一种木糖还原酶突变体、基因工程菌及在生产木糖醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程和生物技术领域，尤其设及一种木糖还原酶突变体、基因工 程菌及在生产木糖醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 玉米忍半纤维素水解液是目前国内生产木糖醇的主要原料，其除主要成分木糖 夕h还含有葡萄糖、阿拉伯糖等其它成分。在木糖醇的工业化生产中，儀催化加氨时，其对半 纤维素水解液中各种糖没有选择性，在催化木糖还原生产木糖醇时也会催化其它糖类生成 相应的糖醇，影响了木糖醇的产品质量。所W，在进行化学催化之前，需要对半纤维素水解 液中的木糖进行分离和纯化，尽可能除去水解液中的杂糖，运就需要额外的分离步骤，无疑 增加了生产成本。作为水解液中含量仅次于木糖的阿拉伯糖，是木糖的同分异构体，与木糖 的分离难度大，导致儀催化后产物中有阿拉伯糖醇的存在，而木糖醇中阿拉伯糖醇的去除 更加困难，所W使用化学催化获得高纯度的木糖醇较为困难，成本较高。目前市场上高纯度 的木糖醇的价格往往是普通木糖醇价格的几倍到十几倍(Ravella S R，Galla曲er J，Fish S,et al.Overview on commercial production of xylitol,economic analysis and market trends[M] .D-xylitol. Springer. 2012:291-306.)，因此提高木糖醇的纯度对提高 其附加值有着重要的现实意义。
[0003] 目前虽然有报道酵母可W利用半纤维素水解液生产木糖醇，然而天然存在的木糖 还原酶，其对底物木糖没有绝对的专一性，在还原木糖的同时也可W催化其它多种糖类特 别是阿拉伯糖，生成相应的醇，运就导致副产物阿拉伯糖醇的产生。此外，在产物中会残留 一些杂糖，因为很多酵母在木糖存在的情况下，不能够利用阿拉伯糖、半乳糖等糖类，运样 会增加下游产物分离成本(Yoon B H, Jeon W Y,Shim W Y,et al 丄-arabinose pathway engineering for 曰r曰bitol-free xylitol production in C曰ndid曰 tropic曰lis[J] .Biotechnol Lett，2011，33(4): 747-753.)。虽然目前发现的绝大多数木糖还原酶选择性 不高，但作为天然大分子，通过定向进化、饱和突变或定向改造提高底物专一性是完全可行 的，并且有过很多成功的例子。Woodyer等从粗糖脉抱菌中分离到一株木糖还原酶，其对木 糖的催化效率是阿拉伯糖的2.4倍，进行静息细胞转化实验时可W显著提高产物中木糖醇 的tk例（Woodyer R,Simurdiak Μ,van der Donk W A,et al.Heterologous expression, purific曰tion,曰nd ch曰r曰cteriz曰tion of 曰 highly 曰ctive xylose reduct曰se from Neurospora crassa[J] .Appl linviron Microbiol,2005,71(3): 1642-1647.)。为了进一步 提高木糖还原酶对木糖的选择性，化ir等对其进行了定向进化，获得了一个对阿拉伯糖选 择性提高50倍的突变体，在进行静息细胞转化时，阿拉伯糖醇含量显著减少，但并没有完全 争肖除（Nair N U,Zhao Η.Evolution in reverse : engineering a D-xylose-specif ic 巧lose reductase[J].化emBio化em,2008,9(8): 1213-1215.);为了更进一步提高生物催 化的选择性，化ir等构建了一株能有效利用阿拉伯糖作为碳源的大肠杆菌(crp*)，此菌联 合获得的突变酶在等比例转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖时，产物中已检测不到阿拉伯糖醇。 但是在试验中使用相同的突变酶，使用大肠杆菌(野生型crp)转化半纤维素水解液时，摇瓶 发酵实验中有少量阿拉伯糖醇产生，但在发酵罐发酵中水解液中几乎所有阿拉伯糖都转化 成阿拉伯糖醇（Su B,Wu M,Zhang Z,et al.Efficient production of xylitol from hemicellulosic hydrolysate using engineered Escherichia coli[J].Metab Eng, 2015,31(112-122.))〇
[0004] 在阿拉伯糖进入细胞后，可W从W下两个方面着手减少阿拉伯糖醇的产生：1)木 糖还原酶的表达量相对于代谢阿拉伯糖的酶来说，不能过量太多，否者会阻隔阿拉伯糖和 代谢阿拉伯糖的酶，导致阿拉伯糖被还原而不会被代谢，所W控制好木糖还原酶的表达量 对生产高纯度木糖醇至关重要;2)提高木糖还原酶的选择性，使其对阿拉伯糖的催化活性 降低甚至无活性，运样即使有大量木糖还原酶表达也不会造成阿拉伯糖醇的产生，但目前 来说获得对木糖绝对专一的木糖还原酶还是比较困难的。为了获得较高的生产效率和高纯 度的木糖醇，只有结合运两种策略，才能达到目的。
【发明内容】
[0005] 基于现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种对木糖选择性高的木糖还原 酶突变体。
[0006] 一种木糖还原酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0007] 该木糖还原酶突变体来源为将来自粗糖脉抱菌的木糖还原酶的8个氨基酸分别进 行突变，8 个氨基酸分别突变为:L102V，L107M，L109Q，I110C，V114I，KSN271-273RTT，运些突 变点都是对阿拉伯糖识别影响较大而对木糖的识别没有太大影响，经过运些点突变后，所 得的木糖还原酶突变体对底物木糖的选择性会大大提高，降低在木糖醇生产中对阿拉伯糖 的识别催化。获得的木糖还原酶突变体命名为XR-8M。
[000引本发明还提供了编码所述木糖还原酶突变体的基因，命名为xr-8m，基因序列如 SEQ ID No.2所示。当然，由于密码子的简并性，根据所使用的表达菌的种类不同，可进行适 当的密码子优化。
[0009] 本发明还提供了所述木糖还原酶突变体在生产木糖醇中的应用。
[0010] 本发明还提供了一种基因工程菌，包含所述的基因。转基因方式可W是质粒表达， 也可W是将外源基因整合到基因组上，形成稳定表达外源基因的整合型工程菌。
[0011] 所述基因工程菌的宿主细胞可W是大肠杆菌、酵母或其他常用于表达外源基因的 宿主细胞。优选的，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌相对其他宿主细胞来 说，结构简单，发酵条件较简单，成本低，在高效表达目的基因的前提下，首先选用大肠杆 困。
[0012] 优选的，所述木糖还原酶突变体基因整合到大肠杆菌的基因组上，获得整合型工 程菌。基因整合进基因组后，不存在质粒分离不稳定的问题，也不需要添加抗生素，在降低 生产成本的同时，减少了抗药性的问题，并且其表达不需要诱导剂，进一步降低生产成本。
[0013] 优选的，所述木糖还原酶突变体基因的拷贝数不小于2。拷贝数的增加有利于提高 目的蛋白表达量，但增加到一定数量后，由于基因工程菌本身所限，目的蛋白表达量不再增 加，而对基因工程菌的负担却加重了，运样反而不利于目的蛋白的有效高表达。所W筛选合 适的拷贝数是需要的。
[0014] 优选的，所述木糖还原酶突变体基因上游的启动子为组成型启动子P43。实验表 明，含启动子P43的表达载体转化大肠杆菌后得到的基因工程菌在木糖醇生产中的生产效 率更高，并且不需要昂贵的诱导剂，所W，优选组成型的P43启动子。
[0015] 本发明又提供了所述基因工程菌在生产木糖醇中的应用。将包含所述基因工程菌 的种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养一段时间后，向发酵液中添加玉米忍半 纤维素水解液(酸解中和获得），继续进行发酵，发酵完成后，将发酵产物进行分离纯化获得 木糖醇。
[0016] 本发明对木糖还原酶进行了 8个氨基酸位点的突变，降低了其催化阿拉伯糖为阿 拉伯糖醇的活性，提高了其转化木糖醇的选择性，生物转化产物中副产物阿拉伯糖醇已经 检测不到，本发明可使生物转化生产木糖醇下游的分离步骤简化，降低生产成本，提高木糖 醇产品的纯度。
【附图说明】
[0017] 图1为利用大肠杆菌生产高纯度木糖醇策略流程图；
[0018] 图2为来源于不同微生物的木糖还原酶氨基酸序列保守性分析图；
[0019] 图3为转入不同木糖还原酶突变体基因的工程菌木糖醇生产性能比较图，
[0020] 其中，（A)服442,（B)服452,（C)服412,（D)服462;
[0021] 图4为菌株HK462利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图；
[0022] 图5为菌株IS5-d利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图；
[0023] 图6为菌株IS5-M利用半纤维素水解液生产木糖醇发酵结果图。
[0024] Concentration(g/L):浓度（g/L) ;Time 化）：发酵时间化）；Glucose:葡萄糖； X}dose:木糖;Arabinose:阿拉伯糖;X}ditol:木糖醇;Arabitol:阿拉伯糖醇；0〇6日日:细胞浓 度;Xylose reduc1:ase activity:木糖还原酶总酶活
【具体实施方式】
[0025] 本发明是在申请号为201510196843