专利名称：一种玻璃酸钠的酶解方法
技术领域：
本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法。
背景技术：
玻璃酸(hyaluronic acid, HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-α — 4)糖苷键和β-α —幻糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，其重均分子量一般为10万 1000万Da，分子中两种单糖的摩尔比为1 1。目前，酶解法制备低分子量HA和寡聚HA主要采用玻璃酸酶，其最适反应条件是 底物浓度为10g/L，酶浓度为150000U/L，反应液的pH值为5. 0，反应温度为50°C ；如需制得分子量为1乂104的撤，酶解时间为池。控制反应时间，可制得不同分子量的HA，但是，目前酶活力为50万u/g的医药级产品市场价为60万元/Kg，致使用玻璃酸酶酶解玻璃酸的成本过高。另外，不同微生物来源的乳糖酶糖苷键键型作用存在特异性，实验研究表明米曲霉乳耱酶的水解优先顺序是0-1_6键> 0-1_4键> β-1-3键.乳酸克鲁维酵母乳糖酶的水解顺序则是0-1_4键> 0-1_6键> β-1-3键，而环状芽孢杆菌对β-1-4键具有高度的键专一性。
发明内容
本发明的目的是提供一种反应条件温和，生产成本低的玻璃酸钠的酶解方法。为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案是—种玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将玻璃酸钠溶解在pH值为6. 0-7. 0的磷酸盐缓冲液中得溶液A ；(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β -半乳糖苷酶，于35-50°C酶解60-320min 后，加热至70-85°C使酶失活，加热时间为8-iaiiin得酶解液；(3)将步骤( 所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。在本发明的一优选实施例中，所述步骤(1)中，IL磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g，更优选为IL磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。在本发明的一更优选实施例中，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液PH值为6. 4。在本发明的一优选实施例中，所述步骤O)中，IL溶液A中加入酶的量为 100000-2500000U，更优选为 1500000U。在本发明的一更优选实施例中，所述步骤O)，酶解温度为50°C。在本发明的一更优选实施例中，所述步骤0)，快速加热至75°C使酶失活，加热时间为IOmin。在本发明的一优选实施例中，所述的β -半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。在本发明的一优选实施例中，所述步骤(3)中，用氯代烷基十六吡啶进行络合。
本发明与玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的最佳酶解条件反应液pH值5. 0，反应温度 50°C相比，β -半乳糖苷酶的酶解条件反应液pH值6. 0-7. 0，反应温度35-50°C更温和。此外，虽然制得相同分子量玻璃酸钠，所需半乳糖苷酶的酶用量要大于玻璃酸酶，但是同级别酶，每单位酶活力(U)的价格，玻璃酸酶价格为β-半乳糖苷酶的百倍以上，(医药级产品市场价β-半乳糖苷酶，酶活力5万u/g，500元/Kg;玻璃酸酶，酶活力 50万u/g，60万元/Kg)。因此，本发明能够大大降低制备低分子量玻璃酸钠及其寡糖的生产成本。
具体实施例方式通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。实施例1取0.2g玻璃酸钠，分子量为118万Da，溶解于装有100ml pH值为6. 0磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为2000000U/L，于温控为45°C的水浴振荡器内酶解210min，反应结束后，快速升温至75°C， 使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例2取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. O磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为100000U/L，于温控为45°C的水浴振荡器内酶解180min，反应结束后，快速升温至75°C， 使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例3取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为150000U/L，于温控为45°C的水浴振荡器内酶解^Omin，反应结束后，快速升温至75°C， 使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例4取0.5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6.4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为 750000U/L，于温控为50°C的水浴振荡器内酶解60min，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例5取0. 5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为7. O磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为500000U/L，于温控为45°C的水浴振荡器内酶解320min，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例6取0. 5g玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为1000000U/L，于温控为50°C的水浴振荡器内酶解120min，反应结束后，快速升温至75°C， 使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA 供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例7取Ig玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为 750000U/L，于温控为50°C的水浴振荡器内酶解60min，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例8取Ig玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为 1500000U/L，于温控为50°C的水浴振荡器内酶解150min，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例9取Ig玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入半乳糖苷酶，其微生物来源为环状芽胞杆菌)酶用量为 1500000U/L，于温控为50°C的水浴振荡器内酶解210min，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例10取Ig玻璃酸钠，分子量为100万Da，溶解于装有IOOml pH值为6. 4磷酸缓冲液的烧杯中，待完全溶解后，加入β -半乳糖苷酶其微生物来源为环状芽胞杆菌，酶用量为 1500000U/L，于温控为45°C的水浴振荡器内酶解MOmin，反应结束后，快速升温至75°C，使酶失活lOmin，然后，经氯代烷基十六吡啶(CPC)络合、解离、醇沉淀及真空干燥后得到HA供试品，采用HPGPC法检测其分子量。实施例检测数据汇总如下如表1所示表 权利要求
1 一种玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将玻璃酸钠溶解在PH值为6.0-7. 0的磷酸盐缓冲液中得溶液A ；(2)将步骤(1)所得的溶液A中加入β-半乳糖苷酶，于35-50°C酶解60-320min后， 加热至70-85°C使酶失活，加热时间为8-iaiiin得酶解液；(3)将步骤( 所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。
2.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，IL磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为5-10g。
3.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，IL磷酸盐缓冲液中加入玻璃酸钠的量为10g。
4.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液PH值为6.4。
5.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤O)中，IL溶液A 中加入酶的量为100000-2500000U，更优选为1500000U。
6.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤O)，酶解温度为 50 "C。
7.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤O)，快速加热至 75°C使酶失活，加热时间为lOmin。
8.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述的半乳糖苷酶的微生物来源为环状芽胞杆菌。
9.根据权利要求1所述玻璃酸钠的酶解方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用氯代烷基十六吡啶进行络合。
全文摘要
本发明涉及一种玻璃酸钠的酶解方法，首先，将玻璃酸钠溶解在pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中；然后将所得的溶液中加入β-半乳糖苷酶，于35-50℃酶解60-320min后，快速升温至70-85℃使酶失活，加热时间为8-12min；最后，将所得的酶解液进行络合、解离、醇沉淀和真空干燥。该方法比传统的玻璃酸酶酶解玻璃酸钠的方法条件更温和，且在同等酶活力的前提下，可大大降低生产成本。
文档编号C12P19/14GK102492755SQ20111038961
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者周宁辉, 顾其胜 申请人:上海景峰制药有限公司