蛋白酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蛋白酶。所述蛋白酶的核心蛋白序列为SEQIDN0:1所示；其底物的特异性序列为ELXGXR(其中X为任意一种必需氨基酸），切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间；酶切反应的最适温度在35-4CTC之间，65°C时，仍有活性。本发明中涉及的蛋白酶酶切序列特异性高，耐热性较好。
【专利说明】蛋白酶
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新发现的耐辐射奇球菌蛋白酶，尤其涉及该蛋白酶的酶切底物、 底物酶切特异性序列、活性反应体系、最适温度与耐温性。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，可以催化蛋白质中肽键的水解。蛋白 酶广泛存在于动物、植物和微生物中。到目前为止，国际市场上商品蛋白酶100种以上。由 于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要来自微生物，利用枯草杆菌、酵母、霉菌、大 肠杆菌等微生物提取制备。随着蛋白酶研究的深入，它的工业应用越来越引起了人们的广 泛关注。
[0003] 蛋白酶已广泛应用在毛皮、皮革、丝绸、医药、食品、酿造、石油钻井等领域。利用蛋 白酶，皮革工业的脱毛软化，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、 肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，例如用于消化不良、支气管炎、脉管炎等症状的治 疗。加入蛋白酶的洗衣粉能高效去除衣物上的血渍和蛋白污物。另外，蛋白酶广泛应用于 生化分子实验，作为蛋白质的手术刀，是生命科学研究不可或缺的。
[0004] 耐辐射奇球菌是一种极端环境微生物，以对电离辐射、紫外射线、干燥和氧化压力 等极端条件表现极强抗性而著称。它的这种超强抗性有一部分归功于其体内基因(基 因名i/r_P767，NCBI-GeneID : 1798483)。它是在基因损伤修复中起整体调控作用。ftor/基 因表达的产物PprI蛋白（NCBI-GI: 15805204)由328个氨基酸组成，预测含3个功能结构 域，分别是锌指-蛋白酶结构域，螺旋-转角-螺旋结构域，GAF结构域。但是至今为止， PprI的蛋白酶活性和酶底物从未被发现。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种蛋白酶及其酶切特异性底 物。
[0006] -种蛋白酶，具有锌指-蛋白酶结构域、螺旋-转角-螺旋结构域和GAF结构域， 所述的蛋白酶全酶和单独的锌指-蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性。
[0007] 所述蛋白酶的核心蛋白序列为SEQ ID NO : 1所示。
[0008] 所述蛋白酶的底物为耐福射奇球菌ifeiflococciAs rat/ioi/tfra/75·，ATCC No. 13939的 DdrO(Gene ID: 1798752; NP_296294.I)〇
[0009] 所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是ELXGXR(其中X为任意一种必需氨基酸），切 割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。
[0010] 所述蛋白酶的反应缓冲液为 100-200 mM NaCl、10-50 mM Tris-HCl 8. 0、ImM DTT、 2. 0-5. OmM MnCl2O
[0011] 所述蛋白酶的酶活性温度范围为4-65°C。
[0012] 所述蛋白酶的最适酶活性温度范围为35-40°C。
[0013] 所述的蛋白酶来源于耐辐射奇球菌。
[0014] 本发明有益效果： 本发明蛋白酶的酶切序列特异性较高，耐热性较好，为基础研究和基因工程等工业应 用提供了良好的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是PprI蛋白酶体外酶切电泳图； 其中，1 :纯化后的DdrO蛋白；2:纯化后的PprI蛋白；3 :DdrO与PprI酶切反应；4: Fermentas 预染蛋白 Marker SM0671 (单位：kD)。
[0016] 图2是PprI蛋白酶体外酶切Western blotting检测；其中，1 :纯化后DdrO蛋白 经 Western blotting 检测；2 :DdrO 与 PprI 酶切反应后，经 Western blotting 检测。两条 带分别为DdrO蛋白和酶切后DdrO蛋白大片段。
[0017] 图3是PprI蛋白酶的底物DdrO酶切后大片段的C端测序； 其中，峰A :DdrO酶切后，其小片段的分子量；峰B :DdrO酶切后，其大片段的分子量； 峰C=DdrO蛋白的分子量。
[0018] 图4是PprI蛋白酶的底物特异性酶切序列； 其中，从左至右，从上至下，分别是PprI蛋白与DdrO不同点突变蛋白的酶切反应。 S104A，表示DdrO的第104位残基S突变成A，其它依次类推；WT，表示野生型的DdrO蛋白。
[0019] 图5是PprI蛋白酶的酶切模型。红体标注的氨基酸残基是PprI蛋白酶的酶切识 别序列，其中X表示可变的氨基酸残基，可以是任意一种必需氨基酸。箭头所标位置是其酶 切位点。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
[0021] 耐福射奇球菌蛋白酶PprI,具有锌指-蛋白酶结构域、螺旋-转角-螺旋结构域 和GAF结构域，所述的蛋白酶PprI全酶和单独锌指-蛋白酶结构域均具有蛋白酶活性。
[0022] 所述蛋白酶的底物为耐福射奇球菌ifeiflococciAs rat/ioi/tfra/75·，ATCC No. 13939的 Ddr0(Gene ID: 1798752; ΝΡ_296294· 1)。（图 1，图 2,图 3,图 4) 所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是ELXGXR(其中X为任意一种必需氨基酸），切割位 置在第二和第三个氨基酸残基之间。（图5) 所述蛋白酶的反应缓冲液为 100_200mM NaCl、10-50mM Tris-HCl 8. 0、ImM DTT、 2. 〇-5. OmM MnCl2O
[0023] 所述蛋白酶的酶活性温度范围为4_65°C。
[0024] 所述蛋白酶的最适酶活性最适温度范围为35_4(TC。
[0025] 本发明所用的菌株为耐福射奇球菌ATCC No. 13939)，大肠杆菌表达菌株 BL21 (DE3) Chemically Competent Cell (基因型：F_ As*t/SB(rB-mB-)辟7 dcm(DE3))，大肠杆菌克隆菌株 Trans5 a Chemically Competent Cell (基因型：F- Φ 80 7况 Z Δ M15 Δ (7况ZYA-^rg F) U169 recAl As*t/R17 (rk_，mk+) sup^AW - thi gyrbSib reiki phoK)。
[0026] (I) PprI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性 将纯化的PprI蛋白与其底物蛋白DdrO在反应缓冲液（150mM NaCl、20mM Tris-HCl 8. 0, ImM DTT、2. OmM MnCl2)中反应40分钟。经SDS-PAGE电泳和质谱分子量大小检测，PprI 蛋白可以把DdrO酶切成两段。通过DdrO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PprI蛋 白酶切底物的特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELRGER、ELAGKR、ELAGAR和ELAGER。另外，经 蛋白质的C端质谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。如图1，图2， 图3,图4,图5所示。
[0027] (2) PprI蛋白酶的酶活最适温度范围和耐温性 PprI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在35-40°C之间。在此温度范围内蛋白 酶活性最高。当温度在50-55°C之间时，蛋白酶活性仍然存在，约降低了三分之一。在65°C 时，仍具有较弱活性。所以PprI蛋白酶活温度范围较广，是一种耐温蛋白酶。
[0028] 实施例2 (I) PprI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性 将纯化的PprI蛋白与其底物蛋白DdrO在反应缓冲液（IOOmM NaCl、30mM Tris-HCl 8. 0、ImM DTT、3. OmM MnCl2)中反应40分钟。经SDS-PAGE电泳和质谱分子量大小检测，PprI 蛋白可以把DdrO酶切成两段。通过DdrO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PprI蛋 白酶切底物的特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELAGKR和ELAGAR。另外，经蛋白质的C端质 谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。
[0029] (2) PprI的蛋白酶酶活的最适温度范围和耐温性 PprI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在35-40°C之间。在此温度范围内蛋白酶 活性最高。在4°C时，也表现出较弱的蛋白酶活性。在65°C时，仍具有较弱活性。所以PprI 蛋白酶活温度范围较广，是一种耐温蛋白酶。
[0030] 实施例3 (I) PprI的蛋白酶活性和底物酶切序列特异性 将纯化的PprI蛋白与其底物蛋白DdrO在反应缓冲液（200mM NaCl、20mM Tris-HCl 8. 0、ImM DTT、5. OmM MnCl2)中反应40分钟。经SDS-PAGE电泳和质谱分子量大小检测，PprI 蛋白可以把DdrO酶切成两段。通过DdrO酶切位点附近氨基酸残基的点突变，获得PprI蛋 白酶切底物的特异性序列为ELRGKR、ELRGAR、ELRGER、ELAGKR、ELAGAR和ELAGER。另外，经 蛋白质的C端质谱测序，可以获得切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。
[0031] (2) PprI的蛋白酶的酶活最适温度范围和耐温性 PprI蛋白酶与底物发生酶切反应的最适温度在35-40°C之间。在此温度范围内蛋白酶 活性最高。在4°C时，也表现较弱的蛋白酶活性。当温度在50-55°C之间时，蛋白酶活性仍 然存在，约降低了三分之一。
[0032] 本发明实施例中所用的菌株为耐福射奇球菌(ifeiflococciAs rat/ioi/tfra/75·，ATCC No. 13939)，但是根据本发明的教导和启示，任何人工合成或者其他自然含有的蛋白酶以及 衍生物，如具有与耐辐射奇球菌蛋白酶PprI同源的序列和类似的结构和功能，也在本发明 的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种蛋白酶，其特征在于：它具有锌指-蛋白酶结构域、螺旋-转角-螺旋结构域 和GAF结构域，所述的蛋白酶全酶和其独立结构锌指-蛋白酶结构域具有同等的蛋白酶活 性。
2. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述锌指-蛋白酶结构域的核心蛋白 序列如SEQ ID NO : 1所示。
3. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的底物之一为耐辐射奇 球菌ifeiflococcWs rat/ioi/tfra/75·，ATCC No. 13939 的转录因子 DdrO (Gene ID: 1798752; NP_296294. 1)。
4. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的底物酶切特异性序列是 ELXGXR，其中X为任意一种必需氨基酸，切割位置在第二和第三个氨基酸残基之间。
5. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的反应缓冲液含100-200 mM NaCl、10-50 mM Tris-HCl 8. 0、lmM DTT、2. 0-5. 0 mM MnCl2。
6. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的酶活性温度范围为 4-65 °C。
7. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述蛋白酶的最适酶活性温度范围为 35-40。。。
8. 根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于：所述的蛋白酶来源于耐辐射奇球菌。
【文档编号】C12N9/52GK104212783SQ201410272769
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】华跃进, 王云光, 王梁燕 申请人:浙江大学