检测蛋白酶的活力的制作方法

专利名称：检测蛋白酶的活力的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测液体样品中至少一种蛋白酶活力的方法以及实施这种方法的装
置，所述液体样品中除了含有需要测定其活力的至少一种蛋白酶之外，还含有该蛋白酶相对应的至少一种蛋白酶抑制剂。
背景技术：
检测组织匀浆液或如血清等体液中酶的浓度，可以采用酶法测定和免疫测试(例如ELISA)。 医学文献报道溶酶体蛋白酶参与肿瘤生长、肿瘤侵润和代谢，例如半胱氨酸蛋白
酶组织蛋白酶B、H和L。在这些过程中，能证明如组织蛋白酶B整合到原生质膜上并且分
泌到胞外空间中，而在胞外空间中这些蛋白酶参与降解和分解胞外基质。 在患有各种不同癌症的肿瘤患者中，受肿瘤影响的组织和体液(血液、尿、唾液、
脑脊髓液等)中出现蛋白酶的活力上升，这些蛋白酶可以作为非常有效的肿瘤标记物，这
样一方面可以有助于这些疾病的诊断和预后，另一方面可以作为治疗干预的出发点。例
如，文献中已经讨论用组织蛋白酶B(—种半胱氨酸蛋白酶)作为肿瘤标记物(Cancer
Research 2005， 65 (19) ， 2005年10月1日，第8608页，Kopitz等)。 非常需要有一种检测组织和体液中这些酶含量的可靠检测方法。 理论上来说，免疫测定方法(如ELISA)和酶活力测试可以用于检测生物样品中酶
的浓度。 例如，从Kos等的文章(Clinical Cancer Research第3巻，1815-1822， 1997年
10月(Kos等))中，已经知道能用ELISA方法(免疫学测定)检测组织蛋白酶B。 本文所讨论的酶是蛋白酶，其具有以下两个在测定其浓度时所必须考虑的特性 1.在生物样品中，蛋白酶总是与它们的前体(即它们的酶原)共同存在。 2.在生物样品中，蛋白酶部分或完全地被它们内源性的抑制剂所抑制。 根据血清实验，如果要检测组织蛋白酶B的活力，在检测酶活力之前必须先进行
去抑制。 用免疫学方法来检测样品中这些蛋白酶的量，由于方法本身的原因，只能测定活性酶、被抑制的酶、变性的酶和酶原的总量。 然而，如果在生物样品中同时存在活性酶和被抑制的酶两种形式，采用本发明涉
及酶活力检测的方法和装置，可以分别测定活性酶和被抑制的酶的活力。 在专利EP0776374中公开了用于测定如组织匀浆液等生物样品中酶活力的方法
和装置，其中列举了通过将生物样品通过装满了共价结合有木瓜蛋白酶的琼脂糖凝胶的亲
和层析柱，从而将属于胱抑素超家族的内源性抑制剂从组织蛋白酶中去除。木瓜蛋白酶也
属于半胱氨酸蛋白酶，其对胱抑素的结合亲和力比组织蛋白酶更强，所以木瓜蛋白酶可以
从组织蛋白酶上拉走抑制剂。 在如ELISA等免疫学测试中，利用抗体特异性地检测样品中的酶。尽管免疫学测试通常要比酶法测试灵敏度更高，但抗体不能区分活性酶、被抑制剂抑制的酶、酶原和变性 的酶，例如对半胱氨酸蛋白酶而言。由于在测定生物样品中的酶时，通常主要考虑酶的活 力，因为酶的活力将最终触发或催化生物学行为，前面提到的测试结果中的许多免疫学测 试的意义都不足以用于医学分析和诊断。 文献报道中，通常采用荧光发光底物(AMC)来检测组织样品(匀浆液)中的组织 蛋白酶活力。 然而，也有用AMC来检测体液(脑脊髓液)中组织蛋白酶活力。在这两种检测中都采用了荧光发光底物Z-Arg-Arg-AMC，而没有去除抑制剂。 在上述文献报道的结果中证明，作者相信他们检测了组织样品和体液中的组织蛋
白酶总量。 然而，对组织样品而言，只有在成功地去抑制之后，才能用酶法测定活性酶和被抑 制的酶的总量。 其他引文中报道了对血清中酶活力的检测。 Skrzydlewska，E.等，"评估血清中组织蛋白酶B和D与大肠癌临床病理分级之间 的关系"(World J. Gastroenterol. 2005， 11 (27)，第4225-4229页)中，描述了用酶法检测 血清中的组织蛋白酶B，从Bz-DL-精氨酸-pNA上酶切除对硝基苯胺(pNA)，通过采用光学 检测方法测定来检测酶的活力。 Siewinski， M.等，"比较孕妇血清中半胱氨酸肽酶活力及其抑制剂"(Pakistan Journal of Medical Sciences, 2004， 20 (4)，第381-384页)中，描述了使用荧光测定法测 定组织蛋白酶B的酶活力，其中从底物Z-Arg-Arg-AMC上切下荧光发光的AMC(7-氨基-4 甲基香豆素)。 然而，在上述两个案例中，并没有进行特异性抑制剂的对照实验来证明这些释放 的荧光团确实是由半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶B引起的。在两个案例中都没有在活力检 测前去除抑制剂。 在我们的对照实验中，采用了半胱氨酸蛋白酶的特异性抑制剂E64和组织蛋白酶
B的特异性抑制剂CA-074 (这两种抑制剂都是合成的抑制剂并且市场有售)，发现只有在去
抑制之后，才能在肿瘤患者和有遗传病家族史的健康人的血液中检测属于组织蛋白酶B的
蛋白酶活力，因此血清中的所有组织蛋白酶B都被半胱氨酸蛋白酶抑制剂所抑制。 然而，当用组织样品作为测定蛋白酶活力的生物样品时，其缺点在于只有通过外
科手术或活组织检查(为了肿瘤早期诊断而采用的一种困难的取样方法)才能获得样品。
通常在已经诊断为肿瘤或至少根据某些指数能有理由假设存在肿瘤的阶段，才提取组织样
品。因此需要有一种方法能够检测例如血液、或尿或唾液等容易取得的生物样品中的蛋白
酶浓度。然而，显然很多可以作为标记物(尤其是肿瘤标记物)的蛋白酶在血液中是被各
自的抑制剂所抑制的。 发明目的 本发明的目的是获取一种方法以及实施该方法的可行装置，以简单的方式(并且 对于相关疾病的早期诊断比本领域的现存方法准确性更高，无论如何都要有足够的准确 性)能可靠的检测生物样品或液体(尤其是血清)中的蛋白酶浓度，所述检测也包括与内 源性抑制剂结合而被抑制的这些蛋白酶。这样做的话，没有能检测到蛋白酶的变性形式和酶原。

发明内容
本发明的任务可以通过权利要求1的特性以及与权利要求1相关联的权利要求11 和12的特性得以解决，权利要求1的特性如下 测定液体样品中至少一种蛋白酶的活力的方法，所述样品中除了需要测定活力的 至少一种蛋白酶之外，如有必要，还含有所述蛋白酶相对应的至少一种蛋白酶抑制剂，该方 法包含下列步骤 通过将样品与以共价或者吸附方式结合了抑制剂结合物质的载体相接触，去除样 品中蛋白酶上的蛋白酶抑制剂，所述抑制剂结合物质对蛋白酶抑制剂的亲和/结合强度要 高于蛋白酶本身； 从样品中将载体以及载体上结合的蛋白酶抑制剂一起分离出来； 向样品中加入所述需要测定活力的至少一种蛋白酶的底物，并且记录底物与蛋白
酶的蛋白水解反应； 权利要求11和12的特性如下 在本发明的一个实施方式中，所述至少一种蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶家族，优 选于组织蛋白酶B、H、K、L和/或S。所述至少一种蛋白酶尤其优选为组织蛋白酶B。
从医学角度来说，检测组织蛋白酶B相当重要，因为文献中已经论证了可以用血 液中组织蛋白酶B的浓度上升作为肿瘤的标记物(参见上文)。 在本发明的另 一个优选实施方式中，液体样品为血液样品、血浆或血清。更优选以
血清作为液体样品。在本发明的一个可选实施方式中，液体样品为尿或唾液。 在本发明方法的另一个实施方式中，所述至少一种蛋白酶的底物包括一个C-端
直接或通过连接基团结合有荧光发光团的二肽或寡肽序列，所述荧光发光团可被蛋白酶切
下。在本方法中，荧光发光团在蛋白水解反应的过程中被切下，优选从二肽或寡肽序列上被切下。 被半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B识别并且切割的二肽序列的例子有精氨酸_精氨 酸(Arg-Arg)。因此，例如Z-Arg-Arg-AMC是合适的底物，其中Z代表结合在肽序列N-端的 保护基团。 根据本发明，优选包含二肽或寡肽序列和荧光发光团的未切割底物的荧光发射波
长最大值与在蛋白水解反应中被蛋白酶切下的荧光发光团的荧光发射波长最大值相差至
少20nm，优选至少40nm或至少60nm或至少80nm，尤其优选至少100nm。(如果发射光谱没
有明显的最大值，也可以用发射光谱的代表值(例如统计学代表值))。 如果未切割底物和切下的荧光发光团的荧光发射波长或波长最大值是相同的，或
者两者相当接近，那么未切割底物的自身荧光和切下的荧光发光团的荧光发射都在检测中
被记录了下来。这些荧光发射波长相同的底物和荧光团是本领域已知的。即使荧光发射波
长一致，如果荧光发光团在同一或相近波长的荧光发射强度要显著强于未切割底物，还是
可以用这些底物进行测定的。(在这种情况下，通过分析与不含有酶的阴性对照相比的信号
放大，可以定量酶活力)。这些底物的缺点在于，只有当酶活力强因而荧光发射能有相当显
著的提高的情况下，才能得到明显的结果。因为在酶活力弱的情况下，通常信号太弱，不足以与未切割的底物的自身荧光区分开来。因此，信号被背景噪音所掩盖或者至少不能以显 著的方式从中凸显出来。 底物和切下的荧光发光团的荧光发射间检测波长的变换具有特定的优势，因为在
该波长下只有从底物上切下的荧光发光团被记录了下来，从而只有确实发生的酶反应被记
录了下来。切下的荧光团的发射波长与底物的荧光发射波长的变化越大，对蛋白酶活力检
测的灵敏度越高。只有在加入底物后，被切下的荧光发光团的浓度开始随时间线性增高。 用AMC-底物检测血清中蛋白酶活力的情况下，由于在酶切下的AMC-荧光发光团
的检测波长460nm下血清本身具有很强的自身荧光，使得问题更加复杂化。 我们的实验中，通过用荧光分析仪和AMC底物检测微孔板中血清内组织蛋白酶B
的活力，结果清楚地表明在460nm下给定的检测时间内没有信号从背景荧光中凸现出来，
在这个波长下背景荧光是血清的自身荧光和转而被血清部分淬灭的AMC-底物自身荧光的总和。 然而，令人惊奇的是，用AFC底物，随着酶反应的进行在508nm检测信号出现线性 增高，这是由在酶反应中被切下的AFC-荧光发光团产生荧光发射引起的。
在AFC-荧光发光团的荧光发射波长508nm，血清的自身荧光要远远小于在460nm， 并且在508nm AFC-底物的自身荧光为零。 因此，在这样的检测条件下，用AFC-底物检测血清中的组织蛋白酶B活力要比用 AMC-底物灵敏度高至少IO倍，而且至此才可以用荧光分析仪来检测血清中组织蛋白酶的 活力。 因此，本发明的更优选底物为带有荧光发光团7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC) 的Z-Arg-Arg-AFC(市场有售)。 Bissell， E. R.等，"7_氨基_4_(三氟甲基)-香豆素及其氨基酸和肽衍生物的合 成和化学性质"(J. Org. Chem. 1980， 45，第2283-2287页)，讲述了荧光发光底物AFC (7-氨 基-4-三氟甲基-香豆素)的合成。 例如，用C-端共价结合了荧光团7-氨基-4-三氟甲基香豆素的二肽Arg-Arg制成 的底物适用于检测半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B的浓度。该底物的二肽Arg-Arg的N_端 有保护基团Z。该底物也可用下式Z-RR-AFC表示。而底物Z-RR-AFC底物的荧光发射波长 为约400nm，纯荧光团AFC的荧光发射波长为505nm。 此外，还可以使用荧光团7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)连接到二肽Arg-Arg上 的Z-RR-AMC，用于组织蛋白酶B的活力检测。然而，这个底物具有前面说过的缺点，即底物 Z-RR-AMC和未结合的荧光发光团AMC的荧光发射波长都是同一波长即约460nm。在这种情 况下，只有通过信号的强度才能区分未切割的底物和切下的荧光团，而不能通过发射波长 区分。在某些情况下，在预先去抑制之后，检测的灵敏度的足够的，尤其是如果样品中的酶 浓度较高(如组织样品)或样品体积较大。当采用AMC时，使用荧光计(激发辐射和发射 辐射间成90。)有额外的优势，因为与发射光方向上的检测(荧光分析仪)相比，它的灵敏 度更高。 在专利EP0776374中，公开了对液体样品中蛋白酶去抑制的方法和装置。将液体 样品流过一个装满了共价结合了抑制剂结合物质的琼脂糖凝胶柱。在连续亲和层析中，样 品酶-抑制剂复合物中的抑制剂传递给抑制剂结合物质，而含有不带抑制剂的酶的样品从柱上被洗脱，可转而用于活力检测。 由于琼脂糖胶(agarose gel)对蛋白的非特异性吸收要比琼脂糖凝胶(s印harose gel)少，所以将琼脂糖胶用于亲和层析分离抑制剂，在随后检测酶活力的测定灵敏度方面 有相当优势。 然而，用以共价或非共价(吸附)方式结合了抑制剂结合物质的刚性载体来代替
琼脂糖凝胶或琼脂糖胶则更有优势。由于刚性载体易于操作和应用，用箔或膜作为抑制剂
结合物质的载体具有决定性的优势。箔或者膜形式的刚性载体，可以通过将载体浸没到样
品中很容易的与样品相接触，而不需要如液流过柱等精心制作的装置和组合。 在去抑制之后，可以从样品中取出已经转移上抑制剂的结合有抑制剂结合物质的
刚性载体。 抑制剂结合物质可以通过共价或者吸附的方式结合到刚性载体上。在将刚性载体
与液体样品相接触的情况下，使用共价结合了抑制剂结合物质的载体尤其有优势，因为抑
制剂结合物质不会从刚性载体上释放出来进入到样品中并且误导测试结果。 载体可以是能够以共价或吸附方式足够强地结合抑制剂结合物质的任何材料，所
述抑制剂结合物质通常是肽或蛋白质。 在本发明的优选实施方式中，载体包括尼龙或硝酸纤维素或由上述材料制成。能 以共价或非共价方式结合复合物(尤其是肽或蛋白质)的合适的尼龙或硝酸纤维素箔或膜 在市场上有售。 需要根据待测的蛋白酶和样品中存在的一种或数种抑制剂来选择抑制剂结合物 质；这个选择并不是确定的。半胱氨酸蛋白酶家族具有下列特性它们的抑制剂对植物蛋 白酶木瓜蛋白酶要比对组织蛋白酶B的亲和力更高、结合强度更大，这也被我们的实验所 证实。 因此，从样品中去除抑制剂，可以用很简单的方法在临床实验室的微孔板中实现， 也可以不很费力地在医学实践中(从血清中)立刻实现。 因此，从样品中去除抑制剂，可以在临床实验室中很容易的实现，也可以在医学实
践中立刻不很费力的实现。尤其优选抑制剂结合物质共价结合到载体上。 将刚性载体与液体样品相接触，不存在抑制剂结合物质从固体载体上释放出来、
进入到样品中并且可能误导检测结果的危险。载体可以是能够适用于以共价或吸附方式足
够强地结合抑制剂结合物质的任何材料，所述抑制剂结合物质通常是寡肽或蛋白质。 抑制剂结合物质是根据待检测的蛋白酶和样品中存在的一种或多种抑制剂来进
行选择的，这个选择并不是确定的。半胱氨酸蛋白酶家族具有以下特性它们的抑制剂对植
物蛋白酶木瓜蛋白酶要比对组织蛋白酶B的亲和力更高、结合强度更大。 下面用具体的实施方式和比较实验进一步描述和阐明本发明。荧光团和荧光发光
团具有相同的含义。
实施例 用血液或血清中的溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B的实施方式或实验进一
步阐明本发明。
检测结果
a、检测组织蛋白酶B的催化活力
al、导言 组织蛋白酶B的活力检测基于二肽底物的切割
Z-Arg-Arg-荧光团一Z_Arg-Arg+荧光团
(Z =保护基团；Arg =碱性氨基酸精氨酸) 在荧光方法检测组织蛋白酶B活力的灵敏度检测中采用了 2种不同的荧光团，称 为AMC(Biomol)和AFC (Biovision)。 游离的AMC与底物在相同的波长发出荧光，但是荧光量子产率更高。因此催化切 割伴随着荧光的增高。 基于AFC的方法灵敏度更高。该灵敏度的提高是由于游离荧光团的荧光波长与底
物波长之间的差异。这样，底物的荧光可以从记录中被消除，并且获得更小的"背景荧光"。 —般而言，将下列差值的倍数定义为活力检测的灵敏度 Z X (检测读数_背景值) 检测读数必须是"显著地"不同于背景。 a2、活性检测 用荧光分析仪进行96孔微孔板的荧光检测(AMC检测激发光355nm，荧光450nm) (AFC检测激发光400nm，荧光508nm) 在AMC方法中，测试反应是室温下在微孔板中进行的，为了避免蛋白结合到塑料 上，该微孔板预先用白蛋白孵育进行脱敏。 在AFC方法中，对测试样品检测活力的测试是在37t:下进行的。在检测荧光前才 将测试样品转移到微孔板中。 a3、游离荧光发光团AMC和AFC的荧光与浓度线性相关。
结果AMC和AFC的荧光与所用测试的轮数/设备(r2 = 0. 9999)成线性
a4、对这两种底物而言，纯化的组织蛋白酶B的活力与酶的浓度线性相关。
结果纯化的组织蛋白酶B活力的检测读数与所用的酶的浓度成正比。
a5、检测活力与反应时间线性相关 结果在两轮测试中测试90分钟内从底物上释放的荧光团呈线性增加。
b、人血清中存在组织蛋白酶B的抑制剂 用纯化的组织蛋白酶B检测没有病理学表现的人血清中是否存在组织蛋白酶B的 抑制剂。 结果随着("正常")人血清浓度的上升，纯化的组织蛋白酶B的表观活力显著下 降(当有10%血清存在时，最大达到< 40%，参见图2a)。 由于血清的自吸收/光散射作用引起荧光淬灭，在有10%血清的情况下导致荧光 降低30-35%，这已经通过血清对游离AMC荧光的影响得到验证(参见图2b)。
然而，在没有血清的情况下，可以用AMC系统进行检测。
c、胱抑素A对组织蛋白酶B的抑制 在两个不同的组织蛋白酶B浓度下，体外测试已知抑制剂胱抑素A对组织蛋白酶 B的抑制作用。 结果胱抑素A的抑制作用对组织蛋白酶B浓度的依赖很小(图3)。
d、通过用固定化的木瓜蛋白酶处理解除胱抑素A对组织蛋白酶B抑制作用的研允。 固定化的木瓜蛋白酶(共价结合的交联的6%琼脂糖小球，装载有木瓜蛋白酶) 预处理一份悬浮液用5-10份测试缓冲液洗涤5次，用离心法分离上清。在最后一步洗涤步骤之后，用吸水纸小心地吸干沉淀物，然后用测试缓冲液重悬到原来悬浮液的体积。 注意原则上，必须区分最初所述的用木瓜蛋白酶处理纯化的组织蛋白酶B，以及
后来所述的在室温和较短时间进行的血清样品的处理。
dl、处理的实施 将各自体积的50%木瓜蛋白酶-琼脂糖悬浮液转入聚丙烯管内，用离心分离固体相，小心地用移液管和吸水纸去除上清液。向固化相中加入160 i！ 1酶溶液并进行孵育。
然后进行离心，取上清液转入测试中(可以转入预处理的微孔板或转入0.5ml管)。向上清液中加入一定体积的缓冲液-底物溶液，并且孵育120分钟，然后进行荧光测定。 d2、在木瓜蛋白酶存在下组织蛋白酶B稳定性与时间的关系。 在固定化的木瓜蛋白酶存在下研究组织蛋白酶B的稳定性，条件是4t:、120分钟(图4)。 结果实施组织蛋白酶B的处理时，固定化的木瓜蛋白酶的量要尽可能少，而且时间要尽可能短。 d3、通过用固定化的木瓜蛋白酶处理，解除胱抑素A对组织蛋白酶B的抑制作用 在两个独立实验中(每轮测试中采用5和10ng组织蛋白酶B，复孔进行测试)，通
过提高固定化的木瓜蛋白酶的浓度，研究特异抑制剂胱抑素A对组织蛋白酶B的抑制作用
的解除，胱抑素A浓度为700nM。在这个抑制剂浓度下，抑制作用> 95%。 在两个实验中，加入100iU沉淀的凝胶/测试(对应于200iU悬浮液，如图中所
示)，就可以实现抑制作用的完全解除(图5)。 结论用合适量固定化的木瓜蛋白酶处理，可以解除特异性抑制剂胱抑素A对组织蛋白酶B的抑制作用。 e、血清组分对组织蛋白酶B的抑制作用、以及用固定化的木瓜蛋白酶处理解除该抑制作用 el、在存在或不存在正常人血清的情况下，组织蛋白酶B浓度与荧光的相互关系
在不存在血清的情况下，来自外源性组织蛋白酶B的测试信号的线性增高与加入的组织蛋白酶B的量有关(图6)。而在血清存在(占测试体积的比例为50%或25% )的情况下，也可以观测到线性相关性，但是增高量只是不存在血清的条件下增高量的约25%。
因此，在低浓度的组织蛋白酶B条件下，能够观测到血清引起的酶活力的显著抑制。 e2、用固定化的木瓜蛋白酶处理，解除对血清中组织蛋白酶B活力的抑制作用
在没有预处理的条件下，用AFC测试系统测得血清中的"自发性"蛋白酶活力为0. 12±0.02纳摩尔/分钟/毫升。在用固定化的木瓜蛋白酶孵育15分钟后，活力提高系数为1. 9±0. 4，中间值达到0. 23±0. 03。如果测试中组织蛋白酶活力小，约为0. 5纳摩尔/分钟/毫升(即几乎被完全抑制)。然而，在用木瓜蛋白酶处理后，能完全测到标称活力0. 52纳摩尔/分钟/毫升。 血清含有能抑制内源性的组织蛋白酶B等蛋白酶以及加入的外源性组织蛋白酶B的组分。通过用木瓜蛋白酶处理，可以从血清中去除这些抑制组分。 e3、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64或组织蛋白酶B抑制剂对自发性或恢复活力的蛋白酶活力的作用 使用半胱氨酸蛋白酶的非特异性抑制剂E64或组织蛋白酶B抑制剂CA-074，测定组织蛋白酶B的活力来说明这些蛋白酶的性质。 在使用和不使用固定化的木瓜蛋白酶进行预处理的两份"正常"人血清中检测低浓度的组织蛋白酶B的酶活力(图7)。 如其他相似实验中可见，预处理15分钟，导致组织蛋白酶B活力降低约15% 。组
织蛋白酶B的活力被这两种抑制剂完全抑制(进行或不进行预处理)。(为了能够客观地
评价检测的灵敏度，在图示中并没有从测试读数中减去背景荧光的检测值)。 不经预处理，在两种血清中都检测到了少量蛋白水解活力。这些活力即不被E64
也不被CA-074所抑制。因此，它们不能被归为组织蛋白酶B，并且可能也不能归为其他半胱
氨酸蛋白酶。 用固定化的木瓜蛋白酶预处理，使得两种血清中的蛋白酶活力增高。E64和CA074
都能将这种活力降低到未被预处理的样品的检测值。
结论 不经过固定化的木瓜蛋白酶预处理(即不经过去抑制)，在两种血清中都检测不到组织蛋白酶B的活力。 e4、固定化木瓜蛋白酶对血清中组织蛋白酶B活力作用的时间依赖关系 为了简化用固定化木瓜蛋白酶预处理的程序，在室温下研究对血清中组织蛋白酶
活化作用的时间依赖关系。检测到的活力随时间的变化如图8所示(背景值已减去)。在
t = 0分钟的值代表没有经过预处理的测定值。在t = 5分钟的值代表最短时间的值，这段
时间内的孵育(即将样品加入到固定化的木瓜蛋白酶中)、离心和取样等流程按照常规操
作进行。在这个时间测得的活力是最理想的。 结论血清中组织蛋白酶B的活化是相当快的过程。


MLl 用AMC方法进行荧光分析活力测试荧光随时间的增高；在测试中使用的组织蛋白酶B(从牛脾中纯化，10单位/毫升)按照 1/5000稀释。图表对应于两个酶活力有微小差异的独立测试系列。
Ml (a)用AMC测试系统检测组织蛋白酶B活力，以及(b)在血清存在下用AMC荧光进行检测。 用由AMC底物和血清造成的背景荧光值校正测定值。测试中牛组织蛋白酶B的稀释系数为1/5000。
Ml 随着胱抑素A的浓度增高，对组织蛋白酶B活力的抑制作用。
用AMC方法进行检测。测试中组织蛋白酶B的稀释系数为1/2500。
图4 用固定化的木瓜蛋白酶处理，对组织蛋白酶B去活化作用的时间依赖关系。
用AMC方法进行检测。测试中组织蛋白酶B的稀释系数为1/2500。
Ml 通过提高固定化的木瓜蛋白酶的量，解除由胱抑素A造成的对组织蛋白酶B的抑制作用。 测试采用AFC方法进行。
在存在或不存在(实心圆)两种不同浓度的人血清的情况下，检测加入的外源性
组织蛋白酶B的活力。 测试采用AFC方法进行。 Ml 在进行或不进行固定化木瓜蛋白酶处理的情况下，抑制剂E64和CA074对纯化的组织蛋白酶B活力或血清中蛋白酶活力的作用。
测试采用AFC方法进行。
用固定化的木瓜蛋白酶处理，人血清中蛋白酶活力随时间的变化。
测试采用AFC方法进行。检测值取两个检测系列的平均值。 在医学常规检查(医疗实践或临床)中采用本发明的方法进行蛋白酶活力的检测，下面是一些优选实施方式。 根据专利W0 97/00969，本领域已知在检测一些在样品中主要被抑制的酶的活力时，需要采用这样的方式首先将样品通过一个柱，从样品中去除抑制酶的抑制剂。然后将不含抑制剂的酶加入测试容器，在加入合适的底物后检测酶的活力，例如通过检测该底物的至少一种切割产物浓度随时间的增高。 如果采用AFC作为荧光团，这样的装置在实践中尤其具有优势，因为切下的荧光团的发射光谱转移到长波区段，这样就可以在其他的发光都不会再影响检测结果的波长区段下检测切下的荧光团的荧光。通用装置和下述的这种装置混合使用在实践中具有优势。
此外，通过使用两次活力检测的旁路，即检测过柱之后的样品的活力以及检测样品通过旁路之后的样品的活力，除了测定样品中酶的总活力以外，还可以测定抑制剂的浓度。 图9显示了本发明的一个基本实施方式。 在亲和交换层析柱1周围装上一个带有至少一个珀耳帖元件(Peltierelement)的恒温器2。柱1基本上由填满了多孔性物质、结合有抑制剂结合物质的载体的圆柱组成。交换型注射器4的尖端8伸入到柱1的上方开口 3中，在柱1的下端优选加上锁紧阀6，注射器4在体积5中包含带有酶-抑制剂复合物的样品。 当注射器4压紧时，体积5事实上变为O，其内容物被注入到装有(优选为紧紧填满)载体的柱l中。 通过第二注射器7将为样品体积的约100-103倍体积的洗脱缓冲液完全或部分地 注入到柱1中。 第一流程如下所述在一个明确的温度(例如，约4t:)下将样品与一部分洗脱缓 冲液在柱l中一起孵育一段时间，实践中为约10-18分钟。尤其以15分钟最为理想。然后 用注射器7进一步加入洗脱缓冲液，游离的酶被洗脱，并且如图9所示，当锁紧阀6打开时， 洗脱下来的溶液向下流入到模块B中。 在第一流程中，阀门6最初是开启的，直到柱缓冲液部分进入到柱1中或直到样品 沿柱长分布。到这个时候，可以释放一个在检测中不被考虑在内的体积(如图io所示，经 由排放管28)。在孵育一段时间后，打开阀门6进行洗脱，然后再关闭，这样残余体积不会破 坏检测值。也可以通过排放管28排出残余体积。 在可选的第二流程中，样品和加入的柱缓冲液一起向下流过柱子，其速率能够确 保样品中所有酶_抑制剂复合体中的抑制剂都转移到柱上的固定化物质上，该固定化物质 与抑制剂的结合要比酶与抑制剂的结合更强。这是一个类似迁移的孵育过程。这样，游离 的酶被洗脱，并且如图9所示洗脱下来的溶液向下流入到模块B中。 在这个流程中，一开始也释放了一个体积(如图10所示，经由排放管28);这在类 似最佳检测体积通过后也同样发生。 因此，图9的模块A是一个用于去除抑制剂的装置，位于检测箱模块B上方，如图 9所示，柱1中的释放体积是通过一个穿透盖板11进入荧光测试管10的导管或管子释放 进入模块B的。(为了吸收穿过检测样品的激光，将盖板涂成黑色)。和酶活力测试中一 样，游离的酶作为蛋白水解酶，从加入到检测管10中的底物上切下一个在游离形式能够发 荧光的片段。根据荧光强度随着时间而升高，可以在明确的温度条件(通过珀耳帖元件19 来调节)下测定游离化的酶的酶活力。在下方的检测箱(模块B)中有一个激发该荧光的 激光二极管13。激光二极管用于发射波长对应于发荧光的底物片段最大激发的光。光电二 极管17在与激光电子束方向成直角的位置检测发射荧光14。边缘滤光片15和干涉滤光片 16过滤了激发光中的几乎所有散射光，并且确保只有荧光能够到达光电二极管17。
模块A中的亲和层析柱1的温度控制调节到3-2(TC，优选为4-5°C，由于伴随着抑 制剂结合到柱中的亲和层析材料上，蛋白水解酶被解放出来并且能够消化自己，即在较高 的温度下一个蛋白水解酶分子攻击另一个酶分子。 在37t:的调控温度下(为了人类医学目的)，实施模块B中酶活力的检测。(为了
这个目的，可以使用一个附加装置通过珀耳帖元件(恒温器19)来控制温度)。 在最基本的情况下，测试管10也是一次性产品的形式。(开始时测试管中装满了
测试缓冲液和酶活力测试的成分)。然而，可以直接将该混合物加入到测试管10中，或由于
环境情况通过附加的阀和泵经过通道9加入，如有需要，还可以加入合适的检测缓冲液。在
洗脱完成后，加入底物开始酶反应。这可以是，例如，如图IO所示，经由阀门26从底物容器
18中加入，或者如图9所示经由一个穿过盖板11的注射器(未显示)加入。 组件1、5、4、10可以是便宜的一次性产品形式。可替换的组件的优点在于，一个患
者的样品部分不会与另一个患者的样品相接触。必须考虑到，当一个患者的体液作为样品
加到柱1上，并且在洗脱过程中酶抑制剂主要留存在柱中，然而，并不清楚是否其他组分也留存在柱中。在任何情况下，荧光测试管10中的样品不仅包含游离酶还包含原始体液中的 大多数其他组分。这个理念的另一个优点在于，如阀/泵等复杂的机械组件不是必需的。
用检测缓冲液稀释洗出液可能有利于获得好的检测结果，可能是必需的。直接位 于检测管上的激光二极管和/或光电二极管的组合会导致高的检测限。在图9的最基本情 况下，可以实施下列流程用底物(加入过量)的检测缓冲溶液对模块A的柱1进行洗脱， 这样，每个酶分子都能结合一个底物分子(底物饱和)。 图10显示了一个功能上比图9更为先进、并且可以半自动化的装置，但在两种方 法中柱1都如图9所示操作。因此，柱1的上端和下端带有多向阀门22，26。它们的组件也 可以和图9的装置混合使用。 图10也有一个带有温度调控部件6(如珀耳帖元件)的亲和层析柱l，优选温度调 节为4°C 。柱中紧紧填满了结合特定物质的材料，该物质对抑制剂的亲和力要高于待测样品 中酶_抑制剂复合物，例如结合在填充材料琼脂糖凝胶上的物质为木瓜蛋白酶，并且样品 包含如组织蛋白酶B的酶-抑制剂复合物。通过管23经阀门22(用旋转箭头表示)从容 器中输入样品，从注入口 24将柱缓冲液注入到柱1中，其中需要调节阀门22。
管23可以是一次性的或/和可以作为用于进一步检测的容器的注入口 。通道24 可以是塑料制成的一次性的第二注射器，其容积通常是样品体积的数倍，或者它能作为柱 缓冲液储槽或者是能通向这样一个储槽，在柱1注入口的阀门22的相应位置，开放柱缓冲 液的摄取流动。 将泵25安装在阀门22的下游，如有需要，能够产生过柱的最佳流速所需的任何压 力(包括P = 0)。阀门22的位置也可以调整为，样品和/或柱缓冲液通过旁路27到达经 过柱1的流程的下出口或到达阀门26。为了下列附加的目的，可以在柱1的出口提供一个 附加的阀26(也用旋转箭头表示)当样品流过柱1时，体积的第一部分通过出口 28被排 掉。然后转动旋转阀使液流通过方向30进入到检测箱B中，因为后面的体积更适用于准确 的检测。然后可以再次通过出口 28将剩余的洗脱下的液体弃去。 为了能够确认弃去的体积的量，在通过柱1后测定样品的稀释程度。可能需要有 简单的装置来进行测定经由通道28弃去的体积，并且根据这个值与通过24加入的洗脱缓 冲液的体积的差值，能够确定含有游离酶的洗脱下的样品的体积。 在通过通道30进入到容器10 (例如立方体形或长方体形)中后，酶已经从抑制剂 上游离出来的样品流入到容器10中，该容器10中预先充满检测缓冲液和酶活力测试的成 分。从储槽18中加入最佳量的底物，以启动酶反应。 容器10也可以是满足简单需求的一次性产品，其中立方体10是由如塑料等制成 的。 它也可以是荧光测试管，其中，在模块B中有一个波长为A = 400nm的激光二极 管33。 从33发出的激光光束与降落方向成直角，即与经由通道29或30的液流方向成 90° 。荧光偏振光束34与其垂直(从观察者的角度来看，向右成90。)，该偏振光束是由切 割产物发出的，并且落到了边缘滤光片15和与15平行排布的干涉滤光片16上，然后落到 也与15平行排布的光电二极管17上，能够在17的输出端检测荧光辐射的强度(如图1)。 因此光束34、35位于一个优选与降落方向垂直的平面上。
在荧光测试管10下，磁力搅拌器44环绕着轴45进行旋转，使得混合物能够尽可 能的均匀。样品颗粒与底物接触后立刻发射出荧光，其强度与切割产物的浓度成正比，并且 可以成比例地检测酶的活力。 图13中的发射荧光强度测定曲线在起始阶段之后变为直线，并且图表一变为直 线就测定其斜率，以获得所需要的结果dl/dt。图13是所有其他图示的代表。
在最基础的情况下，模块A是一次性的层析柱，在它的上端插入了一个含有样品 的一次性第一注射器，然后插入一个含有柱缓冲液的第二注射器，它的出口 9可以直接通 过阀门6与检测箱10相连，它也可以是预制的便宜的一次性产品(如前所述)。模块B，尤 其是检测箱IO，是温度受控的，并且在检测箱10附近和周围提供了另一珀耳帖元件16 (出 于人类医学目的，它必须能够调节到37°C )。因此，可选的，底物储槽18配备有一个通向检 测箱10的直接通道。然而，优选地，输送是从底物储槽经过通道9或29或30间接进入检 测箱10。 在最基础的情况下，模块B是便宜的一次性产品，装满了检测缓冲液和其他成分， 例如非离子表面活性剂加二硫苏糖醇或半胱氨酸。 如果样品是通过流动的方法从柱上被洗脱，那么阀是不可缺少的，因为在这个情 况下洗脱液的第一部分是被弃去的。如果样品在柱上孵育一段时间，那么阀门也是不可缺 少的，为此，在将样品装到柱上之后必须向柱内注入一定量的柱缓冲液，并且通过柱的出口 释放出等量的部分；由此，样品渗入柱中，并且样品中的酶_抑制剂复合物与固定化在柱上 的物质相接触，该物质能够与抑制剂更牢固地结合。 而在如图9的装置中，激光光束和发射荧光和检测荧光灯与模块A相平行或位于 模块A的绘图平面或剖面上，在图10中这些光束34、35与模块A的剖面相垂直，即通常与 部件1的降落方向或流经方向相垂直。 因此，在检测管10或模块B的下方，有一个将测试管10的内容物混匀的混合器， 优选设置为容易操作的例如磁力搅拌器44、45。 在这些附图的说明中，采用相同的数字表示功能相同的组件或相同组件。此外，模 块A用平面剖面视图表示，而模块B用三维显示。 图11是本发明的另一个独立变体，其中省略了模块A，并且检测功能完全转移到 了模块B。检测管为类似的带有涂黑(如前所述)的盖板111的检测容器100的形式，其中 盖板lll上优选带有能够(尤其是可自动化地)注入必需物质的开口。在这样的情况下， 亲和层析吸附剂(例如木瓜蛋白酶+载体)作为凝胶和酶活力测定的其他成分一起加入到 检测容器中，检测容器可以设计成如荧光测试管。在一定温度(如5t:)加入生物样品，5t: 是孵育的最理想温度，通过珀耳帖元件将温度保持恒定，样品孵育一段最佳时间，这样不含 抑制剂的酶释放进入荧光测试管中。然后，将混合物转入酶活力测试所需的温度(出于人 类医学目的为37t:)，在达到温度时注入荧光发光底物，可以检测荧光强度和游离蛋白水 解酶的酶活力(参见图13)。 如图11操作的方法是设计成这样的首先在某一位置(在模块B的检测容器中) 在低温下进行孵育，然后提高温度(例如到37°C )，然后加入底物。 图12代表本发明的另一个独立变体，其中省略了模块A，并且检测功能完全转移 到了放置样品的模块B。如图11所示，检测管设计成类似于检测容器100。在这样的情况下，将刚性元件71上的亲和层析吸附剂(如木瓜蛋白酶+压紧的载体)沿着箭头72/70的方 向浸没到检测容器中的样品里，检测容器也设计成荧光测试管。在孵育一段最佳时间(去 抑制)后，沿箭头73的方向移出刚性元件。然后，将样品转入酶活力测试所需的温度(出 于人类医学目的为37°C )，在达到温度时加入、注入荧光发光底物，可以检测荧光强度和游 离蛋白水解酶的酶活力(参见图13)。 如图12操作的方法是设计成这样的首先在某一位置(在模块B的检测容器100 中)在低温下进行孵育，然后提高温度(例如到37°C )，然后加入底物。
权利要求
一种检测液体样品中至少一种蛋白酶活力的方法，所述样品中除了需要检测活力的至少一种蛋白酶之外，如有必要，还含有所述蛋白酶相对应的至少一种蛋白酶抑制剂，该方法包括下列步骤通过将样品与以共价或者吸附方式结合了抑制剂结合物质的载体相接触，去除样品中蛋白酶上的蛋白酶抑制剂，所述抑制剂结合物质对蛋白酶抑制剂的亲和/结合强度要高于蛋白酶本身；从样品中将载体以及载体上结合的蛋白酶抑制剂一起分离出来；将需要测定活力的至少一种蛋白酶的底物加入到样品中，并且记录蛋白酶与底物的蛋白质水解反应。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述至少一种蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶 家族，优选选自组织蛋白酶B、H、K、L和/或S其中之一，其中蛋白酶优选为组织蛋白酶B。
3. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述液体样品为血液样品、血浆或血 清，优选为血清。
4. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述至少一种蛋白酶的底物包括c-末端结合了荧光发光团的二肽或寡肽序列，其中荧光发光团在蛋白水解反应中被切下。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述包含二肽或寡肽序列以及荧光发光团 的底物，其荧光发射波长最大值与蛋白水解反应中被蛋白酶切下的荧光发光团的荧光发射 波长最大值相差至少20nm，优选至少40nm或至少60nm或至少80nm，更优选至少100nm。
6. 如权利要求4和/或5之一所述的方法，其特征在于，所述荧光发光团为7-氨 基-4-甲基香豆素(AMC)或7-氨基-4-三氟甲基香豆素(AFC)。
7. 如权利要求4-6之一所述的方法，其特征在于，所述二肽或寡肽序列的N-端带有保 护基团。
8. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，记录蛋白酶对底物进行蛋白水解反 应的产物(即被切下的荧光发光团)的浓度随时间的变化，优选采用荧光测定方法。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，在37t:的线性范围内检测浓度的变化。
10. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，向样品的一个等分试样中加入蛋白 酶的底物，并且在没有预先去抑制的情况下检测酶活力；而对样品的另一等分试样进行酶 活力检测前，先将其与结合有抑制剂结合物质的载体相接触，从而可以通过两个测定值的 差异得出被抑制的酶的活力。
11. 一种用于实施如上述权利要求之一所述方法、具体是如权利要求1所述方法，检测 液体样品中酶活力的装置，所述液体样品中含有至少一种酶以及所述酶相对应的至少一种 酶抑制剂，其中，提供了用于去除抑制剂的装置(例如层析柱(l))，其包含载体以及结合在 载体上的能够与所述至少一种酶抑制剂相结合的物质；第一模块A中优选的温度控制器安装在第二模块B上方的中央； 提供了样品储槽和柱缓冲液储槽； 模块B包括设计成检测管(10)的测量容器；检测装置带有围绕着所述检测管的光源，以及用于记录至少一种底物切割产物的浓度 随时间上升的检测部件；所述测量容器接受样品、如果有需要与其混合的缓冲液和/或底物，而且可以是温度受控的；用于向从所述装置上洗脱下来进入检测管(10)的液体样品中加入底物和/或检测缓 冲液的底物储槽和/或检测缓冲液储槽；所述检测管(10)，优选设计为立方体，具有至少2个相互具体成直角的光透壁面，辐射 源(13、33)和用于检测辐射(如激发辐射14、34)强度的检测部件(15、 16、 17)位于与其垂 直的位置；优选立方体的一个面是不透明的。
12. —种检测含有至少一种酶和至少一种该酶相对应的酶抑制剂的样品中酶活力的方 法，具体是如权利要求1所述的方法，其中，该方法包括下列阶段在优选为中空圆柱形内空间并含有样品的检测容器(100)中，浸入结合有能与所述至 少一种酶抑制剂结合的物质的刚性载体，在去抑制完成后移除载体；测量杯形式的检测容器是温度受控的(优选在两个阶段中)； 然后加入底物和测试缓冲液；检测容器(100)设置在辐射测量装置内，优选当加入底物时启动该装置； 优选为立方体形状的检测容器(100)具有两个透明的壁面(113、114)，辐射源(13、33)和检测发光(例如激发辐射14、34)的光吸收的检测部件(15、16、17)安装在与这些壁面垂直的位置。
13. 如权利要求ll所述的装置，其中，所述样品储槽为第一注射器(4)形式，所述柱缓冲液储槽为显著更大的第二注 射器(7)形式，所述底物储槽为另一注射器。
14. 如权利要求11-13之一所述的装置，其中，在检测管(10)或检测容器(100)的底部中心提供磁力搅拌器，并且在水平面上 发生了线偏振光束(14、34)。
15. 如权利要求ll所述的装置，其中，在柱(1)的上方，样品储槽和柱缓冲液储槽都带有输送通道(23、24)，具体是经 由第一阀装置(22)，以便能将它们的体积输送到柱(1)中；其中，具体是经由模块A下游的 第二阀装置(26)，将洗脱下来的溶液释放到模块B中(通道29、30)，优选在第二阀装置处 有附加的通道(27 、28 、18)。
16. 如权利要求11或13所述的装置，其特征在于，所述检测缓冲液储槽为另一注射器 形式。
17. 如权利要求11、12或15之一所述的装置，其特征在于，存在从柱(1)上方的第一阀 装置(22)通向所述第二阀装置(26)的旁路(27)。
18. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述载体为刚性的或胶状的。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述刚性载体包括尼龙或硝酸纤维素，或 由这些材料制成；并且优选为箔或膜的形式。
20. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述抑制剂结合物质为木瓜蛋白酶。
21. 如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，在胶状载体的情况下，样品与载体 相接触直到从样品分离载体的时间最多为5分钟，优选最多2分钟；温度为15-4(TC之间， 优选为20-35t:之间，更优选为20-3(TC之间。
22. 如上述权利要求之一，尤其是权利要求21所述的方法，其特征在于，在刚性载体 的情况下，时间值要比权利要求21中所指定的更长，具体的说，在刚性载体的情况下，样 品与载体相接触直到从样品分离载体的时间为约10分钟，优选为约4分钟；温度范围为 15-4(TC之间，优选为20-35t:之间，更优选为20-3(TC之间。
23. 用于实施如上述权利要求之一所述方法的试剂盒，至少包含下列组件a. AFC-底物(为纯物质或溶解在检测缓冲液中)b. 固体形式的AFC作为校正标准品c. (共价或吸附)结合了木瓜蛋白酶的载体d. 特异性、合成的抑制剂(半胱氨酸蛋白酶的特异性抑制剂E64;或组织蛋白酶B的 抑制剂CA-074)
24. 如权利要求21所述的方法，其特征在于，在4t:，时间跨度为10-18分钟，具体是15 分钟。
25. 用于实施如上述权利要求之一所述方法，尤其是如权利要求12所述方法的装置， 其特征在于，所述结合了抑制剂结合物质的刚性载体连接于刚性适配器(71)，该刚性适配 器可以平行于所述检测容器(100)的纵轴向两个相反的方向(72、73)移动，并且优选通过 能平行于所述方向(72,73)移动的刚性适配器(81)将所述底物加入到检测容器(100)中， 其中所述适配器具有底物计量和输送系统。
26. 如权利要求25所述的装置，其特征在于，所述刚性适配器(71)和/或所述刚性载 体(81)是荧光计或荧光分析仪的组件，优选浸入微孔板的孔或荧光计的测量元件中。
27. 如权利要求25或26所述的装置，其特征在于，所述检测容器是微孔板的孔。
28. 如权利要求25-27所述的装置，其特征在于，所述刚性适配器(81)具有对应于微孔 板的矩形平面组件。
29. 如权利要求28所述的装置，其特征在于，所述刚性适配器(71)具有相应的平面组件。
全文摘要
本发明公开了一种通过预先去除抑制后检测酶活力来确定蛋白酶的总量的方法和仪器。在生物样品中，溶酶体蛋白酶是完全(例如在血清中)或部分(例如在组织匀浆液中)被抑制的。去抑制的方法需要将以共价或吸附方式连接了抑制剂结合物质的如塑料带等固体支持材料(如尼龙或硝酸纤维素)浸入到检测样品中，其中抑制剂结合物质与蛋白酶相应的抑制剂的结合要比蛋白酶更强。在发生去抑制之后，从检测的液体样品中移除塑料带，然后将检测样品转入酶活力的检测。可以从其上切下荧光发光团7-氨基-4-三氟甲基香豆素的荧光发光底物被证明在活力检测中具有相当优势。用这些底物结合荧光分析仪在微孔板中进行血清检测，能够获得比传统AMC底物高至少10倍的灵敏度，并且这种广泛用于临床实验室的检测装置能够有效地对血清中这些酶的活力进行荧光测定。
文档编号C12M1/36GK101730746SQ200880023430
公开日2010年6月9日 申请日期2008年7月7日 优先权日2007年7月6日
发明者H·J·迈耶, H·W·霍弗 申请人:帕普斯特许可有限两合公司