库（两端为固定序列，中间为35bp的随机序列：GCATCAC TACAGTCATTACGC-35bp-ATCGTGTGAAGTGCTGTCCC)在SHMCK中 95°C加热变性 5min，然后在冰 水中冷却；室温下孵育20min，加入鲑鱼精DNAlOul，tRNA5ul，1%BSA;
[0043] 7、然后将其加入到偶联抗体磁珠中孵育lh反筛；
[0044] 8、磁分离，吸取上清加入到结合GST-NT-proBNP蛋白的偶联抗体磁珠中中，室温 孵育lh;
[0045] 9、用SHMCK(0· 2%Tween-20)洗 5 次；
[0046] 10、加入200ul纯净水95°C孵育5min，磁分离，吸取上清；
[0047]11、上清经1/10体积3M乙酸钠（pH3. 5)，4ul助沉剂，2. 5倍体积无水乙醇沉淀， 12000rpm离心 15min;
[0048] 12、沉淀经水溶解，PCR扩增成100uldsDNA双链（Tu-1)，扩增体系为：
[0049]
[0050] 13、PCR产物经Qiagen试剂盒浓缩后保存作为下一轮文库的模板。
[0051] 14、下轮文库制备：不对称PCR、600ul，扩增体系为：
[0052]
[0053] 15、Qiagen试剂盒回收600ul、ssDNA的
PCR产物，进行第二轮筛选；
[0054] 第二轮筛选步骤如下：
[0055]1、反筛：抗体偶联磁珠；
[0056]2、筛选：GST-NT-proBNP结合抗体偶联磁珠，加鲑鱼精DNA10u1，tRNA5u1，1 % BSA；
[0057] 3、洗涤：用HMCK(0. 2%Tween-20) 10 次；
[0058] 4、洗脱：用纯净水在95°C孵育5min;
[0059] 5、扩增：100ul dsDNA(tu-3);
[0060] 6、不对称PCR、600ulssDNA(Tu-4);
[0061] 7、沉淀PCR产物：600ulssDNA+60ul(3M乙酸钠）+6ul(助沉剂）+1650ul无水乙 醇，离心15min，70%乙醇洗一次，晾干，加400ulSHMCK溶解，制备下轮筛选文库体系。
[0062] 经过15轮筛选，将PCR扩增制备的dsDNA连接到T载体，转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，涂板并克隆，提取质粒，经PCR鉴定阳性克隆，如图5所示。根据PCR鉴定的 阳性克隆情况，将阳性菌送去测序并鉴定其活性，得到NT-proBNP核酸适配体。
[0063] 实施例4 :NT-proBNP核酸适配体活性评价。
[0064] 1、试剂的准备：
[0065](1)、NT-proBNP核酸适配体的制备：SELEX(IgG)aptamer质粒lul不对称PCR 100ul(biotinPI:P2 = 100 :1)。扩增 42 循环，PCR产物用SHMCK稀释 10 倍，95°C加热变 性5min，冰水中冷却，室温孵育20min;加鲑鱼精DNAlOul、tRNA5ul、1 %BSA，备用。
[0066] (2)、包被板制备：将8ug/ml的NT-proBNP单克隆抗体（5G4)加入酶标板，37°C包 被2h;PBS洗5次，1 %BSA封闭过夜，洗涤后，备用；
[0067] (3)、抗原准备：GST-NT-proBNP抗原蛋白浓度稀释至lug/ml;
[0068] (4)、洗涤液：SHMCK(0·2%Tween-20);
[0069] (5)、HRP标记链霉亲和素；
[0070](6)、TMB显色液。
[0071] 活性评价方法：
[0072](1)、在包被有NT-proBNP单克隆抗体（5G4)的酶标板中加入NT-ProBNP抗原，室 温孵育lh;
[0073] (2)、SHMCK(0· 2 %Tween-20)洗 3 次；
[0074](3)、加入制备的NT-ProBNP核酸适配体，室温孵育lh;
[0075](4)、SHMCK(0·2 %Tween-20)洗 3 次；
[0076](5)、加入辣根过氧化物酶（HRP)的标记链霉亲和素（1 :1000)，室温孵育lh;
[0077] (6)、SHMCK (0· 2%Tween-20)洗 3 次；
[0078] (7)、TMB显色15min，酶标仪450nm测定吸光度；相对于空白对照，其吸光度>0·15 的证明活性较好，适用于检测需要，测定结果如图6所示。
[0079] 从图中可知，筛选的核酸适配体的活性都比较好，满足组装试剂盒的要求。
[0080] 实施例6 :NT-proBNP检测试剂盒的组成及检测方法。
[0081] 1、试剂盒组成
[0082] (1)单克隆抗体包被的96孔板
[0083] (?NT-proBNP抗原标准品
[0084] (3)生物素标记的NT-proBNP核酸适配体
[0085] (4)辣根过氧化物酶（HRP)标记的链霉亲和素
[0086] (5)TMB显色液
[0087] (6)终止液
[0088] (7)洗涤液
[0089] 2.检测方法
[0090] (1)抗原准备：GST-BNP抗原蛋白浓度稀释至lug/ml ;
[0091](2)洗涤液：SHMCK(0. 2% Tween-20);
[0092] (3) HRP标记的链霉亲和素；
[0093] (4)TMB显色液；
[0094] (5)在包被有抗体的酶标板中加入NT-ProBNP抗原，室温孵育lh ;
[0095](6) SHMCK (0· 2%Tween-20)洗 3 次；
[0096](7)加入制备的NT-ProBNP核酸适配体，室温孵育lh ;
[0097] (8)SHMCK (0· 2%Tween-20)洗 3 次；
[0098] (9)加入HRP标记链霉亲和素（1:1000)，室温孵育lh;
[0099](10) SHMCK (0· 2%Tween-20)洗 3 次；
[0100] (11)TMB显色15min，终止液终止，酶标仪450nm测定吸光度。
[0101] 实施例7 :NT-proBNP检测试纸条的组成及检测方法。
[0102] 1、试纸条的组成
[0103] 在PVC背衬1上依次粘附有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5 ;结合 垫3上包被有由胶体金标记的NT-proBNP的核酸适配体；硝酸纤维素膜设置有检测线6和 质控线7,检测线6上包被有NT-proBNP的单克隆抗体，质控线7为能与结合垫3上胶体金 标记的NT-proBNP的核酸适配体结合的试剂，组装成的试纸条如图7所示。
[0104] 2、检测方法
[0105] 样品（血浆）加入到样品垫2上，液体在吸水垫5的作用下流至结合垫3上，与结 合垫3中的胶体金标记的NT-proBNP的核酸适配体相结合，在液流带动下，继续前行，在检 测线6处与NT-proBNP的单克隆抗体结合，形成复合物，胶体金在此聚集，胶体金显色，多余 的胶体金继续前行与质控线7中的互补序列结合，其余液体至吸水垫5,检测结束后有两条 显色带为阳性样品，且胶体金的显色强度与样品中NT-proBNP的含量呈正相关。
【主权项】
1. 一种NT-proBNP核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体为SEQID : 1-15所示 的核苷酸序列中的任意一条。2. 根据权利要求1所述的一种NT-proBNP核酸适配体，其特征在于，所述的核酸适配体 能与NT-proBNP蛋白或NT-proBNP蛋白N端氨基酸序列制备的单克隆抗体相结合。3. 根据权利要求1所述的一种NT-proBNP核酸适配体，其特征在于，所述的NT-proBNP 蛋白N端的氨基酸序列为GlySerAlaSerAspLeuGluThrSerGly LeuGlnGluGlnArg〇4.权利要求1-3任一项所述的一种NT-proBNP核酸适配体在制备NT-proBNP检测试剂 盒中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的NT-proBNP核酸适配体被生物素标 记。6.权利要求1-3任一项所述的一种NT-proBNP核酸适配体在制备NT-proBNP检测试纸 条中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的NT-proBNP核酸适配体被胶体金标 记。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的NT-proBNP检测试纸条的组成为： 在PVC背衬（1)上依次粘附有样品垫（2)、结合垫（3)、硝酸纤维素膜（4)和吸水垫（5);所 述的结合垫（3)上包被有由胶体金标记的NT-proBNP核酸适配体；所述的硝酸纤维素膜设 置有检测线（6)和质控线（7);其中，检测线（6)上包被有NT-proBNP蛋白N端氨基酸的单 克隆抗体，质控线（7)上包被有与胶体金标记的NT-proBNP的核酸适配体结合的试剂。9. 根据权利要求8所述的一种NT-proBNP检测试纸条，其特征在于，所述的与胶体金标 记的NT-proBNP的核酸适配体结合的试剂为NT-proBNP核酸适配体的互补序列。
【专利摘要】本发明公开了属于NT-proBNP检测技术领域的一种NT-proBNP核酸适配体及其应用。所述的核酸适配体包括SEQ？ID：1-15中所示的核苷酸序列中的任意一条。本发明中的NT-proBNP核酸适配体本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本，具有比抗体更高的亲和性和特异性；同时该核酸适配体便于标记，重复性和稳定性好，易于保存。用所述适配体制备的NT-proBNP检测试剂盒和试纸条对NT-proBNP检测灵敏，且易于优化，可在心衰诊断、心衰预后与监视的评估、急性冠脉综合症的危险分类或轻度心功能不全诊断中应用。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/68, C12N15/115
【公开号】CN105349545
【申请号】CN201510926833
【发明人】弓景波, 钱令嘉, 谢方, 马婧
【申请人】中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月14日