专利名称：聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法
技术领域：
本发明为一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。
背景技术：
熊胆因珍稀名贵，市场价格昂贵，市场常有以鸡、牛、羊、猪胆汁干燥加工成粉混充熊胆粉出售现象，掺假现象极为严重。熊胆粉掺假除影响药品本身质量外，更重要的是影响中药的疗效及配伍而给患者造成不良后果，所以熊胆粉及其制剂真伪的鉴别在实际中拥有重要的意义。由于中成药的组成及成分复杂，干扰因素多，用传统生药学方法鉴定其真伪及纯度有较大的难度。而DNA水平上鉴定打破了中药常规鉴定的界限，可以从生物的种或种以下水平进行准确地鉴定，不受组织或药材部位对鉴定的影响，因而对于准确、合理、安全用药、保障患者的权益具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有所存在的问题，提供一种分辨力强、重现性好的一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法。本发明的具体方法如下
a、样品(熊胆粉与伪品)的基因组提取方法
取熊胆粉2克，伪品鸡、羊、牛、猪胆汁干燥品各2克，放入各自的试管中，采用酚-氯仿-异戊醇抽提方法对其基因组DNA进行提取。b、用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’
下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ c、用于扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件
在反应体系中取50ng/ μ 1样品的DNA模板2 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，2. 5mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 2 μ 1，上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’ 1 μ 1，下游引物5， CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ 1 μ 1，聚合酶0. 2 μ 1放入试管中，用灭菌去离子水补充至25 μ 1。其扩增条件94. O0C 8分钟；之后；35个循环包括94. 0°C 1分钟，58. 6°C 1 分钟，72.0°C 2分钟，最后72.0°C 10分钟35个循环；得到聚合酶链式反应扩增产物。d、聚合酶链式反应扩增产物的检测方法
在水平电泳槽中制备其浓度1. 5%琼脂糖凝胶；将上述聚合酶链式反应扩增产物5μ1 加入点样孔，在对比孔中加入5 μ 分子量标准2000型作为对比；电压120 V，电泳40min 后在图谱成像系统中成像。e、通过电泳图谱判断熊胆样品的真伪。本发明的有益效果是
该方法不仅可以对来源相近的正品与混淆品进行区别，而且可以对干燥加工成粉熊胆粉进行鉴别。熊胆粉是熊分泌物，很难由药材推逆原动物的品种与质量，而来源相近的正品与混淆品则更不易区分。因此，很多传统的中药鉴定方法无法解决目前许多动物类中药的鉴别问题。用本方法进行中药材DNA分子标记鉴别，只需取极少量的样品即可提得足够用于多聚酶链反应(PCR)扩增的DNA模板，然后进行鉴别判定。该方法速度快、分辨力强、重现性好，可以澄清熊胆及其粉剂的真伪和优劣(涉及剂量、比例)，弥补传统中药鉴定中动物类中药鉴别的弱项，为临床合理用药提供科学依据。该技术的运用是提高中药材的质量，保障千百万人民身体健康和生命的安危、保障中医疗效的基础；可以有效的遏制伪造、掺假、滥用、误用、混用等现象，提高中医药的信誉，保障人民用药安全，其经济效益不言而喻的。附表熊胆粉与伪品扩增后的结果
权利要求
1. 一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法，其特征在于，a、样品的基因组提取方法取熊胆粉2克，伪品鸡、羊、牛、猪胆汁干燥品各2克，放入各自的试管中，采用酚-氯仿-异戊醇抽提方法对其基因组DNA进行提取；b、用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’c、用于扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件在反应体系中取50ng/μ 1样品的DNA模板2 μ 1，10倍缓冲液 2μ1，2. 5mM的脱氧核糖核苷三磷酸2 μ 1，上游引物5’ CGCCATGAACCCTCCCTCTA 3’ 1μ 1,下游引物5’ CCTGGGCAGTGAATCCCTCTT 3’ 1 μ 1，聚合酶0. 2 μ 1放入试管中，用灭菌去离子水补充至 25μ 1 ；其扩增条件94. O0C 8分钟；之后35个循环包括94. 0°C 1分钟，58. 6V 1分钟， 72. O0C 2分钟，最后72. O0C 10分钟；得到聚合酶链式反应扩增产物；d、聚合酶链式反应扩增产物的检测方法在水平电泳槽中制备其浓度1. 5%琼脂糖凝胶；将上述聚合酶链式反应扩增产物5μ1 加入点样孔，在对比孔中加入5 μ 分子量标准2000型作为对比；电压120 V，电泳40min 后在图谱成像系统中成像；e、通过电泳图谱判断熊胆样品的真伪。
全文摘要
本发明为一种聚合酶链式反应鉴别熊胆粉真伪的方法，包括样品的基因组提取，用于扩增的样品的聚合酶链式反应引物，及扩增的聚合酶链式反应体系和扩增条件和扩增结果，聚合酶链式反应扩增产物的检测系统来鉴别熊胆粉样品的真伪；该鉴别方法简单可靠，减少假冒伪劣的中药材熊胆及其熊胆粉给患者造成的不良后果，对于提高中药质量，保障群众用药安全以及更好地开拓中药的国内外市场等方面都具有十分重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK102363817SQ20111038962
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者张敏, 田玉民, 苏玉虹 申请人:辽宁医学院