能嵌插入DNA发光的试剂，如溴化乙锭、SYBR Green I、GoodView等，也包括标记有突光基团的分子信标等。
[0027] 所述的荧光检测可以利用能保持恒定温度和荧光扫描的仪器进行检测，也可以利 用现有的PCR仪在恒定温度下进行反应，如采用伯乐CFX96荧光定量PCR仪器。
[0028] 所述的电化学检测试剂包括利用电化学手段进行寡核苷酸的检测，如辣根过氧化 物酶电化学体系，三联吡啶钌电化学体系等。
[0029] 所述的比色检测试剂包括纳米金比色、钙黄绿素比色、ABTS比色等能发生颜色变 化的试剂。
[0030] 所述的化学反光检测试剂包括鲁米诺及其衍生物-过氧化氢体系、吖啶脂类-过 氧化氢体系、钌联吡啶+TPA体系等。
[0031] 本文中所用术语"切刻内切酶"，是可以识别双链DNA的特异序列，并在识别 位点或其周围，在其中一条DNA链水解磷酸二酯键，产生3'羟基末端和5'磷酸末端， 如 Nb. BsrDI、Nb. BsmI、Nt. AlwI、Nb. BbvCI、Nb. BtsI、Nt. BsmAI、Nt. BbvCI、Nt. BstNBI、 Nt. BspQI、Nt. CviPII或者其他类似的具有切刻功能的酶。
[0032] 本文中所用术语"聚合酶"为具有链置换活性的聚合酶，即该酶具有链置换的活性 并且确实5' 一3'外切酶活性，说的更确切些，该聚合酶可在作为模板的核酸序列基础上 进行DNA复制并置换DNA链以释放退火到模板链上的互补链。如9° NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Deep VentR DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep Vent (exo_) DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 I，（Klenow)大片段、Klenow 片段 3' -5' exo-、、phi29DNA 聚合酶、 M-MuLV反转录酶、VenlR? DNA聚合酶、VentR (exo_) DNA聚合酶或其他类似功能的聚合酶中 的一种。
[0033] 本文中所用术语"退火"指的是通过根据沃森-克里克定律的碱基配对，形成双链 结构的核酸。
[0034] 本文所用术语"引物"是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当 被置于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始 点，其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度 和缓冲条件。
[0035] 文所用术语"与……互补"是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。即 腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况 下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。
[0036] 本文所用术语"双链"是指一条寡-多聚核苷酸与互补的寡-多聚核苷酸杂交。
[0037] 本文所用术语"扩增"是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升 高的任何扩增过程。
[0038] 本文中所用术语"核酸"，本发明核酸通常既包括DNA又包括RNA。然而，功能为合 成互补链的模板的，来自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替代的核酸或修饰核 苷酸也包括在本发明的核酸范围内，通常本发明的核酸被包括于生物样品中，生物样品包 括动物，植物或微生物的组织，细胞，培养物和分泌物，或它们的提取物。本发明的生物样品 包括细胞内寄生物基因组DNA或RNA例如病毒或支原体，本发明的核酸一般由包含在所述 生物样品的核酸衍生而来。例如由mRNA合成cDNA，基于生物样品衍生来的核酸而扩增的核 酸，是本发明的核酸的典型实例。
[0039] 本文中所用术语"核酸"、"DNA"以及类似术语还包括核酸类似物，即具有磷酸二酯 主链以外的类似物。举例来说，本领域已知并且在主链上具有肽键而非磷酸二酯键的所谓 "肽核酸"，被认为在本发明的范围内。
[0040] 本文所述茎环状核酸分子，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域 (茎部）的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子的两个区域（位于同一分子上） 形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个"环"结构，包括非互补的核苷酸分 子，即单链区域。发卡结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构 的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成发卡结构。
[0041] 本文所述"分子信标"，是指在茎环结构的核酸链上标记荧光基团和淬灭基团，分 子信标通过控制荧光基团和淬灭基团之间的距离实现荧光信号的产生和消失。该种控制距 离的效果一般通过茎环结构的"打开"形成单链和"闭合"形成茎环实现。所述"荧光基团" 是指可以吸收一定波长的光，同时发射出另外一种波长的光的物质，所述"淬灭基团"是指 能够吸收一定波长的光的物质。
[0042] 本文中，应用本方案实现对副溶血性弧菌的检测，提取副溶血性弧菌基因组DNA 后，按照前述流程进行检测，具体操作见实施案例。
[0043] 本发明的有益效果主要体现在以下几个方面：
[0044] 1、本发明技术方案应用切刻内切酶和聚合酶的联合作用从双链核酸靶标扩增出 单链靶标，进而应用两条扩增引物和一条置换引物实现对靶标核酸的指数扩增。整个过程 是在等温条件下进行的，等温是指技术方案中每个步骤都是在基本恒定的温度下进行，本 发明在核酸合成乃至检测全过程无需对温度进行上下调节。相比需要依赖于热循环仪进行 精确温度调控的传统变温扩增检测技术而言，本发明仅仅通过简单的恒温设备就可以达到 目的，操作简单易行；反应耗费时间短，更适合即时检测。
[0045] 2、本发明采用三条引物就可实现对靶标核酸的指数扩增，并且扩增反应更加高 效，同时扩增引物P2与单链模板退火区域紧邻切点的设计使得反应具有更好的特异性。比 起传统链置换扩增反应中需要初始热变性的步骤、修饰的碱基、以及四条引物链的设计存 在的扩增效率不高和容易引发非特异性扩增等问题，本发明在简化操作的基础上提高了扩 增效率，降低了检测成本。
[0046] 3、本发明可将扩增引物设计成分子信标的形式，只有被正确扩增的靶标序列才会 与该种形式的引物退火并产生后续荧光信号。比起传统技术中需要在四条引物链的基础上 再额外添加一条分子信标链的复杂设计，本发明简化了反应体系，并进一步提高了整个反 应进程的特异性。
【附图说明】
[0047] 图1为双链核酸靶标幂指数扩增实验原理图；
[0048] 图2为采用分子信标的实验原理图；
[0049] 图3为本发明涉及的实施例1检测结果的荧光信号图；
[0050] 图4为本发明涉及的实施例2检测结果的荧光信号图；
[0051] 图5为本发明涉及的实施例3检测结果的荧光信号图；
[0052] 图6为本发明涉及的实施例4检测结果的荧光信号图；
[0053] 序列表独立文本：
[0054] SEQ ID NO. 1 (5, -3'）：大肠杆菌 PBS 质粒；
[0055] SEQ ID NO. 2(5' -3'）：PBS 质粒扩增引物 PBS-Pl ;
[0056] SEQ ID NO. 3(5' -3'）：PBS 质粒置换引物 PBS-Bl ;
[0057] SEQ ID Ν0·4(5' -3'）：PBS 质粒扩增引物 PBS-P2 ;
[0058] SEQ ID NO. 5(5' -3'）：副溶血性弧菌（VP)基因组；
[0059] SEQ ID NO. 6(5' -3,）：VP 扩增引物 VP-Pl ;
[0060] SEQ ID NO. 7(5, -3,）：VP 置换引物 VP-Bl ;
[0061] SEQ ID NO. 8(5' -3'）：VP 扩增引物 VP-P2 ;
[0062] SEQ ID Ν0·9(5' -3'）：VP 信标扩增引物 VP-XBP2
【具体实施方式】
[0063] 下面通过实施例并结合附图作进一步说明。
[0064] 实施例1 :验证方法的可行性及其原理的正确性。本实施例是利用PBS质粒 作为靶标核酸，利用三引物进行指数扩增的恒温检测，通过荧光信号验证方法的可行性 和原理的正确性。向该等温扩增系统加入不同浓度的的靶标大肠杆菌PBS质粒（即 SEQ ID NO. 1 包含被扩增的序列为 5 ' -CATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTA TGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATC-3'）1 μ L 和作为阴性对照组加入二次蒸馏水 1 μ L， 10XThermpol(200mM Tris-HCl,IOOmM KCl,IOOmM(NH4) 2S04, 20mM MgSO4,1 % Triton X-100pH8.8@25°C)lyL，(XlyL Bst DNA聚合酶、大片段，0.5yL Nt.BsrDI 切刻内切 酶，0· 6 μ L (2. 5mM) dNTPs，I μ L (8 X I(T6M) PBS 扩增引物 PBS-Pl (即 SEQ ID NO. 2 序列为 5, -CGCTACCCATACATACTGTTCCATTGC GCCATACCAAACGACGAG-3,），1 μ L(3X I(T7M)PBS 置 换引物 PBS-Bl (即 SEQ ID NO. 3 序列为 5' -GGAACCGGAGCTGAATG-3'），1 μ L(8X I(T6M) PBS 扩增引物 PBS-P2(即 SEQ ID N0.4 序列为 5' -CGCTACGGTTCTAT