3或4U ;或至少约lU到 至多约3、4或抓；或至少约抓到至多约20、50或100U ;或至少约抓到至多约6、7或8U ; 或至少约抓到至多约7、8或9U ;或至少约7U到至多约8、9或10U ;或至少约10U到至多 约50、100或500U ;或至少约10U到至多约12、15或18U ;或至少约15U到至多约18、20或 25U ;或至少约20U到至多约50、100或1000U ;或至少约20U到至多约25、30或35U ;或至少 约30U到至多约35、40或50U ;或至少约40U到至多约50、60或70U ;或至少约50U到至多 约100、500或1000U ;或至少约60U到至多约80、90或100U ;或至少约100U到至多约120、 150或200U ;或至少约200U到至多约250、275或300U ;或至少约300U到至多约325、350或 400U ;或至少约400U到至多约450、500或550U ;或至少约600U到至多约700、800或900U ; 或至少约700U到至多约800、900或1000U。在各个方面，每次反应有待添加的连接酶的量 为约0. 2、约0. 3、约0. 4、约0. 5、约0. 6、约0. 7、约0. 8、约0. 9、约1、约2、约3、约4、约5、 约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、 约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约40、约50、约60、约70、 约 80、约 90、约 100、约 110、约 120、约 130、约 140、约 150、约 160、约 170、约 180、约 190、约 200、约 210、约 220、约 230、约 240、约 250、约 260、约 270、约 280、约 290、约 300、约 310、约 320、约 330、约 340、约 350、约 360、约 370、约 380、约 390、约 400、约 410、约 420、约 430、约 440、约 450、约 460、约 470、约 480、约 490、约 500、约 510、约 520、约 530、约 540、约 550、约 560、约 570、约 580、约 590、约 600、约 610、约 620、约 630、约 640、约 650、约 660、约 670、约 680、约 690、约 700、约 710、约 720、约 730、约 740、约 750、约 760、约 770、约 780、约 790、约 800、约 810、约 820、约 830、约 840、约 850、约 860、约 870、约 880、约 890、约 900、约 910、约 920、约930、约940、约950、约960、约970、约980、约990或约1000个单位或更多。
[0214] 治疗应用
[0215] 此外，本发明还涵盖衰减的衬底多核巧酸用于控制细胞和病毒增殖的治疗应用。 治疗应用包括但不限于基因表达的反义调节。真核生物的聚（A)聚合酶在信使RNA加工期 间负责聚（A)尾部的添加。所得mRNA的聚（A)尾部起到多个作用。所述聚（A)尾部是从 细胞核到细胞质的转运所必需的，它们促进蛋白质合成的效率并且它们使mRNA稳定。细菌 中RNA的聚腺巧酸化对RNA衰变起到非常重要的作用。对真核细胞中聚（U)尾部的添加了 解甚少，但可能控制某些RNA的降解。合成的衰减子分子可W潜在地用作反义分子，W抑制 或限制细胞内的聚（A)和聚扣）加尾，并且因此建立对细胞和病毒增殖的控制。
[0216] 试剂盒
[0217] 本发明提供用于通过核酸聚合酶进行的受控和有限核酸加尾的试剂盒。
[021引本发明所提供的试剂盒包括如本文所描述的衰减子/任选的衰减子-衔接子分子 (包括任选的固相固定的衰减子-衔接子分子），核酸聚合酶、任选地连接酶、糖基化酶W及 辅助性试剂如适当的缓冲液、洗涂溶液、指示剂W及检测介质，它们取决于有待实践的具体 测定配置。在一些方面，衰减子分子与核酸聚合酶预混合或提供在单独的管内。
[0219] 所述试剂盒的实例包括但不限于W下。
[0220] TdT-介导的DNA加尾
[0221] 该种试剂盒包含W下组分。对于聚（dA)加尾试剂盒；补充有3' -封闭的线性或环 状聚（dT)、聚（加）或聚扣）衰减子分子的TdT酶。对于聚（dT)加尾试剂盒；补充有3'-封 闭的线性或环状聚（dA)或聚（A)衰减子分子的TdT酶。对于聚（dG)加尾试剂盒；补充有 3'-封闭的线性或环状聚（dC)或聚（C)衰减子分子的TdT酶。对于聚（dC)加尾试剂盒： 补充有3'-封闭的线性或环状聚（dG)或聚佑）衰减子分子的TdT酶。
[022引聚（A)和聚做聚合酶介导的RNA加尾
[0223] 聚（A)加尾试剂盒包括：补充有聚（肌）、聚（加）或聚扣）衰减子分子的聚（A)聚 合酶。聚扣）加尾试剂盒包括：补充有聚（dA)或聚（A)衰减子分子的聚扣）聚合酶。
[0224] 另外的试剂盒包括用于针对DNA衬底和RNA衬底两者的单个反应的加尾和衔接子 连接的试剂W及用于针对DNA衬底和RNA衬底两者的单个反应的加尾-连接-固定的试剂。 其它试剂盒可W将条形码引入到DNA和RNA分子上。另外其它的试剂盒可W将DNA和RNA 衬底转化成用于下一代测序的文库。在一个实施方案中，提供了一种NGS文库制备试剂盒， 其包括用于进行W下各项的材料：（i)受控的加尾反应；（ii)末端修复；（iii)引物延伸； W及（iv)平末端或TA连接或第二受控的加尾和连接。
[0225] W下在实施例部分中提供了使用本发明所描述的组合物和方法的具体应用。将理 解的是，该些应用仅通过举例的方式提供，并且不W任何方式进行限制。 实施例
[0226] 实施例1
[0227] 在长的（〉20b)互补的聚（dT)多核巧酸的存在下进行的衰减的TdT介导的聚（dA) DM加尾
[0228] 第1阶段；在37C下发生DM引物的非衰减并且快速的TdT介导的聚（dA)加尾， 直到尾部的大小达到能够与含有长的（dT)3。序列的互补衰减子分子形成稳定复合物的临 界大小。通过将封闭基团放置在衰减子分子的3'末端（例如但不限于，磯酸醋、双脱氧核 巧酸、氨基、反向dT或几个核糖核巧酸），或通过使用环状衰减子分子来防止衰减子分子的 加尾。
[0229] 第2阶段；在衰减子多核巧酸（dT)3。与聚（dA)尾部之间形成复合物导致聚（dA) 合成的显著减少。通过TdT酶添加的每个后续dA碱基增加了双链体的长度和稳定性，从而 导致几乎完全抑制了通过TdT酶进行的聚（dA)合成（图1)。
[0230] 在长的聚（dT)衰减子分子的存在下进行的聚（dA)加尾的动力学
[0231] 在所述方法的一些实施方案中，在37°C下，在长的衰减子分子的存在下进行的 TdT介导的dA加尾产生了具有非常窄的大小分布的相对较短的尾部（约13b)(参见实施例 1和W下方案1)。
[0232] 方案 1
[0233]
【权利要求】
1. 一种包含核酸聚合酶和衰减子分子的组合物。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA聚合酶。
3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述DNA聚合酶为末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)。
4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述核酸聚合酶为RNA聚合酶。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中所述RNA聚合酶为RNA特异性核苷酸转移酶。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述RNA特异性核苷酸转移酶选自由聚（A)聚合 酶和聚（U)聚合酶组成的组。
7. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含选自由以下组成 的组的核苷酸：2' -脱氧胸苷5' - 一磷酸（dTMP)、2' -脱氧鸟苷5' - 一磷酸（dGMP)、2' -脱氧 腺苷5' - 一磷酸（dAMP)、2' -脱氧胞苷5' - 一磷酸（dCMP)、2' -脱氧尿苷5 ' - 一磷酸（dUMP)、 胸苷一磷酸（TMP)、鸟苷一磷酸（GMP)、腺苷一磷酸（AMP)、胞苷一磷酸（CMP)、尿苷一磷酸 (UMP)、碱基类似物以及其组合。
8. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含10个核苷酸。
9. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含20个核苷酸。
10. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含30个核苷酸。
11. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含50个核苷酸。
12. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含100个核苷酸。
13. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含3'封闭基团。
14. 如权利要求13所述的组合物，其中所述封闭基团选自由以下组成的组：至少一个 核糖核苷酸、至少一个脱氧核苷酸、C3间隔区、磷酸、双脱氧核苷酸、氨基以及反向脱氧胸 苷。
15. 如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子选自由以下组成 的组：多核苷酸、多肽、多糖、环状分子、肽核酸、裂褶多糖、锁核酸以及其组合。
16. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子是可降解的。
17. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子进一步包含位于同 聚物序列5'的衔接子序列、鉴定标签序列，或两者。
18. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中存在连接酶。
19. 如权利要求18所述的组合物，其中所述衰减子分子是衰减子-衔接子分子，所述衰 减子-衔接子分子包含衰减子序列并且进一步包含定位在所述衰减子序列附近并且与单 独的多核苷酸上的序列X互补的序列W ; 所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与序列V互补的序列Y，其 中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相同的长度，所述衔接子分子是与所述衰减 子-衔接子分子分开的分子。
20. 如权利要求17所述的组合物，其中所述衰减子分子是固定的。
21. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子是单链的。
22. 如权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子至少部分是双链 的。
23. 如权利要求21至22中任一项所述的组合物，其中所述至少部分双链的衰减子分子 通过使所述衰减子分子退火到包含所述衔接子序列的衔接子分子来产生。
24. 如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述衰减子分子包含选自由聚 ((1八)、聚（(11')、聚（(1〇、聚（(16)、聚（(111)、聚〇^)、聚（11)、聚（1'〇、聚〇<)组成的组的同聚 序列以及包含以下组合的杂聚序列： ⑴dA与rA碱基、 (^)(11\肋与旧减基、 (iii) dC与rC碱基，或 (iv) dG与rG碱基。
25. 如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含dU碱基并且用dU-糖基化 酶孵育使所述衰减子分子不稳定，或用dU-糖基化酶孵育并且在80°C以上的温度下后续孵 育使所述衰减子分子降解，或用dU-糖基化酶与脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶的混合物来孵 育所述衰减子分子。
26. 如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含核糖核苷酸并且在对于核 糖核酸酶活性充足的条件下可用核糖核酸酶降解。
27. 如权利要求26所述的组合物，其中所述核糖核酸酶选自由以下组成的组：RNase H、RNase HII、RNase A 以及 RNase T1。
28. 如权利要求16所述的组合物，其中所述衰减子分子包含脱氧核糖核苷酸并且可用 DNA特异性核酸酶降解。
29. 如权利要求28所述的组合物，其中所述DNA特异性核酸酶为DNase I。
30. -种使衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 在足以允许将尾部序列添加至所述衬底多核苷酸的3'末端的条件下，用前述权利要 求中任一项所述的组合物来孵育所述衬底多核苷酸；其中所述尾部序列的所述添加允许所 述尾部序列与所述衰减子分子之间缔合来形成复合物。
31. 如权利要求30所述的方法，其进一步包括在所述衬底多核苷酸的延伸之后使所述 衰减子分子降解。
32. 如权利要求30所述的方法，其进一步包括在所述衬底多核苷酸的延伸之后使所述 衰减子分子不稳定。
33. 如权利要求30至33中任一项所述的方法，其进一步包括分离所延伸的衬底多核苷 酸。
34. 如权利要求30至33中任一项所述的方法，其进一步包括将权利要求1至27中任 一项所述的组合物与所述衬底多核苷酸以及与所述衰减子分子的同聚部分互补的核苷酸 混合。
35. 如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多核苷酸是单链衬底多核 苷酸。
36. 如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多核苷酸是双链衬底多核 苷酸。
37. 如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述衬底多核苷酸是部分双链和部 分单链的衬底多核苷酸。
38. 如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中所述双链衬底多核苷酸具有3'突 出末端。
39. 如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述衬底多核苷酸包含游离的3' 羟基。
40. 如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中将多个核苷酸添加至所述衬底多核 苷酸。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述衰减子分子在全部或部分衰减子分子长度上 与所述尾部序列缔合。
42. 如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述衰减子分子在添加所述尾部序 列的过程期间与所述尾部序列缔合。
43. 如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述衰减子分子与所述尾部序列的 缔合调节核苷酸至所述衬底多核苷酸的添加。
44. 如权利要求30至43中任一项所述的方法，其中所述条件调节所述尾部序列至所述 衬底多核苷酸的添加。
45. 如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的所述添加对 温度敏感。
46. 如权利要求45所述的方法，所述方法在约4°C至约50°C的温度范围内进行。
47. 如权利要求46所述的方法，其中所述温度为约5°C、约6°C、约7°C、约8°C、约9°C、 约 10°C、约 11°C、约 12°C、约 13°C、约 14°C、约 15°C、约 16°C、约 17°C、约 18°C、约 19°C、 约 20°C、约 21°C、约 22°C、约 23°C、约 24°C、约 25°C、约 26°C、约 27°C、约 28°C、约 29°C、 约 30°C、约 31°C、约 32°C、约 33°C、约 34°C、约 35°C、约 36°C、约 37°C、约 38°C、约 39°C、 约 40°C、约 41°C、约 42°C、约 43°C、约 44°C、约 45°C、约 46°C、约 47°C、约 48°C、约 49°C、约 50。。。
48. 如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的所述添加对 时间敏感。
49. 如权利要求48所述的方法，其中所述孵育步骤被允许进行在约0. 5分钟至约120 分钟的范围内的时间长度。
50. 如权利要求48或权利要求49所述的方法，其中允许所述孵育步骤进行的所述时 间长度为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、 约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、 约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、 约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约51、约52、约53、约54、约55、约56、 约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、 约71、约72、约73、约74、约75、约76、约77、约78、约79、约80、约81、约82、约83、约84、 约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91、约92、约93、约94、约95、约96、约97、约98、 约 99、约 100、约 101、约 102、约 103、约 104、约 105、约 106、约 107、约 108、约 109、约 110、 约111、约112、约113、约114、约115、约116、约117、约118、约119或约120分钟。
51. 如权利要求44所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的所述添加对 pH敏感。
52. 如权利要求51所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的所述添加在 其中pH处于约pH 5. 0至约pH 9. 0的范围内的条件下进行。
53. 如权利要求52所述的方法，其中所述尾部序列至所述衬底多核苷酸的所述添加在 其中 pH 为约 pH 5.1、约 pH 5. 2、约 pH 5.3、约 pH5. 4、约 pH 5. 5、约 pH 5. 6、约 pH 5. 7、约 pH 5. 8、约 pH 5. 9、约 pH 6. 0、约 pH 6. 1、约 pH 6. 2、约 pH 6. 3、约 pH 6. 4、约 pH 6. 5、约 pH 6. 6、约 pH 6. 7、约 pH 6. 8、约 pH 6. 9、约 pH 7. 0、约 pH 7. 1、约 pH 7. 2、约 pH7. 3、约 pH 7. 4、 约 pH 7. 5、约 pH 7. 6、约 pH 7. 7、约 pH 7. 8、约 pH 7. 9、约 pH 8. 0、约 pH 8. 1、约 pH 8. 2、约 pH 8. 3、约 pH 8. 4、约 pH 8. 5、约 pH 8. 6、约 pH 8. 7、约 pH 8. 8、约 pH 8. 9 或约 pH 9.0 的条 件下进行。
54. 如权利要求30所述的方法，其中所述衬底多核苷酸为DNA。
55. 如权利要求30所述的方法，其中所述衬底多核苷酸为RNA。
56. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少3个核苷酸添加至所述衬底 多核苷酸。
57. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少10个核苷酸添加至所述衬 底多核苷酸。
58. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少20个核苷酸添加至所述衬 底多核苷酸。
59. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少30个核苷酸添加至所述衬 底多核苷酸。
60. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少50个核苷酸添加至所述衬 底多核苷酸。
61. 如权利要求30至55中任一项所述的方法，其中将至少100个核苷酸添加至所述衬 底多核苷酸。
62. 如权利要求30至61中任一项所述的方法，其中在将核苷酸添加至所述衬底多核苷 酸期间，通过连接酶将所述衔接子分子连接至所述衬底多核苷酸，从而导致所述衬底多核 苷酸的固定。
63. 如权利要求62所述的方法，其中所述连接酶为DNA连接酶或RNA连接酶。
64. 如权利要求30至63中任一项所述的方法，其中在将核苷酸添加至所述衬底多核苷 酸之后，通过连接酶将所述衔接子分子连接至所述衬底多核苷酸。
65. 如权利要求30至64中任一项所述的方法，其中在将尾部序列添加至衬底多核苷酸 期间，通过DNA或RNA连接酶将所固定的衰减子-衔接子分子连接至所述衬底多核苷酸。
66. 如权利要求30至64中任一项所述的方法，其中在将尾部序列添加至衬底多核苷酸 之后，通过DNA或RNA连接酶将所述固定的衰减子-衔接子分子连接至所述衬底多核苷酸。
67. 如权利要求62至66中任一项所述的方法，其中添加至反应物的连接酶的量为约 0. 1个单位至约1000个单位（U)。
68. -种使DNA衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 将所述DNA衬底多核苷酸与TdT酶、包含3'磷酸的可降解的衰减子多核苷酸以及与所 述衰减子多核苷酸的同聚部分互补的核苷酸混合； 将混合物在约30°C至约37°C下孵育约30分钟，之后在70°C下另外孵育约10分钟； 通过添加 DNA糖基化酶来使所述衰减子分子不稳定，以及 将所述混合物在37°C下孵育约5分钟，或通过在80°C以上的温度下孵育所述混合物来 使所述衰减子分子降解；以及 任选地分离所延伸的DNA衬底多核苷酸。
69. -种使DNA衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 将所述DNA衬底多核苷酸与TdT酶、包含封闭基团的衰减子多核苷酸以及与所述衰减 子多核苷酸的同聚部分互补的脱氧核苷酸混合，其中所述封闭基团任选地包含至少两个核 糖核苷酸； 将混合物在约30°C至约37°C下孵育30分钟，之后在70°C下另外孵育约10分钟，以使 所述TdT酶失活；以及 任选地分离所延伸的DNA衬底多核苷酸。
70. -种使衬底RNA多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 将所述衬底RNA多核苷酸与RNA聚合酶、可降解的衰减子多核苷酸以及与所述衰减子 多核苷酸的同聚部分互补的核糖核苷酸混合； 将混合物在约30°C至约37°C下孵育约30分钟，之后在95°C下另外孵育约10分钟； 通过添加 DNA糖基化酶来使所述衰减子分子不稳定并且将所述混合物在37°C下孵育 约10分钟，或通过添加 DNA糖基化酶来使所述衰减子分子降解并且将所述混合物在37 °C下 孵育约10分钟，之后在80°C以上的温度下孵育；以及 任选地分离所延伸的衬底多核苷酸。
71. 如权利要求70所述的方法，其中所述RNA聚合酶为聚（A)聚合酶。
72. 如权利要求70所述的方法，其中所述RNA聚合酶为聚（U)聚合酶。
73. -种使DNA衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 通过将衰减子分子和衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约l〇〇°C并且然后 冷却至约25°C来使彼此至少部分互补的所述衰减子分子和所述衔接子分子退火，其中所述 退火产生了部分双链的衰减子-衔接子分子； 将所述DNA衬底多核苷酸与TdT酶、连接酶、所述部分双链的衰减子-衔接子分子以及 与所述衰减子-衔接子分子的同聚部分互补的核苷酸混合； 在约30°C至约37°C下孵育约15分钟至约30分钟；以及 任选地分离连接至所述衰减子-衔接子分子的所延伸的DNA衬底多核苷酸。
74. -种使DNA衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 通过将衰减子分子和生物素化的衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约 l〇〇°C并且然后冷却至约25°C来使彼此至少部分互补的所述衰减子分子和所述生物素化的 衔接子分子退火，其中所述退火产生了部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子； 通过在约25°C下将所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子与包含链霉亲和 素涂布的磁珠的溶液混合约两小时来使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子 固定，从而使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子固定至所述链霉亲和素涂布 的磁珠； 在约30°C至约37°C下用所述DNA衬底多核苷酸、TdT酶、连接酶以及与所述部分双链 的衰减子分子的单链同聚部分互补的核苷酸将连接至所述链霉亲和素涂布的磁珠的所固 定的部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子孵育约15分钟至约30分钟； 用NaOH洗涤所述溶液来将非生物素化的单链DNA从所述珠粒中去除；以及 任选地分离连接至所述双链生物素化的衰减子-衔接子分子的所延伸的DNA衬底多核 苷酸。
75. -种使RNA衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： 通过将衰减子分子和衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约l〇〇°C并且然后 冷却至约25°C来使彼此至少部分互补的所述衰减子分子和所述衔接子分子退火，其中所述 退火产生了部分双链的衰减子-衔接子分子； 将RNA衬底多核苷酸与聚（A)或聚（U)酶、连接酶、所述部分双链的衰减子-衔接子分 子以及与所述部分双链的衰减子-衔接子分子的单链同聚部分互补的核糖核苷酸混合； 在约30°C至约37°C下用聚（A)或聚（U)酶、连接酶、所述部分双链的衰减子-衔接子 分子以及与所述部分双链的衰减子-衔接子分子的所述单链同聚部分互补的核糖核苷酸 将所述RNA衬底多核苷酸孵育约15至约30分钟；以及 任选地分离连接至所述衰减子-衔接子分子的所延伸的RNA衬底多核苷酸。
76. -种使RNA衬底多核苷酸延伸和固定的方法，所述方法包括： 通过将衰减子分子和生物素化的衔接子分子的混合物在合适的缓冲液中加热至约 l〇〇°C并且然后冷却至约25°C来使彼此至少部分互补的所述衰减子分子和所述生物素化的 衔接子分子退火，其中所述退火产生了部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子； 通过在约25°C下将所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子与包含链霉亲和 素涂布的磁珠的溶液混合约两小时来使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子 固定，从而使所述部分双链的生物素化的衰减子-衔接子分子固定至所述链霉亲和素涂布 的磁珠； 在约30°C至约37°C下用所述RNA衬底多核苷酸、聚（A)或聚（U)聚合酶、连接酶以及 与所述部分双链的衰减子-衔接子分子的单链同聚部分互补的核糖核苷酸来将连接至所 述链霉亲和素涂布的磁珠的所固定的部分双链的生物素化的衰减子-衔接子v孵育约15 至30分钟； 用NaOH洗涤所述溶液来将非生物素化的单链多核苷酸从所述珠粒中去除；以及 任选地分离连接至所述双链的生物素化的衰减子-衔接子分子的所延伸和所固定的 RNA衬底多核苷酸。
77. -种包含如权利要求1至26中任一项所述的组合物的试剂盒。
78. -种使衬底多核苷酸延伸的方法，所述方法包括： (1) 在允许所述衬底多核苷酸延伸以为所述衬底加尾的条件下，用以下各项孵育包含 所述衬底多核苷酸的混合物：（i)聚合酶；（ii)组合物，其包含衰减子分子，所述衰减子分 子包含衰减子序列并且进一步包含定位在所述衰减子序列附近并且与单独的多核苷酸上 的衔接子序列X互补的序列W ;所述组合物进一步包含衔接子分子，所述衔接子分子包含与 序列V互补的序列Y，其中序列V具有与Y相同的长度或小于与序列Y相同的长度，所述衔 接子分子是与所述衰减子-衔接子分子分开的分子；以及（iii)脱氧核苷酸，其与所述衰减 子分子的所述衰减子序列互补； (2) 将所述衔接子序列X连接至所述衬底多核苷酸并且使所述衰减子分子与所述单独 多核苷酸解离； (3) 在其中引物与所述衬底多核苷酸杂交的条件下，添加与所述衬底多核苷酸中的序 列互补的所述引物； (4) 添加聚合酶和脱氧核苷酸来由所述引物进行聚合酶延伸，以产生与所述衬底多核 苷酸互补的第二链多核苷酸并且产生双链衬底分子； (5) 将所述衔接子分子连接至所述双链衬底分子； (6) 任选地使所述第二链多核苷酸降解。 7 9.如权利要求7 8所述的方法，其中所述引物与所述衬底多核苷酸中的序列充分互 补，以在适当的条件下与序列X杂交。
80. 如权利要求78所述的方法，其中所述引物是靶特异性引物，所述靶特异性引物与 所述衬底分子中序列X之外的序列充分互补，以在适当的条件下与所述序列杂交。
81. 如权利要求78所述的方法，其中所述衬底多核苷酸为单链DNA多核苷酸。
82. 如权利要求78所述的方法，其中所述衬底多核苷酸为核糖核酸（RNA)。
【文档编号】C12Q1/68GK104395480SQ201380014044
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年3月13日
【发明者】弗拉基米尔·马卡罗夫, 劳里·库里哈拉 申请人:斯威夫特生物科学公司