专利名称：表达苯环双加氧酶的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及苯环双加氧酶的专用表达工程菌及其应用，特别是涉及一种苯环双加氧酶的专用表达工程菌与该工程菌在生产顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯中的应用。
背景技术：
顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯(DHCD，化学结构式见式I)是化学合成高性能材料聚苯(化学结构式见式II，n＝1，2，3，4，……)的单体。聚苯是一种高性能聚合物，具有稳定性好、强度高、耐高温、阻燃、耐久性好、耐腐蚀、电性能好等一系列优异的性能。聚苯在航空航天、核能、电子信息、精密机械、石油化工、汽车等高新技术领域中都具有潜在的应用价值(曲向华，陈金春，马祺祥，孙世尧，陈国强，用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯。生物工程学报，2003，19(1)74-80)。
式I 式II传统的利用化学法由苯经催化合成聚苯的方法效率极低，而且据报导只能合成分子量很低的聚苯(Marvel C S，Hartzell G E，Preparation andAromatization of Poly-1，3-cyclohexadiene，J.Am.Chem.Soc.1959，41448-452)。新的聚苯合成方法是先通过含有苯环双加氧酶的微生物把苯转化成DHCD作为合成聚苯的单体，再经历化学合成过程合成聚苯。这种方法合成聚苯的效率较高，分子量较大(Ballard D G H，et.al.，Synthesis of Polyphenylenefrom a cis-Dihydrocatechol，a biologically Produced Monomer.Macromolecules.1988，21294-300)。苯环双加氧酶是一类可以将苯环结构氧化成顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯结构的酶(见式III)，根据其结构可以分成甲苯双加氧酶、苯双加氧酶、氯苯双加氧酶等。苯环双加氧酶通常其底物特异性比较低，如甲苯双加氧酶(TOD)可以以苯、甲苯、萘等含有苯环的物质作为底物。研究得比较多的甲苯双加氧酶是三种蛋白的总称黄素蛋白还原酶(flavoprotein reductase，由todA基因编码)、铁氧化还原蛋白(ferredoxin，由todB基因编码)和终端双加氧酶(terminal dioxygenase，由两个亚基组成，这两个亚基分别由todC1及todC2编码)。这三种蛋白联合催化由苯环到顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯的反应。
式III目前，能高效率的将苯转化为DHCD的微生物主要包括以下两种，一是经过大量的筛选、人工诱变而获得的野生菌株或诱变株，已有用这些菌株生产DHCD的相关报导(Quintana MG，Dalton H，Production of toluene cis-diol byimmobilized Pseudomonas putida UV4 cells in barium alginate beads.ENZYMEAND MICROBIAL TECHNOLOGY 22(8)713-720 JUN 1998)；二是从含有苯环双加氧酶的菌株中克隆出苯环双加氧酶基因，再将克隆的基因连接在不同的质粒上，导入到其它微生物宿主中增强表达，如带有质粒pKST11的重组大肠杆菌(Quintana MG，Dalton H，Biotransformation of aromatic compounds byimmobilized bacterial strains in barium alginate beads.ENZYME ANDMICROBIAL TECHNOLOGY 24(3-4)232-236 FEB-MAR 1999)，从而得到苯环双加氧酶。由于苯是一种对微生物毒害作用较强的试剂，以重组大肠杆菌作为宿主，生产DHCD的效率较低，其产量达不到规模化工业生产的要求，且在培养过程中需要添加IPTG诱导基因的表达，使得发酵培养的成本较高，难于推广应用(曲向华，陈金春，马祺祥，孙世尧，陈国强，用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯。生物工程学报，2003，19(1)74-80)。
许多假单胞菌都具有较强的抵抗有机溶剂的能力，不少种类的野生型假单胞菌基因组中就含有与苯环双加氧酶基因功能非常相似的基因(JoséIgnacioJiménez，et.al.，Genomic analysis of the aromatic catabolic pathwaysfrom Pseudomonas putida KT2440。Environmental Microbiology，2002，4(12)，824-841)，但由于其本底表达量通常较低，野生型假单胞菌并不能作为将苯转化为DHCD的生产菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种可高效表达苯环双加氧酶的专用表达工程菌。
本发明所提供的苯环双加氧酶的专用表达工程菌，是将含有苯环双加氧酶基因的表达载体导入假单胞菌(Pseudomonas)中得到的重组假单胞菌。
所述苯环双加氧酶基因的特征为所编码的苯环双加氧酶可将苯环结构氧化为顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯结构，能催化如式III所述的反应。所述苯环双加氧酶基因可为甲苯双加氧酶基因(tod)或氯苯双加氧酶基因(cdo)，所述甲苯双加氧酶基因可为NCBI GenBank号为J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因，所述氯苯双加氧酶基因可为NCBI Genbank号为U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因。
所述用于构建含有苯环双加氧酶基因的表达载体的出发载体为任一可在假单胞菌中表达外源基因的表达载体，如pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)，pBBR1MCS-5(NCBI GenBank号为U25061.)，pBBR1MCS-3(NCBI GenBank号为U25059)。
以pBBR1MCS-2为出发载体，构建的含有甲苯双加氧酶基因(tod)的表达载体为pSPM01。
以pBBR1MCS-2为出发载体，构建的含有氯苯双加氧酶基因(cdo)的表达载体为pSPM01-1。
上述含有苯环双加氧酶基因的表达载体可按照生物工程领域中的常规方法构建。
所述假单胞菌宿主菌的选择是多种多样的，如Pseudomonas putida KT2442(Kellerhals MB et al，Closed-loop control of bacterialhigh-cell-density fed-batch culturesProduction of mcl-PHAs byPseudomonas putida KT2442 under single-substrate and cofeedingconditions.BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999，65(3)306-315)、Pseudomonas putida KT2440(ATCC编号47054)、Pseudomonas stutzeri 1317(Chen JY，Liu T，Zheng Z，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1and PhaC2 from Pseudomonas stutzeri 1317 had different substratespecificities，FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 234(2)231-237 MAY 15 2004)或Pseudomonas aeruginosa PAO1(ATCC编号39018)等。
可采用生物工程领域中常用的方法将含有苯环双加氧酶基因的表达载体转化假单胞菌宿主菌，如接合转化法、电击转化法、氯化锂转化法或原生质体转化法等，优选为接合转化法。
以Pseudomonas putida KT2442为出发菌株，构建的转化有pSPM01的重组假单胞菌为Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)。
以Pseudomonas putida KT2440为出发菌株，构建的转化有pSPM01的重组假单胞菌为Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)。
以Pseudomonas stutzeri 1317为出发菌株，构建的转化有pSPM01的重组假单胞菌为Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)。
以Pseudomonas aeruginosa PAO1为出发菌株，构建的转化有pSPM01-1的重组假单胞菌为Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)。
本发明的另一个目的是提供一种顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯(DHCD)的制备方法。
本发明所提供的顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯的制备方法，是发酵上述苯环双加氧酶的专用表达工程菌，获得苯环双加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，使每小时加入到每升发酵液中苯的含量为10-30mL，然后继续发酵8-24小时，得到顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯；所述苯溶液中的溶剂为石蜡或豆油，苯与溶剂的体积比为1∶1-3。
可采用假单胞菌的常规培养条件对重组假单胞菌进行培养，如可选用下述三种培养基中的任意一种1)每升培养基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，其余为水。
2)每升培养基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH4)2SO45-7g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。
3)每升培养基含月桂酸7-9g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，其余为水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。
在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL硫酸卡那霉素。
所述发酵温度为30-35℃。
将苯或苯溶液加入发酵液中的方式为流加或分批补加；所述流加速度可为10～30mL/h；所述分批补加的方式可为每隔1小时每升发酵液中添加10～30mL苯或苯溶液。
在发酵过程中，可每隔2h用高效液相色谱方法检测DHCD的产量，当DHCD产量不再增加时，发酵结束。
本发明提供了一种苯环双加氧酶的专用表达工程菌。该工程菌是利用基因工程技术构建出含有苯环双加氧酶基因的质粒，然后将其导入假单胞菌中，获得的重组假单胞菌，该工程菌与传统的重组大肠杆菌相比具有很多优势1)具有更强的抵抗有机溶剂的能力，能忍耐更高浓度的底物苯；2)本身具有与苯环双加氧酶基因类似的基因，因此导入外源苯环双加氧酶基因后可使重组假单胞菌苯环双加氧酶的表达效率更高；3)无需添加IPTG诱导基因表达，因而降低了培养成本。此外，摇瓶实验结果表明本发明的工程菌可高效表达苯环双加氧酶，并可将底物苯转化成DHCD，转化效率较高。小型发酵罐实验表明将本发明的工程菌在6L发酵罐中发酵后，DHCD的产量最高可达62g/L以上，且生产工艺简单，成本低廉，适于大规模工业化生产。本发明苯环双加氧酶的专用表达工程菌将在DHCD的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为质粒pSPM01的物理图谱图2为质粒pSPM01-1的物理图谱具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法；所用酶试剂均购自大连宝生物工程有限公司，提取质粒、回收DNA片断所用的试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制，培养基灭菌条件为115℃加热20分钟。
培养基配方LB液体培养基每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水。
LB-Km液体培养基每升培养基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LB-Km固体培养基每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl和50μg/mL硫酸卡那霉素，其余为水。
LB-Km-Amp液体培养基每升培养基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
LB-Km-Amp固体培养基每升培养基含15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50μg/mL硫酸卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素，其余为水。
重组假单胞菌专用培养基重组假单胞菌专用培养基I每升培养基含酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖20g/L，其余为水。
LBG-Km液体培养基在重组假单胞菌专用培养基I的基础上添加50μg/mL硫酸卡那霉素。
重组假单胞菌专用培养基II每升培养基含酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖50g/L，(NH4)2SO46g/L，MgSO40.41g/L，Na2HPO4·12H2O 9.65g/L，KH2PO41.5g/L，微量元素溶液I 10mL/L，微量元素溶液II 1mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余为水。
重组假单胞菌专用培养基III月桂酸8g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO40.41g/L，Na2HPO4·12H2O 9.65g/L；KH2PO41.5g/L，微量元素溶液I 10mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，微量元素溶液II 1mL/L。
重组假单胞菌专用培养基II和重组假单胞菌专用培养基III中的微量元素溶液I、II用0.5M HCl配制。微量元素溶液I的配方为Fe(III)-NH4-Citrate 5g/L，CaCl2·2H2O 2g/L；微量元素溶液II的配方为ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O30mg/L，H3BO3300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L。
实施例1、苯环双加氧酶专用表达工程菌的构建一、含有甲苯双加氧酶基因(tod)的假单胞菌表达载体的构建1)用限制性内切酶BamH I和Nde I对质粒pKST11(Allen，C.C.R.，Boyd，D.R.，Dalton，H.，et.al.Sulfoxides of high enantiopurity frombacterial dioxygenase-catalysed oxidation.J.Chem.Soc.Chem.Comm.1995，119-120)进行双酶切，回收大小为3866bp的甲苯双加氧酶基因片断(NCBIGenBank号为J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因)；2)用限制性内切酶BamHI对质粒pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)进行酶切，回收酶切片断；3)将步骤1)和步骤2)的回收片断用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应完成后，将连接产物用电转化的方法导入到E.coli JM109(ATCC编号53323)中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃、200rpm下摇床培养12h；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.166kb及3.844kb的DNA片断，将构建正确的含有tod的假单胞菌表达载体命名为pSPM01，其物理图谱见图1。
二、含有氯苯双加氧酶基因(cdo)的假单胞菌表达载体的构建1)以Pseudomonas sp.strain P51(Werlen C，Kohler HP，van der MeerJR.The broad substrate chlorobenzene dioxygenase and cis-chlorobenzenedihydrodiol dehydrogenase of Pseudomonas sp.strain P51 are linkedevolutionarily to the enzymes for benzene and toluene degradation.J BiolChem.1996 Feb 23；271(8)4009-16)的基因组DNA为模板，在引物P1ATAGGATCCGTAAATGAATCACACCGACAC和P2ATAGAGCTCTCATGCTGAGTCTCCTTG的引导下，PCR扩增氯苯双加氧酶基因cdo片断(NCBI Genbank号为U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因)，用限制性内切酶BamH I和Sac I对PCR扩增产物进行双酶切，回收大小约为3.6kb的酶切片断；2)用限制性内切酶BamH I和Sac I对质粒pBBR1MCS-2(NCBI GenBank号为U23751)进行双酶切，回收大小约为5.1kb酶切片断；3)将步骤1)和步骤2)的回收片断用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物用电转化的方法导入到E.coli JM109(ATCC编号53323)中，将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃、200rpm下摇床培养12h；4)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI和Sac I对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.1kb及3.6kb的DNA片断，将构建正确的含有cdo的假单胞菌表达载体命名为pSPM01-1，其物理图谱见图2。
三、甲苯双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)的获得1)将步骤一构建的含有tod的假单胞菌表达载体质粒pSPM01用电转化法导入到E.coli S17-1(ATCC编号47055)中，并将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；2)挑取在LB-Km固体培养平板上长出的单克隆，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.166kb及3.844kb的DNA片断，将正确转化有质粒pSPM01的阳性克隆菌株命名为E.coliS17-1(pSPM01)；3)挑取阳性单克隆E.coli S17-1(pSPM01)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonas putida KT2442菌株(Kellerhals MB et al，Closed-loop control of bacterialhigh-cell-density fed-batch culturesProduction of mcl-PHAs byPseudomonas putida KT2442 under single-substrate and cofeedingconditions.BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，1999，65(3)306-315)接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取1mL上述两种菌株的培养液至无菌小管中，8000rpm离心2分钟，弃去上清液，再各加入0.5mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，将两管重悬菌液混合，置于30℃培养箱中1小时，用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；4)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Km-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h后，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.166kb及3.844kb的DNA片断，将正确转化有质粒pSPM01的重组假单胞菌命名为Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)。
四、甲苯双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)的获得1)挑取步骤三获得的转化有pSPM01的重组菌E.coli S17-1(pSPM01)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonas stutzeri 1317菌株(Chen JY，Liu T，Zheng Z，et al.Polyhydroxyalkanoate synthases PhaC1 and PhaC2 from Pseudomonas stutzeri1317 had different substrate specificities，FEMS MICROBIOLOGY LETTERS234(2)231-237 MAY 15 2004)接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取1mL上述两种菌株的培养液至无菌小管中，8000rpm离心2分钟，弃去上清液，再各加入0.5mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，将两管重悬菌液混合，置于30℃培养箱中1小时，用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Km-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h后，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.166kb及3.844kb的DNA片断，将正确转化有质粒pSPM01的重组假单胞菌命名为Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)。
五、氯苯双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas aeruginosa PA01(pSPM01-1)的获得1)将步骤二构建的含有bod的假单胞菌表达载体质粒pSPM01-1用电转化法导入到E.coli S17-1(ATCC编号47055)中，并将转化子涂布于LB-Km固体培养平板上，在37℃培养箱中培养12h；2)挑取转化有pSPM01-1的重组菌E.coli S17-1(pSPM01-1)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonasaeruginosa PA01菌株(ATCC编号39018)接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取1mL上述两种菌株的培养液至无菌小管中，8000rpm离心2分钟，弃去上清液，再各加入0.5mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，将两管重悬菌液混合，置于30℃培养箱中1小时，用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；3)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Km-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h后，提取质粒，并用限制性内切酶BamH I和Sac I对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.1kb及3.6kb的DNA片断，将正确转化有质粒pSPM01-1的重组假单胞菌命名为Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)。
五、甲苯双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)的获得1)挑取步骤三获得的转化有pSPM01的重组菌E.coli S17-1(pSPM01)，将其接种到LB-Km液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12h，同时将Pseudomonas putida KT2440菌株(ATCC编号47054)接种到LB液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，然后各取1mL上述两种菌株的培养液至无菌小管中，8000rpm离心2分钟，弃去上清液，再各加入0.5mL无菌LB液体培养基，重悬细菌后，将两管重悬菌液混合，置于30℃培养箱中1小时，用无菌接种环通过划线法将一环混合菌液涂布于LB-Km-Amp固体培养平板上，在30℃培养箱中培养24h；2)挑取在LB-Km-Amp固体培养平板上长出的单克隆，将其接种至LB-Km-Amp液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h后，提取质粒，并用限制性内切酶BamHI对质粒进行酶切鉴定，阳性质粒经酶切后可产生大小约为5.166kb及3.844kb的DNA片断，将正确转化有质粒pSPM01的重组假单胞菌命名为Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)。
实施例2、苯环双加氧酶专用表达工程菌表达的苯环双加氧酶的酶活测定用下述方法检测实施例1构建的四种苯环双加氧酶专用表达工程菌表达的苯环双加氧酶的酶活，具体方法如下将苯环双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)，Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)和Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)分别接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将四种菌液分别接种到LBG-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养，分别于不同培养时间(4，8，12，16，24，36，48h)取样2mL，检测苯环双加氧酶酶活。苯环双加氧酶酶活检测方法为取2mL菌液样品，8000rpm离心5分钟，倒掉上清液，用2mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(含24.5g/L Na2HPO4·12H2O，4.9g/LNaH2PO4·2H2O，pH7.2)重悬，再将悬浊液加入到500mL三角瓶中，加入0.05mL0.1M吲哚溶液(溶剂为N，N二甲基甲酰胺)，用封口膜封口，在30℃、200rpm下摇床培养30分钟，取培养后的菌液0.5-2mL于塑料管中，加入3mL乙酸乙酯，振荡，5000rpm离心5分钟，取上层有机层，在靛蓝的特定吸收峰600nm，以乙酸乙酯为空白测定OD600，利用靛蓝-OD600标准曲线定量靛蓝，相对酶活以靛蓝的生成量/分钟/每升菌液(mg/min/L)表示，酶活测定结果如表1所示，表明四种苯环双加氧酶专用表达工程菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)，Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)和Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)经培养，均可正确稳定表达苯环双加氧酶，且培养12h时的表达量达到最高。
表1不同培养时间的四株重组假单胞菌菌液中的苯环双加氧酶酶活
实施例3、用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验1)将Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)接种于LB-Km液体培养基中，在35℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LBG-Km液体培养基中，在35℃、200rpm下摇床培养12h；2)将苯溶解于豆油中配成苯溶液，苯与豆油的体积比分别为1∶1和1∶3；3)将苯及步骤2)配制的苯溶液分别加入到步骤1)中含有Pseudomonasstutzeri 1317(pSPM01)的发酵液中，使得发酵液中苯的浓度分别为5、10、15mL/L，然后在35℃、200rpm下继续摇床培养8h，培养结束后用Bio-RAD公司(美国)Biologic Duo-Flow HPLC系统(色谱柱为迪马公司(中国)DiamonsilC18烷基化硅柱；流动相为甲醇∶水＝1∶1的溶液，流速为0.6mL/min。进样量为50μl。检测器使用Biologic Duo-Flow HPLC系统的紫外检测器，波长设定为254nm)检测发酵液中的DHCD含量，方法如下A、绘制标准曲线将DHCD标样配制成1g/L的母液，稀释2.5-200倍，用上述检测方法及条件进行HPLC检测，并绘制出峰面积—浓度标准曲线；B、待检样品制备将发酵液10000rpm离心5min，取上清，用去离子水稀释20-200倍，并用0.45μm微孔滤膜过滤得到待检测样品。
C、用上述检测方法及条件进行HPLC检测，根据峰面积及标准曲线算出发酵液中DHCD的浓度。
Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)不同发酵液样品中的DHCD含量检测结果如表2所示，表明利用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)发酵表达的甲苯双加氧酶，可将底物苯转化成DHCD，且培养基中苯的浓度为5mL/L时，DHCD产量较高。
表2用Pseudomonas stutzeri 1317(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验结果
实施例4、用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验1)将Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LBG-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h；2)将苯溶解于石蜡中配成苯溶液，苯与石蜡的体积比分别为1∶1和1∶3；3)将苯及步骤2)配制的苯溶液分别加入到步骤1)中含有Pseudomonasputida KT2442(pSPM01)的发酵液中，使得发酵液中苯的浓度分别为5、10、15mL/L，然后在30℃、200rpm下继续摇床培养8h，培养结束后用与实施例3相同的方法检测发酵液中的DHCD含量，Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)不同发酵液样品中的DHCD含量检测结果如表3所示，表明利用Pseudomonasputida KT2442(pSPM01)发酵表达的甲苯双加氧酶，可将底物苯转化成DHCD，且培养基中苯的浓度为5mL/L时，DHCD产量较高。
表3用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验结果
实施例5、用Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验1)将Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到重组假单胞菌专用培养基III中，在30℃、200rpm下摇床培养30h；2)将苯溶解于石蜡中配成苯溶液，苯与石蜡的体积比分别为1∶1和1∶3；3)将苯及步骤2)配制的苯溶液分别加入到步骤1)中含有Pseudomonasputida KT2440(pSPM01)的发酵液中，使得发酵液中苯的浓度分别为5、10、15mL/L，然后在30℃、200rpm下继续摇床培养8h，培养结束后用与实施例3相同的方法检测发酵液中的DHCD含量，Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)不同发酵液样品中的DHCD含量检测结果如表4所示，表明利用Pseudomonasputida KT2440(pSPM01)发酵表达的甲苯双加氧酶，可将底物苯转化成DHCD，且培养基中苯的浓度为5mL/L时，DHCD产量较高。
表4用Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)转化苯生产DHCD的摇瓶实验结果
实施例6、用Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)转化苯生产DHCD的摇瓶实验1)将Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)接种于LB-Km液体培养基中，在35℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LBG-Km液体培养基中，在35℃、200rpm下摇床培养12h；2)将苯溶解于豆油中配成苯溶液，苯与豆油的体积比分别为1∶1和1∶3；3)将苯及步骤2)配制的苯溶液分别加入到步骤1)中含有Pseudomonasaeruginosa PAO1(pSPM01-1)的发酵液中，使得发酵液中苯的浓度分别为5、10、15mL/L，然后在35℃、200rpm下继续摇床培养8h，培养结束后用与实施例3相同的方法检测发酵液中的DHCD含量，Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)不同发酵液样品中的DHCD含量检测结果如表5所示，表明利用Pseudomonasaeruginosa PAO1(pSPM01-1)发酵表达的氯苯双加氧酶，可将底物苯转化成DHCD，且培养基中苯的浓度为5mL/L时，DHCD产量较高。
表5用Pseudomonas aeruginosa PAO1(pSPM01-1)转化苯生产DHCD的摇瓶实验结果
实施例7、重组菌Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)转化苯生产DHCD的小型发酵罐实验1)将Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)接种于LB-Km液体培养基中，在30℃、200rpm下摇床培养12h，再按5％(V/V)的比例将菌液接种到LBG-Km液体培养基中，在35℃、200rpm下摇床培养12h，然后按10％(V/V)的比例将菌液接种到6L小型发酵罐中，发酵液体积为3L，培养基为重组假单胞菌专用培养基II，在初始pH 7.0(pH通过5M NaOH自动控制)，通气量为1L空气/L发酵液/h，溶氧控制值为饱和值的20％，通过搅拌自动控制，搅拌转速为200-800rpm，发酵培养至12h，将pH值控制在7.2；2)将苯溶解于石蜡中配成苯溶液，苯与石蜡的体积比分别为1∶1和1∶3；3)分别用分批加入(每隔1小时向每升发酵液中添加20mL苯或含有该体积苯的苯溶液)和连续流加的方式(流加速度为每小时20mL苯或含有同体积苯的苯溶液)将苯及步骤2)配制的苯溶液分别加入到步骤1)中含有Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)的发酵液中，培养过程中每隔2h使用与实施例3相同的方法检测发酵液中的DHCD含量，当DHCD产量不再增加时，发酵培养结束。Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)不同发酵液样品中的DHCD含量检测结果如表6所示，表明利用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)发酵表达的甲苯双加氧酶，可将底物苯转化成DHCD，且采用分批加入和流加的方式均可获得较高产量的DHCD。
表6用Pseudomonas putida KT2442(pSPM01)转化苯生产DHCD的小型发酵罐实验结果
权利要求
1.表达苯环双加氧酶的工程菌，是将含有苯环双加氧酶基因的表达载体导入假单胞菌中得到的重组假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述苯环双加氧酶基因为甲苯双加氧酶基因。
3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述甲苯双加氧酶基因为NCBIGenBank号为J04996所述的TodC1、TodC2、TodB和TodA基因。
4.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述苯环双加氧酶基因为氯苯双加氧酶基因。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于所述氯苯双加氧酶基因为NCBIGenbank号为U15298所述的tcbAa、tcbAb、tcbAc和tcbAd基因。
6.根据权利要求1-5任一所述的工程菌，其特征在于用于构建所述含有苯环双加氧酶基因的表达载体的出发载体为pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-5或pBBR1MCS-3。
7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于所述含有苯环双加氧酶基因的表达载体为pSPM01或pSPM01-1。
8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于所述假单胞菌为Pseudomonasputida KT2442、Pseudomonas putida KT2440、Pseudomonas stutzeri 1317或Pseudomonas aeruginosa PAO1。
9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为Pseudomonas putidaKT2442(pSPM01)、Pseudomonas putida KT2440(pSPM01)、Pseudomonas stutzeri1317(pSPM01)或Pseudomonas aeruginosa PA01(pSPM01-1)。
10.一种顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯的制备方法，是发酵权利要求1所述的表达苯环双加氧酶的工程菌，获得苯环双加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，每小时加入到每升发酵液中苯的含量为10-30mL，然后继续发酵8-24小时，得到顺-1，2-二羟基-3，5-环己二烯；所述苯溶液中的溶剂为石蜡或豆油，苯与溶剂的体积比为1∶1-3。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述发酵培养基为下述三种培养基中的任意一种1)每升培养基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，NaCl 8-12g/L，葡萄糖18-22g/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余为水。2)每升培养基含酵母提取物4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，葡萄糖40-60g/L，(NH4)2SO45-7g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余为水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O 18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。3)每升培养基含月桂酸7-9g/L，(NH4)2SO41.8-2.2g/L；MgSO40.38-0.45g/L；Na2HPO4·12H2O 9.6-9.7g/L；KH2PO41.2-1.8g/L，微量元素溶液I8-12mL/L，微量元素溶液II 0.8-1.2mL/L，硫酸卡那霉素50μg/mL，其余为水；每升微量元素溶液I含Fe(III)-NH4-Citrate 4-6g/L，CaCl2·2H2O 1.8-2.2g/L，其余为0.4-0.6M HCl；每升微量元素溶液II含ZnSO4·7H2O 80-120mg/L，MnCl2·4H2O 25-35mg/L，H3BO3280-320mg/L，CoCl2·6H2O 180-220mg/L，CuSO4·5H2O 8-12mg/L，NiCl2·6H2O18-22mg/L，NaMoO4·2H2O 28-32mg/L，其余为0.4-0.6M HCl。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述发酵温度为30-35℃。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述将苯或苯溶液加入发酵液中的方式为流加或分批补加。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述流加速度为10～30mL/h；所述分批补加的方式为每隔1小时每升发酵液中添加10～30mL苯或苯溶液。
全文摘要
本发明公开了表达苯环双加氧酶的工程菌及其应用，特别是涉及一种苯环双加氧酶的专用表达工程菌与该工程菌在生产顺－1，2－二羟基－3，5－环己二烯中的应用。该工程菌是将含有苯环双加氧酶基因的表达载体导入假单胞菌中得到的。一种顺－3，5－二羟基－1，2－环己二烯的制备方法，是发酵所述表达苯环双加氧酶的工程菌，获得苯环双加氧酶，再加入底物苯或苯溶液，每小时加入到每升发酵液中苯的含量为10－30mL，然后继续发酵8－24小时，得到顺－1，2－二羟基－3，5－环己二烯；所述苯溶液中的溶剂为石蜡或豆油，苯与溶剂的体积比为1∶1－3。本发明苯环双加氧酶的专用表达工程菌将在DHCD的工业化生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12P7/02GK1869200SQ20061008060
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者陈国强, 欧阳少平, 孙尚瑜, 陈金春 申请人:清华大学