微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及低温葡甘聚糖酶微生物发酵生产的方法。
【背景技术】
[0002]葡甘聚糖酶(Glucomannanase)是一种能将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖(konjacoligo-saccharide, K0S)的可诱导细胞外泌酶(董桂清，β _甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研宄，广西轻工业，2007)。葡甘低聚糖属于功能性低聚糖，具有极其显著的降脂作用，可以作为高血脂、糖尿病辅助治疗产品(Hsiao-Ling Chen，Konjac SupplementAlleviated Hypercholesterolemia and Hyperglyeemia in Type 2Diabetic Subjects—A Randomized Double-Blind Trial， Journal ofthe American College ofNutrit1n，2003);因其能够减少肠内氨的生成和吸收，可以减轻肝脏对血氨的解毒负担(陈黎，魔芋低聚糖降胆作用的初步研宄，中国生化药物杂志，2003);同时葡甘低聚糖能够提高体内超氧化物歧化酶活性，增强机体抗氧化能力(杨艳燕，魔芋低聚糖对小鼠血糖含量和抗氧化能力的影响，中草药，2001)。但是目前有关葡甘低聚糖产品，只有少量出现在国外市场，国内基本无此类产品(周海燕，发酵生产魔芋葡苷聚糖酶，中国生物工程杂志，2005)。
[0003]国内对于葡甘聚糖酶的研宄尚处于起步阶段，主要包括菌种选育、产酶条件优化、酶分离纯化、酶学性质、基因克隆等(周海燕，高活性魔芋葡甘聚糖酶产生菌B23的鉴定及培养条件优化，湖北农业科学，2005 ;董桂清，甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研宄，广西轻工业，2007 ;许剑，一株产常温葡甘聚糖酶的芽孢杆菌的分离、鉴定及产酶发酵条件的研宄，基因组学与应用生物学，2012 ;)。微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的产业化、规模化生产及应用还未见报道。
[0004]微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶与中、高温葡甘聚糖酶相比具有很大的应用优势，低温葡甘聚糖酶的应用将对传统的食品、医药等领域产生深远的影响。微生物发酵葡甘聚糖酶工业化生产可创造良好的经济效益和社会效益(周海燕，发酵生产魔芋葡苷聚糖酶，中国生物工程杂志，2005)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法，该方法是将微生物经过低温驯化后，在18?24°C液体培养基中发酵生产低温葡甘聚糖酶再经过分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。本发明的技术方案如下:微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶的方法具体包括以下步骤:
[0006](I)将能产生葡甘聚糖酶的菌种活化，再经过逐级低温驯化，驯化温度由高到低，24°C — 22°C — 20°C — 18°C，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；该菌种的低温驯化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7Η20 0.001 ?0.004%，琼脂 1.8 ?2.0%,自来水 I OOmL，pH 6.0 ?6.5，于 115°C、0.1Mpa蒸汽灭菌15min ；
[0007]所述的能产生葡甘聚糖酶的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号:1.1918或1.439或1.440或1.460 ；
[0008](2)按常规方法将步骤⑴中低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于18?24°C逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；所述液体种子培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaNO30.2 ?0.7 %，MgSO4.7H20 0.3 ?0.5 %，KCl 0.3 ?0.5 %，K2HPO40.1 ?0.3 %，FeSO4.7H20 0.001 ?0.004%，自来水 100mL，pH 6.0 ?6.5，于 115°C、0.IMpa 蒸汽灭菌15min ；
[0009](3)将液体二级种子按发酵液体积的4?10%接种量接入发酵产酶培养基中，在18?24°C培养72?132h时，即微生物发酵生产低温葡甘聚糖酶结束；所述的发酵产酶培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?4.0%, NaNO30.2?0.7%, MgSO4.7H20 0.3?
0.5%,KCl 0.3 ?0.5%,K2HPO40.1 ?0.3%, FeSO4.7H200.001 ?0.004%,自来水 10mL,pH 6.0 ?6.5，于 115 °C > 0.1Mpa 蒸汽灭菌 15min ；
[0010](4)将步骤(3)的发酵液在4000?8000rpm离心收集上清液，即为粗酶液；
[0011](5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)中得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
[0012]进一步的，步骤(I)产生葡甘聚糖酶菌种的活化培养基按重量百分比计包含:魔芋精粉0.4?1.0%，酵母膏0.4?0.9%，蛋白胨0.3?1.0%，NaCl 0.5?2.5%，琼脂
1.8 ?2.0%，自来水 10OmT,,于 115°C、0.IMpa 蒸汽灭菌 15min。
[0013]本发明中使用的能产生葡甘聚糖酶的菌种初期活化和生长条件按中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的说明进行。葡甘聚糖酶产生菌菌种先活化、再经过逐级低温驯化后发酵生产低温低温葡甘聚糖酶，按本发明产酶条件发酵生产低温葡甘聚糖酶，低温驯化后的菌种在4°C环境中可保存2个月，用10?25vt%甘油制成的菌悬液在_80°C条件下可以长期保藏。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0015](I)本发明方法发酵生产的低温葡甘聚糖酶经过温和的热处理即可使低温酶的活力丧失，而低温或适温处理不会影响产品的品质，尤其是在低温下具有高酶活力及高催化效率，不但提尚原料的利用率及转化率，还提尚了生广效率，改善并提尚广品质量；
[0016](2)本发明生产的低温葡甘聚糖酶可以将葡甘聚糖降解为不同聚合度的功能性葡甘低聚糖，此低聚糖具有降血糖、降血脂、抗氧化等生理功能，在食品、医药等方面具有较大应用价值；该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低，具有更广阔的工业开发价值与市场应用优势；
[0017](3)本发明方法简化了加工工艺，缩短处理时间并从根本上避免中温、高温酶的加热、冷却设备的环节，省却昂贵的加热或冷却费用，降低了生产成本，在节能方面有相当大的优势。
【具体实施方式】
[0018]下面通过实施例对本发明做进一步说明，但不限制本发明。如无特殊说明，本发明所有原料均市售可得，优选的，魔芋精粉购自武汉市清江魔芋制品有限公司。
[0019]实施例1
[0020]I)培养基制备
[0021]①菌种活化培养基(wt % ):魔芋精粉0.4，酵母膏0.4，蛋白胨0.3，NaCl 0.5，琼月旨1.8，自来水100mL，于115°C、0.IMpa蒸汽灭菌15min ；
[0022]②菌种低温驯化培养基(wt% ):魔芋精粉0.4，NaNO30.2，MgSO4.7H20 0.3，KCl0.3，K2HPO40.LFeSO4.7Η20 0.001，琼脂 1.8，自来水 10mL，pH 6.5，于 115°C、0.1Mpa 蒸汽灭菌15min ；
[0023]③液体种子培养基(wt% ):魔芋精粉0.4，酵母膏0.4，蛋白胨0.3，NaNO30.2，MgSO4.7Η20 0.3, KCl 0.3，K2HPO40.1，FeSO4.7Η20 0.001，自来水 100mL，pH 6.5，于115。〇、0.1Mpa蒸汽灭菌15min ；
[0024]④发酵产酶培养基(wt%):魔芋精粉 0.4，NaNO30.2，MgSO4.7H20 0.3，KCl 0.3，K2HPO40.1，FeSO4.7H20 0.001，自来水 10mL, pH 6.5，于 115°C、0.1Mpa 蒸汽灭菌 15min ；
[0025]2)将产生葡甘聚糖酶的菌种，按中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的菌种说明进行初始活化；
[0026]3)将上述活化好的菌种在低温驯化培养基中逐级低温驯化，驯化温度由高到低，24°C — 22°C — 20°C— 18°C，驯化8天左右，使其在低温环境中生长良好，当菌种能在低温下稳定生长即驯化结束；
[0027]4)按常规方法将低温驯化后的葡甘聚糖酶产生菌在液体种子培养基中于22?24°C培养48?72h后，按5vt%的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子;
[0028]5)将4)中制备的液体二级种子按发酵液体积的4?6%的接种量接入5L的发酵产酶培养基中，在22?24°C培养120?132h时，即微生物发酵