专利名称：蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从蛋清蛋白酶解产物中分离纯化血管紧张素转化酶抑制肽及其
制备方法，特别涉及一种生物酶解方法制备得到一种新的血管紧张素转化酶抑制肽，属于 生物技术领域。
背景技术：
高血压病是一种常见的心血管疾病，它发病率高，常伴有心脏、血管、肺以及肾脏 等器官功能性或器质性改变，是引发心、脑、肾和眼血管等各种并发症和导致中风、促进动 脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。高血压病是中国目前首要的心血管疾病，我国约 有1.6亿高血压患者，高血压的治疗迫在眉睫。人工合成的降压药物具有明显的降压效果， 但是副作用较大，人们将目光转向了安全无副作用的源于食品的血管紧张素转化酶抑制肽 的研究。 食物来源的活性肽不仅能提供人体生长发育所需的营养，还可降低血压、抗凝血、 抗菌、免疫、抗氧化、降胆固醇，调节神经系统、降血脂、护肝等功能。血管紧张素转化酶抑制 肽是一类具有抑制ACE活性的物质，随着人们对食品安全问题的高度关注，食源性血管紧 张素转化酶抑制肽成为当前研究热点。 自1965年首次在南美茅头蝮蛇毒液中发现血管紧张素转化酶抑制肽以来，国内 外研究人员已从不同来源的蛋白质中制备出各种具有血管紧张素转化酶抑制活性的肽类 物质。蛋清中含有丰富的蛋白质资源，且与人体的蛋白模式相似，可以很好的被人体全面吸 收。但蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的研究报道较少，本发明以蛋清蛋白为原料开发 血管紧张素转化酶抑制肽。检索中国专利，未见相同相似记载。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制 备方法。 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于，氨基酸序列为RVPSL，本发明所 述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性，半抑制浓 度(IC5。)为0.020mM，形态为白色粉末状。 本发明所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽制备方法，包括酶解蛋清蛋白酶 解物制备、纯化、结构鉴定和化学合成，具体步骤如下
(1)酶解蛋清蛋白制备酶解物 取一定量蛋清蛋白质配制成浓度为5%的水溶液，置于恒温水浴锅中9(TC热变性 10min。冷却至酶解温度40 60°C ，用0. 5moL/L氢氧化钠溶液调解pH至8 11，加入占 蛋清蛋白质质量1% 5X的碱性蛋白酶Alcalase 2. 4L进行水解，水解过程中不断搅拌， 并不断加入适当浓度的氢氧化钠溶液以维持pH值在8 11范围内(±0. 05)，水解2 20 小时后经8(TC灭酶10min，离心1000 9000g 10min，喷雾干燥或冷冻干燥，保存备用；
(2)蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的纯化 酶解物配制成水溶液，经交联葡聚糖凝胶进行柱层析纯化，用蛋白核酸检测仪在 220nm处进行检测，根据色谱柱纯化得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测 定血管紧张素转化酶抑制活性； (3)蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定 分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶高抑制活性的组分，采用液相色谱_四极 杆线性离子阱串联质谱(4000QTRAP)测定其结构，液相色谱分离流动相为70%乙腈(A)和 含O. 1%甲酸水(B)，线性梯度洗脱A:10X 100% (0 10min)，检测波长220nm，质谱扫 描模式为EMS/ER/EPI/EPI，扫描范围为M/Z :275-1000。
(4)血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证 采用Fmoc固相合成法合成活性肽RVPSL，纯度达到95 % 。利用高效液相色谱纯化 合成肽，并通过DIONEX MSQ质谱测定其分子量，质谱参数为源ESI，锥孔电压+75v，上样量 5ul，扫描范围m/zl00-2000。 本发明所采用的血管紧张素转化酶抑制活性测定方法为高效液相色谱法，具体步 骤为 取30iiL马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10 y L抑制剂混合均匀，在 37°C 士0.5t:恒温水浴中预热3-5min，然后加人20iiL血管紧张素转化酶(ACE)液充分混 合，37。C保温30min后，再加入60iiL的lmoL/LHCl终止反应，得到反应液。同时用10 y L pH 为8. 3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液用0. 45 ii m滤膜过滤后直 接用HPLC系统进行分析。色谱条件柱温25°C ，流速0. 5mL/min，流动相乙腈/水(0. 05% TFA)比例为25/75等度洗脱，检测波长228nm.
ACE抑制活性计算公式如下
ACE抑制活性(% ) = 100(M-N)/M
式中M为空白对照组中马尿酸的峰面积。
N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。 本发明的优良效果在于将生物酶工程技术及蛋白质组技术应用于鸡蛋的深层次 开发利用。本发明以蛋清蛋白为酶解原料，酶解产物经柱层析纯化色谱质谱鉴定血管紧张 素转化酶抑制肽氨基酸序列为RVPSL， IC5。为0. 020mM。
图1是实施例1步骤(1)中蛋清蛋白质酶解产物经过交联葡聚糖凝胶S印hadex G-25柱层析的色谱图。 图2，图3分别是实施例1步骤(3)中交联葡聚糖凝胶S印hadex G_25柱层析分离 的高活性组分的一级质谱图和二级质谱图。 图4，图5分别是实施例1步骤(4)中固相合成法合成RVPSL的色谱图及质谱图。
具体实施例方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步阐述，但不限于此。
实施例1从蛋清蛋白酶解产物中纯化得到血管紧张素转化酶抑制肽RVPSL
(1)酶解蛋清蛋白制备酶解物 取一定量蛋清蛋白质配制成浓度为5%的水溶液，置于恒温水浴锅中9(TC热变性 10min。冷却至酶解温度4(TC，用0. 5moL/L氢氧化钠溶液调解pH至11，加入占蛋清蛋白质 质量5X的碱性蛋白酶Alcalase2. 4L进行水解，水解过程中不断搅拌，并不断加入适当浓 度的氢氧化钠溶液以维持pH值在11范围内(士0.05)，水解20小时后经8(TC灭酶10min， 离心1000g 10min，喷雾干燥，保存备用；
(2)蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的纯化 酶解物配制成水溶液，经交联葡聚糖凝胶进行柱层析纯化(1. 6*100cm)，去离子水 作为洗脱液，流速为60mL/min，用蛋白核酸检测仪，在220nm处进行检测，根据色谱柱纯化 得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测定血管紧张素转化酶抑制活性；
(3)蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定 分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶高抑制活性的组分，采用液相色谱_四极 杆线性离子阱串联质谱(4000Q TRAP)测定其结构，液相色谱分离流动相为70%乙腈(A)和 含O. 1%甲酸水(B)，线性梯度洗脱A:10X 100% (0 10min)，检测波长220nm，质谱扫 描模式为EMS/ER/EPI/EPI，扫描波长范围为275-1000amu。
(4)血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证 采用Fmoc固相合成法合成活性肽TPSPR，纯度达到95 % 。利用高效液相色谱纯化 合成肽，并通过DIONEX MSQ质谱测定其分子量，质谱参数为源ESI，锥孔电压+75v，上样量 5ul，扫描范围m/zl00-2000。 实施例2如实施例1所述，所不同的是蛋清蛋白制备酶解物的Alcalase 2. 4L用 量为蛋清蛋白的1X，酶解pH值为8，酶解时间为2h，灭酶后9000g离心10min，冷冻干燥，
保存备用。
权利要求
一种蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于，所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性，其氨基酸序列为RVPSL，为白色粉末状，半抑制浓度(IC50)为0.020mM。
2. 如权利要求1所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽，制备方法的具体步骤如下(1) 酶解蛋清蛋白制备酶解物取一定量蛋清蛋白质配制成一定浓度的水溶液，置于恒温水浴锅中9(TC热变性 10min。冷却至酶解温度40 60°C ，用0. 5moL/L氢氧化钠溶液调解pH至8 11，加入占 蛋清蛋白质质量1% 5%的碱性蛋白酶进行水解，水解过程中不断搅拌，并不断加入适当 浓度的氢氧化钠溶液以维持pH值在8 11范围内(士0.05)，水解2 20小时后经8(TC 灭酶10min，离心1000 9000g 10min，喷雾干燥或冷冻干燥，保存备用；(2) 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的纯化酶解物配制成水溶液，经交联葡聚糖凝胶进行柱层析纯化，用蛋白核酸检测仪，在 220nm处进行检测，根据色谱柱纯化得到的色谱峰分别收集，收集的洗脱液冻干称重后，测 定血管紧张素转化酶抑制活性；(3) 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶高抑制活性的组分，采用液相色谱_四极杆线 性离子阱串联质谱(4000Q TRAP)测定其结构，液相色谱分离流动相为70%乙腈(A)和含 0. 1%甲酸水(B)，线性梯度洗脱A:10X 100% (0 10min)，检测波长220nm，质谱扫描 模式为EMS/ER/EPI/EPI，扫描范围为M/Z 275-1000 ;(4) 血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证采用Fmoc固相合成法合成权利要求1中所述序列的血管紧张素转化酶抑制肽。禾U用 高效液相色谱纯化合成肽，并通过DIONEX MSQ质谱测定其分子量，质谱参数为源ESI，锥 孔电压+75v，上样量5uL，扫描范围m/z 100-2000。
3. 如权利要求2所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于， 步骤(2)中所采用的色谱层析填料为S印hadex G_25，流速为60mL/h。
4. 如权利要求2所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于， 步骤(4)中所述的血管紧张素转化酶抑制肽的合成采用FM0C固相合成法，纯度达到95X。
5. 如权利要求2所述的蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于， 步骤(2)中测定血管紧张素转化酶活性的方法为高效液相色谱法。
全文摘要
本发明提供了一种蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，属于生物技术领域。从蛋清蛋白酶解物中分离纯化出新的具有血管紧张素转化酶抑制作用的活性肽，序列为RVPSL。制备步骤包括酶解蛋清蛋白制备酶解物、蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的纯化、蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽的结构鉴定和血管紧张素转化酶抑制肽的合成及活性验证。本发明可用于制备降压药物和辅助降血压功能食品。
文档编号A61P9/00GK101696233SQ20091021778
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者于一丁, 于志鹏, 刘静波, 赵文竹 申请人:吉林大学;